本發(fā)明涉及細(xì)胞凍存液技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的高效復(fù)蘇方法。

背景技術(shù)：

免疫細(xì)胞(immune cell)是白細(xì)胞的俗稱(chēng)，包括淋巴細(xì)胞和各種吞噬細(xì)胞等，也特指能識(shí)別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞等。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本成分，在體內(nèi)分布很廣泛，主要是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞受抗原刺激而被活化(activation)，分裂、增殖、發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞是一個(gè)多功能的細(xì)胞群。除T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞外，還有一種淋巴細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)。除淋巴細(xì)胞外，參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞還有漿細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞及單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞。

外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMNC)，即外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和其它少量細(xì)胞(造血干細(xì)胞等)。PBMNC是將白細(xì)胞進(jìn)一步提取的、具有分化為更強(qiáng)大效應(yīng)細(xì)胞的一部分。通過(guò)特定因子的誘導(dǎo)，PBMNC在體外可以分化為多種免疫細(xì)胞，如現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于生物治療的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer，CIK)，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)和自然殺傷細(xì)胞(NK)等細(xì)胞。

惡性腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，每年全球癌癥新發(fā)病例1000多萬(wàn)，死亡700多萬(wàn)，占總死亡人數(shù)的12％。我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率亦是逐年上升，病死率居高不下，因此尋找一種能夠有效治療癌癥、改善患者生活質(zhì)量的治療方法迫在眉睫。

腫瘤免疫治療是一種新興的腫瘤治療模式，是依靠自身免疫抗癌的新型治療方法。免疫系統(tǒng)是人體的防御體系，一方面發(fā)揮著清除細(xì)菌、病毒、外來(lái)異物的功能，另一方面消除體內(nèi)衰老細(xì)胞以及發(fā)生突變的細(xì)胞。機(jī)體免疫系統(tǒng)和癌細(xì)胞相互作用的結(jié)果決定了癌癥的最終演變。對(duì)于健康的人來(lái)說(shuō)，其免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大足以及時(shí)清除突變的癌細(xì)胞。但對(duì)于腫瘤病人來(lái)說(shuō)，普遍存在免疫系統(tǒng)低下，不能有效地識(shí)別、殺滅癌癥細(xì)胞；另一方面，癌癥細(xì)胞大量增殖，會(huì)進(jìn)一步抑制患者的免疫功能，而且，癌癥細(xì)胞有多種機(jī)制來(lái)逃脫免疫細(xì)胞的識(shí)別與殺傷。

腫瘤的免疫治療就是借助分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)，提高腫瘤組織的免疫原性，給機(jī)體補(bǔ)充足夠數(shù)量的功能正常的免疫細(xì)胞和相關(guān)分子，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗瘤免疫應(yīng)答，提高腫瘤組織對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)的敏感性，在體內(nèi)、外誘導(dǎo)腫瘤特異性和非特異性效應(yīng)細(xì)胞和分子，達(dá)到最終清除腫瘤的目的。腫瘤免疫治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種腫瘤治療方法。早在1985年，美國(guó)國(guó)家癌癥中心就把腫瘤免疫治療列為腫瘤綜合治療的第四大治療模式。

2009年，我國(guó)衛(wèi)生部正式將“自體免疫細(xì)胞治療”納入“第三類(lèi)醫(yī)療技術(shù)”目錄。

從1982年美國(guó)國(guó)立癌癥研究院Steve Rosenberg團(tuán)隊(duì)采用過(guò)繼性免疫淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞治療(LAK)，到1991年自斯坦福大學(xué)發(fā)展出目前在我國(guó)腫瘤免疫治療中廣泛應(yīng)用的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療(CIK)，有關(guān)腫瘤的免疫細(xì)胞治療的臨床探索經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的過(guò)程。然而這些傳統(tǒng)的療法對(duì)卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等大多數(shù)腫瘤的治療均未取得令人滿(mǎn)意的療效。其缺點(diǎn)是治療的靶向性不夠，療效有待提高。隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)作為腫瘤治療手段受到了越來(lái)越多的關(guān)注并被寄予厚望。DC是1973年Steinman和Cohn在小鼠脾臟發(fā)現(xiàn)的具有樹(shù)枝狀突起的獨(dú)特形態(tài)細(xì)胞，并將之命名為樹(shù)突狀細(xì)胞。DC是連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁，是人體內(nèi)最活躍、功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，具有抗原提呈和激活初始型T細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原致敏DC再回輸機(jī)體能刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，因此負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗被認(rèn)為是最具潛能的一種腫瘤免疫治療手段。特別是2010年4月美國(guó)FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)自體細(xì)胞免疫治療藥物Sipuleucel-T，才出現(xiàn)了治療性腫瘤疫苗的重大突破，此疫苗的批準(zhǔn)極大地激勵(lì)了DC疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

目前，國(guó)內(nèi)免疫學(xué)細(xì)胞治療大多用患者患病后提取的免疫細(xì)胞，患者患病后的免疫細(xì)胞活性和擴(kuò)增能力肯定比健康時(shí)的要差，治療效果勢(shì)必受到影響；健康人的免疫力逐年遞減，因此，儲(chǔ)存免疫細(xì)胞及保證免疫細(xì)胞復(fù)蘇之后細(xì)胞活性、細(xì)胞生物功能尤為重要。

細(xì)胞凍存是細(xì)胞長(zhǎng)期保存的主要方法之一。針對(duì)目前的健康人群提供了一項(xiàng)“免疫細(xì)胞生命銀行”的保障，以及未來(lái)腫瘤免疫治療過(guò)程中，有效錯(cuò)開(kāi)放化療療程進(jìn)行免疫細(xì)胞收集、儲(chǔ)存、復(fù)蘇與培養(yǎng)。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。

免疫細(xì)胞的復(fù)蘇，直接影響后期免疫細(xì)胞的活率及生物活性。為了解決現(xiàn)有凍存復(fù)蘇過(guò)程中水浴鍋使用、PBMNC復(fù)蘇后活率較低、復(fù)蘇后細(xì)胞擴(kuò)增能力不足、生物學(xué)功能(如有效殺傷細(xì)胞群體數(shù)目偏低、體外殺傷效力較低)不佳等技術(shù)問(wèn)題特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明首先提供一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇溶液，其組分包括AIM-V培養(yǎng)基、血清、Nuclease ultrapure，所述復(fù)蘇溶液中血清的體積分?jǐn)?shù)為5-20％，Nuclease ultrapure的含量為0.1-1U/mL；余量為AIM-V培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述復(fù)蘇溶液中血清的體積分?jǐn)?shù)為10％，和/或，所述復(fù)蘇溶液中Nuclease ultrapure的含量為0.2U/mL。

所述AIM-V培養(yǎng)基、Nuclease ultrapure均為商品化產(chǎn)品，分別由GIBCO公司、Sigma公司提供。

所述血清優(yōu)選為自體血清、胎牛血清、AB血清、血清替代物等中的一種，優(yōu)選為自體血清。

當(dāng)選擇自體血清時(shí)，該自體血清可在分離PBMNC過(guò)程中制備。通常當(dāng)制備凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞時(shí)該自體血清作為廢棄物處理。本發(fā)明將該自體血清作為上述復(fù)蘇溶液的有效組分，既廢物利用降低了成本，又減少了環(huán)境污染。因而，本發(fā)明采用自體血清具備實(shí)用性。

采用自體血清的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是：避免使用外源動(dòng)物源性血清，減少后續(xù)治療中潛在的過(guò)敏原的存在風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明還包括上述復(fù)蘇溶液在凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：

1)將凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80℃的凍存盒中，平衡0.5-5min后，再轉(zhuǎn)入金屬浴中融化細(xì)胞，所述金屬浴溫度為37-42℃；

2)將融化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上述復(fù)蘇溶液中洗滌至少2次，離心收集細(xì)胞。

上述復(fù)蘇方法還包括將離心收集所得細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞活率、細(xì)胞表型(可用FACS流式檢測(cè)儀)，檢測(cè)細(xì)胞增殖倍數(shù)(將細(xì)胞重懸于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％-10％自體血清的培養(yǎng)體系中培養(yǎng))等常規(guī)操作步驟。

本發(fā)明所述凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞可按現(xiàn)有常規(guī)方法制備，本發(fā)明不做特別限定。

具體地，本發(fā)明還提供上述凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

1)對(duì)獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，純化；所述外周血單個(gè)核細(xì)胞可采集自成人外周靜脈血；

2)用凍存液重懸外周血單個(gè)核細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液，使細(xì)胞含量達(dá)到2～3×10⁷個(gè)/mL；

3)將步驟2)所得細(xì)胞懸液分裝；例如分裝至1.8mL凍存管中，每管裝量1mL；

4)將分裝后的細(xì)胞懸液留樣待檢，將分裝后的其余細(xì)胞懸液(細(xì)胞凍存管)放入4℃預(yù)溫的程序降溫盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱暫時(shí)儲(chǔ)存；

5)待留樣的細(xì)胞懸液檢測(cè)合格后，將步驟4)暫時(shí)儲(chǔ)存的細(xì)胞懸液(細(xì)胞凍存管)凍存入庫(kù)，長(zhǎng)期保存。

所述細(xì)胞懸液的檢測(cè)指標(biāo)包括細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體等。

在凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇時(shí)，若使用傳統(tǒng)水浴方法會(huì)有污染風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明采用金屬浴，并嚴(yán)格控制金屬浴溫度和時(shí)間，既可以極大的降低污染風(fēng)險(xiǎn)，又因金屬微珠的良好的導(dǎo)溫效果，可加快凍存物品的快速平衡與升溫，提高復(fù)蘇效率。

在凍存的外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇過(guò)程中，伴隨細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞內(nèi)各種酶開(kāi)始行使功能。本發(fā)明應(yīng)用Nuclease ultrapure可以消化、抑制消減復(fù)蘇過(guò)程中恢復(fù)的各類(lèi)DNA酶，保持細(xì)胞的原始性質(zhì)，便于后期PBMNC應(yīng)用于免疫細(xì)胞培養(yǎng)的定向分化。

采用本發(fā)明復(fù)蘇溶液細(xì)胞復(fù)蘇存活率高達(dá)90％以上。采用本發(fā)明方法凍存超過(guò)2000萬(wàn)個(gè)種類(lèi)完整的免疫細(xì)胞，包含樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞及T細(xì)胞等，可有效應(yīng)用于多種免疫細(xì)胞療法并可供多次治療使用。儲(chǔ)存及后期復(fù)蘇培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有任何動(dòng)物源血清或蛋白的添加，保障了臨床應(yīng)用的安全性及穩(wěn)定性，大大降低應(yīng)用后的副反應(yīng)發(fā)生情況。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)驗(yàn)例成人PBMNC提取效率圖；

圖2實(shí)驗(yàn)例成人PBMNC復(fù)蘇活率圖；

圖3為實(shí)驗(yàn)例CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)擴(kuò)增倍數(shù)圖；

圖4為實(shí)驗(yàn)例CIK細(xì)胞體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)買(mǎi)得到的常規(guī)產(chǎn)品。

以下所述AIM-V培養(yǎng)基、Nuclease ultrapure均為商品化產(chǎn)品，分別由GIBCO公司、Sigma公司提供。以下實(shí)施例1-3所述自體血清由實(shí)驗(yàn)例所述方法制備。

實(shí)施例1

一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇溶液，其組分包括AIM-V培養(yǎng)基、自體血清、Nuclease ultrapure，所述復(fù)蘇溶液中血清的體積分?jǐn)?shù)為10％，Nuclease ultrapure的含量為0.2U/mL；余量為AIM-V培養(yǎng)基。

實(shí)施例2

一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇溶液，其組分包括AIM-V培養(yǎng)基、自體血清、Nuclease ultrapure，所述復(fù)蘇溶液中血清的體積分?jǐn)?shù)為5％，Nuclease ultrapure的含量為0.1U/mL；余量為AIM-V培養(yǎng)基。

實(shí)施例3

一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇溶液，其組分包括AIM-V培養(yǎng)基、自體血清、Nuclease ultrapure，所述復(fù)蘇溶液中血清的體積分?jǐn)?shù)為20％，Nuclease ultrapure的含量為1U/mL；余量為AIM-V培養(yǎng)基。

實(shí)施例1-3所述復(fù)蘇溶液的制備方法包括將各組分按配比混勻即可。

實(shí)施例4

一種凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：

一、對(duì)采集到的成人外周靜脈血進(jìn)行分離純化，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞；同時(shí)收集血清，即自體血清；

二、對(duì)得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，純化；

三、用凍存液重懸外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋?zhuān)辜?xì)胞懸液中細(xì)胞含量達(dá)到2～3×10⁷個(gè)/mL；

四、將稀釋后的細(xì)胞懸液分裝至1.8mL凍存管中，每管添加1mL，并留樣待檢，將細(xì)胞凍存管放入4℃預(yù)溫的程序降溫盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱暫時(shí)儲(chǔ)存；

五、預(yù)留的凍存細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體等指標(biāo)的檢測(cè)，指標(biāo)檢測(cè)合格后，凍存入庫(kù)做長(zhǎng)期保存；

六、復(fù)蘇時(shí)，將從凍存入庫(kù)中取出的細(xì)胞轉(zhuǎn)入預(yù)溫至-80℃的凍存盒內(nèi)后，平衡5min轉(zhuǎn)入37℃金屬浴融化；

七、將融化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至實(shí)施例1制備的復(fù)蘇溶液中洗滌，檢測(cè)細(xì)胞活率，之后將細(xì)胞重懸于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％自體血清的AIM-V培養(yǎng)體系中接種培養(yǎng)，即完成所述的長(zhǎng)期儲(chǔ)存成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇。

實(shí)施例5

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟一中獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞之后留存的血清，56℃金屬浴滅活30分鐘，離心收集血漿上清液，每10mL分裝一支，-80℃保存，備用；

實(shí)施例6

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟二中對(duì)得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，純化的具體操作如下：用AIM-V溶液洗滌單個(gè)核細(xì)胞兩次，收集最后一次洗滌的上清液，并進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)，檢測(cè)合格后，離心收集的細(xì)胞待用。其它與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例7

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟三中的凍存液配制如下：按細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基AIM-V、人自體血清和DMSO(二甲基亞砜)的體積比為8:1:1的比例混合而成。其它與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例8

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：凍存液中的人自體血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)至少為10％。其它與具體實(shí)施例4相同。

實(shí)施例9

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟五中指標(biāo)檢測(cè)合格是指：細(xì)菌、真菌、支原體檢測(cè)皆為陰性，內(nèi)毒素含量不高于0.25EU/mL。其它與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例10

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：該方法所用試劑為藥用或GMP級(jí)別。其它與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例11

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟七中無(wú)血清培養(yǎng)體系中含有單克隆抗體和細(xì)胞因子；其中，單克隆抗體的在無(wú)血清培養(yǎng)體系中的濃度為500ng/mL。其它與實(shí)施例4相同。

實(shí)施例12

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟七中無(wú)血清培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子濃度：400-1000IU/mlGM-CSF、100～4000IU/mlIL-2、800-1000IU/mlIL-4、0.2～2ng/mlIL-12、500～2000IU/mlIFN-γ、100～1000ng/ml anti-CD3-McAb中的一種或多種任意比混合。其它與實(shí)施例11相同。

實(shí)施例13

本實(shí)施例與實(shí)施例4不同的是：步驟七中無(wú)血清培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子濃度：100～1000ng/ml anti-CD3-McAb、500～2000IU/mlIFN-γ、0.5～4ng/mlIL-1α、1000～4000IU/mlIL-2和按任意比混合。其它與實(shí)施例4相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施例的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施例的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過(guò)以下例實(shí)驗(yàn)例驗(yàn)證本發(fā)明的效果：

1.PBMNC提取與自體血清獲?。?/p>

自體血清獲?。?/p>

1.1將成人外周靜脈全血轉(zhuǎn)移至50ml離心管，每管25ml。

1.2室溫1800rpm，離心8分鐘。

1.3取上層血漿至50ml離心管，滅活(56℃金屬浴30min)。

1.4 4℃放置30min。

1.5 2800rpm離心8min，收集上清即血清，分裝于3支15ml離心管中，一支4℃保存待用，兩支-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取PBMNC，即采用淋巴細(xì)胞分離液分離血細(xì)胞中的單個(gè)核細(xì)胞，并收集單個(gè)核細(xì)胞，包括以下步驟：

1.6按生理鹽水：血細(xì)胞＝1.5:1對(duì)已提取血漿的樣本進(jìn)行稀釋?zhuān)靹颉?/p>

1.7將稀釋樣本緩慢加在Ficoll(淋巴細(xì)胞分離液)液面上(方法：將離心管傾斜45°，在Ficoll液面上1cm處，緩慢注入稀釋的血細(xì)胞，不要打亂液面界面)，加入后終體積不超過(guò)45ml，室溫2000rpm，20min。1.8用巴氏滴管緩慢提取Ficoll層與血漿層交界處白膜層細(xì)胞，按照二個(gè)離心管對(duì)應(yīng)一個(gè)離心管進(jìn)行漂洗的原則，將提取的白膜層細(xì)胞裝入50ml離心管中。補(bǔ)充生理鹽水至45ml，混勻，1600rpm，5min。

1.9棄上清，用生理鹽水重懸，收集于一個(gè)50ml離心管中，補(bǔ)充生理鹽水至45ml。1200rpm，10min。

1.10棄上清，再次添加生理鹽水重懸至45mL，混勻，取0.5ml中層懸液至1.5mlEP管中計(jì)數(shù)，1000rpm，10min，即得PBMNC。

1.11計(jì)算PBMNC提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖1(成人PBMNC提取效率圖)。

2.PBMNC凍存：

2.1細(xì)胞凍存液配方：按照細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基AIM-V培養(yǎng)基、人自體血清和DMSO(二甲基亞砜)體積比8:1:1的比例混合而成；

2.2凍存步驟：用配置好的細(xì)胞凍存液將收集的PBMNC混合均勻，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2～3×10⁷個(gè)/ml；

將細(xì)胞懸液分裝到1.8ml凍存管中，并抽樣進(jìn)行病毒、細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)，將細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒，-80℃暫時(shí)保存。待所有監(jiān)測(cè)結(jié)果合格后，將細(xì)胞入庫(kù)，封存在液氮中做長(zhǎng)期保存。

3.PBMNC復(fù)蘇：

3.1將液氮中取出的凍存管轉(zhuǎn)入預(yù)溫至-80℃的凍存盒內(nèi)后，平衡5min后，快速轉(zhuǎn)移至37℃-42℃金屬浴鍋中融化細(xì)胞；

3.2將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，并添加實(shí)施例1制備的復(fù)蘇溶液，離心收集細(xì)胞，共進(jìn)行兩次清洗；

3.3復(fù)蘇之后的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖2(成人PBMNC復(fù)蘇活率圖)；

4.PBMNC復(fù)蘇之后生物功能檢測(cè)：包括培養(yǎng)為CIK細(xì)胞，檢測(cè)擴(kuò)增倍數(shù)，CIK培養(yǎng)之后流式檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞表面marker表達(dá)、體外殺傷活性的檢測(cè)。

4.1CIK培養(yǎng)：用CIK培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并吹打均勻，使細(xì)胞充分分散開(kāi)，接種于培養(yǎng)瓶中，并添加人自體血漿上清，使血漿濃度達(dá)到5％，并添加干擾素γ，使其終濃度為4000IU/ml；

CIK培養(yǎng)基成分：AIM-V培養(yǎng)基、“5％-10％自體血清”、400-1000IU/mL GM-CSF、100～4000IU/mL IL-2、800-1000IU/mL IL-4、0.2～2ng/mL IL-12、500～2000IU/mL IFN-γ、100～1000ng/mL anti-CD3-McAb。

接種24小時(shí)后，添加抗CD3抗體，使其終濃度為5μg/ml，添加白介素2，使其終濃度為2000IU/ml；

根據(jù)培養(yǎng)情況隨時(shí)添加培養(yǎng)基(白介素2，1000IU/ml，自體血漿1％)；

培養(yǎng)14天后收獲細(xì)胞分別進(jìn)行流式、細(xì)菌、真菌、革蘭氏、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)。

CIK擴(kuò)增倍數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖3(CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)擴(kuò)增倍數(shù)圖)；

CIK流式檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)表1；

表1成人PBMNC復(fù)蘇CIK培養(yǎng)流式檢測(cè)結(jié)果

4.2CIK細(xì)胞體外殺傷效力檢測(cè)(MTT法檢測(cè)體外殺瘤實(shí)驗(yàn))：

體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞為HepG2。HepG2的培養(yǎng)條件為10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，5％CO2。從本實(shí)驗(yàn)例“2.PBMNC凍存”中凍存的四個(gè)批次的樣本中隨機(jī)選取10組細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)例“3.PBMNC復(fù)蘇”、“4.1CIK培養(yǎng)”所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行復(fù)蘇和CIK的誘導(dǎo)培養(yǎng)，組別分別標(biāo)記為1-10。將HepG2接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞5×10³個(gè)。待HepG2完全貼壁后，取培養(yǎng)成熟的CIK，并離心獲得細(xì)胞，采用10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁴(效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞為20：1)個(gè)/ml，每個(gè)組別選擇5個(gè)孔，并做好標(biāo)注，棄掉其中的培養(yǎng)基，添加重懸好的CIK細(xì)胞懸液，每孔添加200μl。并在6h采用MTT測(cè)其吸光值(OD570nm)，并按照下述公式計(jì)算其殺瘤性：

殺傷率＝[(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白組OD值]×100％。

體外殺瘤性結(jié)果見(jiàn)圖4(CIK細(xì)胞體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)圖)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。