鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測(cè)方法
【專利摘要】一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，由預(yù)混液1和預(yù)混液2構(gòu)成。該試劑盒鑒定鼠源性成分具有良好的特異性，靈敏度可達(dá)到1pg/反應(yīng)，可成功地對(duì)肉類及其產(chǎn)品中的鼠源性成分進(jìn)行鑒定，可用于食品安全檢測(cè)部門對(duì)肉類及其制品摻假的監(jiān)管與控制，具有顯著的實(shí)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測(cè)方法，尤其是一種特異性好，靈敏度高的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，不法商販利用廉價(jià)的肉類冒充高價(jià)牛、羊肉的肉類摻假事件頻發(fā)。更為嚴(yán)重的是，近期市面上出現(xiàn)了用來(lái)源不明的鼠肉冒充羊肉的惡性案例，引起社會(huì)各界廣泛關(guān)注。鼠肉摻假不僅影響了肉類產(chǎn)品市場(chǎng)的正常運(yùn)行，更造成了嚴(yán)重食品安全隱患。老鼠多生活于潮濕臟亂的環(huán)境中，攜帶多種細(xì)菌病毒。死鼠肉極易腐爛而滋生細(xì)菌，一些死鼠體內(nèi)還含有老鼠藥等強(qiáng)力毒藥成分。因此，一旦老鼠肉被混摻入食用肉類及肉制品，食用后會(huì)造成人體中毒，輕則惡心、嘔吐，重則可能導(dǎo)致死亡。
[0003]以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)已成為食品溯源，尤其是肉類種屬鑒別的核心技術(shù)。該技術(shù)針對(duì)不同物種基因序列的差異，設(shè)計(jì)特異性的引物，利用PCR擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，從而鑒別食品中的物種來(lái)源。實(shí)時(shí)熒光PCR的發(fā)展和應(yīng)用提高了食品溯源方法的靈敏度，并為肉類及肉制品定量定性分析提供技術(shù)支持。目前，基于線粒體基因設(shè)計(jì)特異性的引物而建立PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR的方法已見(jiàn)大量報(bào)道，市面上已有許多利用此類方法檢測(cè)肉及肉制品源性的試劑盒，在肉制品摻假控制與監(jiān)管中發(fā)揮了重要作用。
[0004]然而，此類試劑盒多用于對(duì)肉制品中牛、羊、豬及禽類等源性的檢測(cè)，而針對(duì)肉制品中鼠源性成分的檢測(cè)的試劑盒還未有所見(jiàn)。在國(guó)外，已有運(yùn)用普通PCR鑒別嚙齒目物種源性的研究，但經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，該研究中針對(duì)嚙齒目所設(shè)計(jì)的引物對(duì)豬、牛、羊等常見(jiàn)肉類均可以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，特異性差。在國(guó)內(nèi)，目前市面上出現(xiàn)了針對(duì)海貍鼠源性成分的鑒定試劑盒。該試劑盒采用普通PCR方法，操作步驟繁瑣，在靈敏度和特異性上都有一定的局限性。同時(shí)，在分類學(xué)上海貍鼠并不屬于鼠科，而在國(guó)內(nèi)某些地區(qū)，海貍鼠被視為可食用的肉類，因此使用海貍鼠摻假肉制品的危害性遠(yuǎn)小于本發(fā)明中調(diào)研選取的鼠科樣本。
[0005]為了彌補(bǔ)鼠源性成分鑒定試劑盒的市場(chǎng)空缺，豐富肉制品摻假檢測(cè)方法，我們開發(fā)了肉及肉制品中鼠源性成分檢測(cè)的高靈敏度試劑盒。本發(fā)明針對(duì)生活中常見(jiàn)的可能摻假肉制品的鼠類，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)鼠源性引物探針，具有良好的針對(duì)3種常見(jiàn)鼠肉的特異性，與其他肉類無(wú)交叉反應(yīng)，靈敏度高達(dá)I皮克/反應(yīng)，且總檢測(cè)時(shí)間可控制在2小時(shí)以內(nèi)，對(duì)肉制品摻假的監(jiān)管和控制有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了對(duì)肉制品摻假進(jìn)行監(jiān)管和控制，本發(fā)明提供了一種特異性好，靈敏度高的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒、制備方法及檢測(cè)方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供了一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成:預(yù)混液1，其包含Taqman熒光定量PCR反應(yīng)Taq酶1.25U, dNTP各0.2 μ M，ΡΗ8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM ;儲(chǔ)藏條件為 4 °C，保質(zhì)期半年。
[0008]預(yù)混液2，其包含引物 A 2 μ M,序列為 5’ -CCGCCCAATCACCCAAA-3’，引物 B 2 μ Μ,序列為 5’ -GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3’，序列熒光探針 C4 μ Μ,序列為 5’ -FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCMC-TAMRA-3’，熒光探針 D 4 μ Μ，序列為 5’ -CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3’，以及內(nèi)參核酸0.0OSng/yL;儲(chǔ)藏條件為-20 °C，避光，保質(zhì)期半年。
[0009]本發(fā)明還提供了一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
521、提取常見(jiàn)鼠肉DNA并制作模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；
522、鼠肉測(cè)序結(jié)果與其他肉類DNA的同源基因比對(duì)，篩選出鼠類特異序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和突光探針；
523、設(shè)計(jì)陽(yáng)性內(nèi)參，消除反應(yīng)體系中假陰性；
524、驗(yàn)證方法的特異性，優(yōu)化反應(yīng)條件，制作試劑盒；
S25:使用梯度稀釋的目標(biāo)物種DNA，確定反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度。
[0010]優(yōu)選地，步驟S21具體包括:反應(yīng)體系為25yL，其中包括12.5yL premix Taq(2X, Takara, version 2.0)，0.5 μ L 10 μ M Seq 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和ddH20 ;反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 3min ;30 個(gè)循環(huán)的 95°C 30s,50°C 30s,72°C Imin ;72°C延伸 7min。
[0011]優(yōu)選地，步驟S22具體包括:探針的3’端用發(fā)光基團(tuán)FAM標(biāo)記，5’端用淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記；在探針合成中等量分配兩種堿基C/T。
[0012]優(yōu)選地，步驟S23具體包括:陽(yáng)性內(nèi)參是由質(zhì)粒PUC57插入一段重組基因構(gòu)成；重組基因的序列為 5 ’ -CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3，。
[0013]優(yōu)選地，步驟S24具體包括:反應(yīng)體系為20 μ L，其中包括Taq酶1.25U，dNTP各0.2 μ M，PH8.5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM, 10 μ M 引物 A、B 各 0.4 μ L,0.8μ L 10 μ M 探針 C，0.8μ L 10 μ M 內(nèi)參探針 D, 0.2 μ L ROX dye II (Takara,version 2.0), IOOng模板DNA和ddH20 ;反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性IOmin ;30個(gè)循環(huán)的95°C5s,55°C 30s,60°C 20s。
[0014]本發(fā)明亦提供了一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
531:取肉或肉產(chǎn)品中提取的DNA IyL與17 μ L預(yù)混液1，2 μ L預(yù)混液2在冰上混合均勻；
532:將混合好的試劑至于熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)；
533:當(dāng)內(nèi)參CY5熒光信號(hào)在Ct值35左右發(fā)生擴(kuò)增，說(shuō)明PCR體系反應(yīng)良好。
`[0015]優(yōu)選地，步驟S32具體包括:反應(yīng)條件設(shè)為:95° C預(yù)變性10 min，40個(gè)循環(huán)的95° C 5s,55° C 30s，最后保存于 4° C。
[0016]本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)了食品中鼠源性成分鑒定的試劑盒。提取食品中的總DNA后，應(yīng)用試劑盒預(yù)混液中所包含的鼠源性成分特異引物及探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而獲得對(duì)鼠源性成分定性及定量的檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)驗(yàn)證，該試劑盒具有良好的針對(duì)3種常見(jiàn)鼠肉的特異性，與其他常見(jiàn)肉類之間無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)方法的靈敏度達(dá)到I皮克/反應(yīng)，且總檢測(cè)時(shí)間可控制在2小時(shí)以內(nèi)。本試劑盒是根據(jù)肉類摻假在我國(guó)新出現(xiàn)的實(shí)際情況，針對(duì)可能用于牛羊肉摻假的3種鼠科動(dòng)物設(shè)計(jì)熒光定量PCR方法，同時(shí)具備對(duì)3種目標(biāo)鼠肉的特異性，能夠成功鑒別檢測(cè)食品中鼠源性成分，是目前靈敏度最高、最快速的鼠源性成分鑒定方法，可用于食品中鼠源性成分摻假的檢測(cè)和監(jiān)管。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]通過(guò)下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行的描述，本發(fā)明的技術(shù)方案及其技術(shù)效果將變得更加清楚，且更加易于理解。其中:
圖1示出了本發(fā)明的第二實(shí)施例的鼠源性特異引物探針設(shè)計(jì)圖。堿基序列取自于線粒體細(xì)胞色素b基因。灰色部分依次分別代表鼠源性特異正向引物、熒光探針、反向引物結(jié)合序列的位置。圖中黑點(diǎn)表示相同的堿基，黑色方框表示不同的堿基。
[0018]圖2示出了本發(fā)明的第二實(shí)施例的陽(yáng)性內(nèi)參結(jié)構(gòu)圖。陽(yáng)性內(nèi)參由質(zhì)粒pUC57插入一段重組基因構(gòu)成。重組基因兩端是鼠源性正向、反向引物的結(jié)合序列，兩者之間是一段133bp的隨機(jī)序列。RS:隨機(jī)序列。
[0019]圖3示出了本發(fā)明的第二實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線。以豬、牛、羊肩、鴨、實(shí)驗(yàn)大鼠(實(shí)驗(yàn)用ICR大白鼠)、實(shí)驗(yàn)小鼠(實(shí)驗(yàn)用昆明種小鼠)、野生小鼠(中國(guó)家鼠)的DNA做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系中包含陽(yáng)性內(nèi)參，內(nèi)參的CY5熒光信號(hào)在Ct值35-40之間發(fā)生擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)大鼠、實(shí)驗(yàn)小鼠、野生小鼠在35個(gè)反應(yīng)循環(huán)內(nèi)均產(chǎn)生了顯著的擴(kuò)增曲線，而其他肉類DNA則沒(méi)有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下將結(jié)合所附的附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行描述。
[0021]第一實(shí)施例
一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，該基于熒光定量PCR技術(shù)鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成:
預(yù)混液1，其包含Taqman熒光定量PCR反應(yīng)Taq酶1.25U, dNTP各0.2 ii M，PH8.5的Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM。儲(chǔ)藏條件為 4 °C，保質(zhì)期半年。
[0022]預(yù)混液2，其包含引物 A 2 ii M,序列為 5’ -CCGCCCAATCACCCAAA-3’，引物 B 2 u M,序列為 5’ -GCCTCCGAITCATGTTAAGA-3’，序列熒光探針 C4 u M,序列為 5’ -FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCMC-TAMRA-3’，熒光探針 D 4 y M，序列為 5’ -CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3’，以及內(nèi)參核酸0.005ng/iiL。儲(chǔ)藏條件為-20 °C，避光，保質(zhì)期半年。
[0023]第二實(shí)施例
一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
S21、提取常見(jiàn)鼠肉DNA并制作模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
[0024]步驟S21具體包括:從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大鼠、小鼠的線粒體細(xì)胞色素B基因(CYTB)，使用 DNAMAN (LynnonBiosoft, version 8.0)比對(duì)，從而設(shè)計(jì)鼠類 CYTB 通用引物Seq0收集日常生活中常見(jiàn)的鼠肉，提取其DNA。采用CYTB通用引物Seq對(duì)所提取的鼠肉DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μ L，其中包括12.5μ L premix Taq (2X, Takara,version 2.0)，0.5 μ L 10 μ M Seq 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和 ddH20。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 3min ;30 個(gè)循環(huán)的 95°C 30s,50°C 30s,72°C Imin ；72°C 延伸 7min。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用切膠回收試劑盒提取并純化，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從而獲得常見(jiàn)鼠類的線粒體CYTB基因的準(zhǔn)確序列。
[0025]S22、鼠肉測(cè)序結(jié)果與其他肉類DNA的同源基因比對(duì)，篩選出鼠類特異序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和熒光探針。
[0026]步驟S22具體包括:下載其他肉類(豬、牛、羊、雞、鴨等)CYTB基因，應(yīng)用DNAMAN序列比對(duì)軟件，和測(cè)序得到的常見(jiàn)鼠CYTB基因進(jìn)行比對(duì)，選取出鼠類特有序列，依據(jù)此設(shè)計(jì)鼠類特異的引物和熒光探針。設(shè)計(jì)時(shí)，引物的近3’端堿基和探針5’端至中間堿基是影響特異性的關(guān)鍵堿基，應(yīng)保證關(guān)鍵堿基的在不同物種間的差異性。探針的3’端用發(fā)光基團(tuán)FAM標(biāo)記，5’端用淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記。在搜集到的幾種常見(jiàn)鼠類中，一種野生小鼠的探針結(jié)合區(qū)域包含一個(gè)不同于其他鼠類的堿基，因此在探針合成中等量分配這兩種堿基C/T (Y表示此簡(jiǎn)并堿基)，使得探針能夠適用于三種老鼠。引物探針設(shè)計(jì)圖參見(jiàn)圖1，序列如下:
表1鼠源性成分鑒定試劑盒所用引物、探針序列
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒，其特征在于，由以下試劑構(gòu)成: 預(yù)混液I，其包含Taqman熒光定量PCR反應(yīng)Taq酶1.25U, dNTP各0.2 ii M，PH8.5的Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM ;儲(chǔ)藏條件為 4 °C，保質(zhì)期半年； 預(yù)混液2，其包含引物A 2 PM,序列為5’ -CCGCCCAATCACCCAAA-3’，引物B 2 u M,序列為 5’ -GCCTCCGAITCATGTTAAGA-3’，序列熒光探針 C4 u M,序列為 5’ -FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3’，熒光探針 D 4 y M，序列為 5’ -CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3’，以及內(nèi)參核酸0.005ng/iiL;儲(chǔ)藏條件為-20 °C，避光，保質(zhì)期半年。
2.一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 521、提取常見(jiàn)鼠肉DNA并制作模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序； 522、鼠肉測(cè)序結(jié)果與其他肉類DNA的同源基因比對(duì)，篩選出鼠類特異序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和突光探針； 523、設(shè)計(jì)陽(yáng)性內(nèi)參，消除反應(yīng)體系中假陰性； 524、驗(yàn)證方法的特異性，優(yōu)化反應(yīng)條件，制作試劑盒； S25:使用梯度稀釋的目標(biāo)物種DNA，確定反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度。
3.如權(quán)利要求2所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于， 步驟S21具體包括:反應(yīng)體系為25 u L，其中包括12.5u L premix Taq (2X, Takara,version 2.0)，0.5 u L IOuM Seq 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和 ddH20 ;反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 3min ;30 個(gè)循環(huán)的 95°C 30s,50°C 30s,72°C Imin ；72°C 延伸 7min。
4.如權(quán)利要求2所述的鑒定食`品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于， 步驟S22具體包括:探針的3’端用發(fā)光基團(tuán)FAM標(biāo)記，5’端用淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記；在探針合成中等量分配兩種堿基C/T。
5.如權(quán)利要求2所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于， 步驟S23具體包括:陽(yáng)性內(nèi)參是由質(zhì)粒PUC57插入一段重組基因構(gòu)成；重組基因的序列為 5 ’ -CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3，。
6.如權(quán)利要求2所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的制備方法，其特征在于， 步驟S24具體包括:反應(yīng)體系為20ii L，其中包括Taq酶1.25U，dNTP各0.2yM，PH8.5的 Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5 mM, 10 y M 引物 A、B 各 0.4 y L, 0.8 u L IOuM探針 C，0.8u L IOuM 內(nèi)參探針 D, 0.2u L ROX dye II (Takara, version 2.0), IOOng模板DNA和ddH20 ;反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性IOmin ；30個(gè)循環(huán)的95°C 5s,55°C 30s,60°C20so
7.一種鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 531:取肉或肉產(chǎn)品中提取的DNA IuL與17 ii L預(yù)混液1，2 y L預(yù)混液2在冰上混合均勻； 532:將混合好的試劑至于熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)； 533:當(dāng)內(nèi)參CY5熒光信號(hào)在Ct值35左右發(fā)生擴(kuò)增，說(shuō)明PCR體系反應(yīng)良好。
8.如權(quán)利要求7所述的鑒定食品中鼠源性成分的試劑盒的的檢測(cè)方法，其特征在于， 步驟S32具體包括:反應(yīng)條件設(shè)為:95° C預(yù)變性10 min, 40個(gè)循環(huán)的95° C 5s、55° C 30s，最后保存于4° C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103642917SQ201310647179
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】方昕, 張馳, 許磊, 高翔, 李曉麗, 李寧, 方翔, 崔永剛 申請(qǐng)人:南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院