專利名稱：長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于檢測技術領域，特別是涉及實驗長爪沙鼠的病毒質(zhì)量控制領域，尤其是涉及一種長爪沙鼠小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)抗體檢測試劑盒。
背景技術：
長爪沙鼠屬于嚙齒目—倉鼠種—沙鼠亞科—沙鼠屬，體形大小介于大鼠與小鼠之間。它從野生到馴養(yǎng)，再到實驗動物化乃至將其用作動物實驗迄今已有70余年歷史，日本、歐美學者對長爪沙鼠形態(tài)學、解剖學、生理學和繁殖方法及生物學特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠是研究脂類代謝的理想動物模型，同時也是研究絲蟲病、線蟲病等寄生蟲病、糖尿病、自發(fā)性癲癇等疾病的理想動物模型。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的飛速發(fā)展，長爪沙鼠被廣泛地用于藥理學、血清學和細菌學、內(nèi)分泌學、行為學等領域的研究，國外將長爪沙鼠看作一種正在被開發(fā)的“多能性”的實驗動物，進一步加快了它的應用研究步伐，拓寬了它的應用范圍。
1983年，朱智勇使用實驗長爪沙鼠在國內(nèi)外首次證明了實驗長爪沙鼠對流行性出血熱病毒(EHFV)敏感，是研究EHFV特性和研制流行性出血熱疫苗的首選實驗動物。近年來杭州天元藥業(yè)公司又用實驗長爪沙鼠研制出雙價苗，供應社會。衛(wèi)生部上海生物制品所亦用長爪沙鼠生產(chǎn)出血熱疫苗。迄今為止，作為實驗動物的長爪沙鼠質(zhì)量(微生物、寄生蟲、遺傳)的國際標準、國家標準及檢測方法均是空白，鑒于實驗長爪沙鼠的應用范圍日益擴大，對其質(zhì)量進行標準化控制的研究，制訂相應的規(guī)范，開發(fā)相應的檢測試劑盒就成為亟待解決的問題。
技術內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒。
本試劑盒內(nèi)裝有陽性血清1支，陰性血清1支，酶標二抗1支，底物1支，底物緩沖液1瓶，洗液1瓶，樣品稀釋液1瓶，終止液1支，封板膜2張及真空包裝的抗原包被板1塊。
盒內(nèi)的陽性血清為含0.05％的疊氮鈉和MHV(小鼠肝炎病毒)抗體的實驗長爪沙鼠血清(其OD值大于0.2)，陰性血清為含0.05％的疊氮鈉同時不含MHV(小鼠肝炎病毒)抗體的實驗長爪沙鼠血清(其OD值小于0.1)；盒內(nèi)的底物為OPD(鄰苯二胺)，底物緩沖液為含0.004％過氧化氫的磷酸鹽—檸檬酸緩沖液(pH5.0)，洗液為含0.05％Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，樣品稀釋液為含0.05％硫柳汞和10％小牛血清的洗液，終止液為2mol/L的硫酸。
所述酶標二抗是采用飽和硫酸銨法和Q sepharose high performance陰離子交換層析柱法純化的長爪沙鼠IgG，并以之為抗原對新西蘭白兔進行常規(guī)免疫，再分離血清純化后用雙向免疫瓊擴法和間接ELISA法進行效價測定，然后用過碘酸鈉法進行HRP(辣根過氧化物酶)標記，得到該酶標二抗。
所述的抗原包被板是使用四價抗原(包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM和A59)10μg/ml的細胞培養(yǎng)液包被ELISA96孔板。板內(nèi)A-H行1，3，5，7，9，11列為正?？乖珹-H行2，4，6，8，10，12列為特異抗原。
本發(fā)明中盒內(nèi)建立一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，提供檢測實驗長爪沙鼠血清中小鼠肝炎病毒抗體的方法及判斷標準，可檢測樣品48只。
本發(fā)明實施(使用)中按以下步驟進行(1)取出抗原包被板，室溫平衡10分鐘。
(2)加樣陰陽性血清對照各加入兩孔(一個正常抗原孔，一個特異抗原孔)，每孔兩滴；其余各孔各加100μl稀釋液，每份待檢血清加入相鄰的兩孔(一個為正?？乖?，一個為特異抗原孔)，各5.0μl。
(3)孵育用封板膜封板，震蕩混勻，置37℃孵育30分鐘。
(4)洗滌棄去孔內(nèi)液體，洗液注滿各孔，靜置1.5分鐘，甩干，重復3次后叩干。
(5)將酶標二抗溶于10ml稀釋液中，每孔100μl，用封板膜封板，置37℃孵育30分鐘。
(6)洗滌同(4)。
(7)顯色將酶底物溶于底物緩沖液中，每孔100μl，37℃避光放置10分鐘。
(8)終止每孔加終止液1滴。
(9)用酶標儀讀數(shù)在490nm讀取各孔OD值。
(10)結果判定A.目測法(A1)待檢血清與正常抗原反應孔和待檢血清與特異抗原反應孔均呈無色或極淺黃色，判為陰性。
(A2)待檢血清與正?？乖磻壮薀o色或極淺黃色，而待檢血清與特異抗原反應孔呈桔黃色，判為陽性。
B.比色法(B1)待檢血清與特異抗原反應孔的OD值/陰性血清與特異抗原反應孔的OD值≥2.1；(B2)待檢血清與特異抗原反應孔的OD值≥0.2；(B3)待檢血清與正?？乖磻缀痛龣z血清與特異抗原反應孔應有明顯的顏色區(qū)別。
本發(fā)明可用于抗原工作濃度測定，包被抗原濃度與抗原結合的最適濃度測定，抗體工作濃度測定，酶標二抗的制備及工作濃度確定，酶標二抗的穩(wěn)定劑及有效時間、各成份有效期測定，試劑盒敏感性與特異性的比較。
本發(fā)明還可用于實驗動物質(zhì)檢機構對于實驗長爪沙鼠的病毒質(zhì)量檢測及實驗長爪沙鼠繁育生產(chǎn)單位(企業(yè))對動物質(zhì)量跟蹤監(jiān)測。
本發(fā)明(試劑盒)具有攜帶方便，檢測迅速省時，檢測結果敏感可靠，操作規(guī)范標準等特點。配合高等級實驗長爪沙鼠病毒學質(zhì)量國家標準的制訂與實施，為其提供檢測手段與方法，具有重大而深遠的意義。
本發(fā)明在確定長爪沙鼠對小鼠肝炎病毒易感的基礎上，利用四價抗原(目前及以前國內(nèi)曾流行或正在流行的小鼠肝炎病毒的四個代表性毒株，包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM和A59)包被96孔酶標板，自行制備并純化了兔抗實驗長爪沙鼠IgG，進一步用HRP標記后滴定其工作濃度，結合其它試劑制成長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒。
具體實施例方式
試劑盒內(nèi)裝有陽性血清1支(200μl)，陰性血清1支(200μl)，酶標二抗1支(10μl)，底物1支(4mg)，底物緩沖液1瓶(10ml)，樣品稀釋液1瓶(20ml)，洗液1瓶(30ml 20倍濃縮液)，終止液1支(5ml)，封板膜2張及真空包裝的抗原包被板1塊?？乖话迨鞘褂盟膬r抗原10μg/ml的細胞培養(yǎng)液包被ELISA96孔板。
做13個樣品，來自兩個單位兩種微生物控制級別，10只(1-10)為A單位屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)的實驗長爪沙鼠，第11為B單位開放環(huán)境飼養(yǎng)的實驗長爪沙鼠，第12-13為B單位屏障環(huán)境飼養(yǎng)的實驗長爪沙鼠。
(1)取出抗原包被板，室溫平衡10分鐘，打開外包裝。
(2)加樣陰、陽性血清對照各加入兩孔(一個正?？乖?，一個特異抗原孔)，每孔兩滴(約100μl)；其余各孔各加100μl稀釋液，每份待檢血清加入相鄰的兩孔(一個為正常抗原孔，一個為特異抗原孔)，各5.0μl，同時設立稀釋液對照(除稀釋液外不加任何液體)。
(3)孵育用封板膜封板，震蕩混勻，置37℃孵育30分鐘。
(4)洗滌棄去孔內(nèi)液體，洗液注滿各孔，靜置1.5分鐘，甩干，重復3次后叩干。
(5)將酶標二抗溶于10ml稀釋液中，每孔100μl，用封板膜封板，置37℃孵育30分鐘。
(6)洗滌同(4)。
(7)顯色將底物溶于底物緩沖液中，每孔100μl，37℃避光放置10分鐘。
(8)終止每孔加終止液1滴。
(9)用酶標儀讀數(shù)取490nm，讀取各孔OD值。
加樣示意圖 上述樣品酶標儀測定結果 根據(jù)判斷標準判定A單位中1-10為小鼠肝炎病毒抗體陽性，B單位三個樣品均為小鼠肝炎病毒抗體陽性。
權利要求
1.長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)裝有陽性血清1支，陰性血清1支，酶標二抗1支，底物1支，底物緩沖液1瓶，洗液1瓶，樣品稀釋液1瓶，終止液1支，封板膜2張及真空包裝的抗原包被板1塊。
2.如權利要求1所述的長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性血清為含0.05％的疊氮鈉和MHV抗體的實驗長爪沙鼠血清，陰性血清為含0.05％的疊氮鈉同時不含MHV抗體的實驗長爪沙鼠血清；底物為鄰苯二胺，底物緩沖液為含0.004％過氧化氫的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，洗液為含0.05％Tween-20的磷酸鹽緩沖液，樣品稀釋液為含0.05％硫柳汞和10％小牛血清的洗液，終止液為2mol/L的硫酸。
3.如權利要求1所述的長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標二抗是采用飽和硫酸銨法和Q sepharose high perfor-mance陰離子交換層析柱法純化的沙鼠血清IgG，并以之為抗原對新西蘭白兔進行常規(guī)免疫，再分離血清純化后用雙向免疫瓊擴法和間接ELISA法進行效價測定，然后用過碘酸鈉法進行酶標，得到該酶標二抗。
4.如權利要求1所述的長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的抗原包被板是使用四價抗原10μg/ml的細胞培養(yǎng)液包被ELISA96孔板；板內(nèi)A-H行1，3，5，7，9，11列為正常抗原，A-H行2，4，6，8，10，12列為特異抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗體檢測試劑盒。本發(fā)明中的試劑盒內(nèi)裝有陽性血清1支，陰性血清1支，酶標二抗1支，底物1支，底物緩沖液1瓶，洗液1瓶，樣品稀釋液1瓶，終止液1支，封板膜2張及真空包裝的抗原包被板1塊。其中陽性血清為含0.05％的疊氮鈉和MHV抗體的實驗長爪沙鼠血清，陰性血清為含0.05％的疊氮鈉同時不含MHV抗體的實驗長爪沙鼠血清；抗原包被板是使用四價抗原的細胞培養(yǎng)液包被ELISA96孔板。本發(fā)明中盒內(nèi)建立一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，提供檢測實驗長爪沙鼠血清中小鼠肝炎病毒抗體的方法及判斷標準，可檢測樣品48只。
文檔編號G01N33/569GK1877334SQ20061005228
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月4日 優(yōu)先權日2006年7月4日
發(fā)明者吳舊生, 劉月環(huán) 申請人:浙江大學