本發(fā)明涉及脂肪干細胞分離培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種脂肪干細胞分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

干細胞儲存業(yè)務(wù)從單純的臍帶血儲存發(fā)展到現(xiàn)今的臍帶、胎盤、牙齒等多種來源的干細胞儲存，其重要性和必要性已經(jīng)為越來越多的人所認可。對于臨床研究來說，干細胞應(yīng)用于臨床實踐目前主要是從骨髓系統(tǒng)中分離純化造血干細胞，但骨髓干細胞在獲取過程中，骨穿異常疼痛，并且獲取細胞數(shù)量少。而脂肪干細胞具有來源廣泛，易獲得，患者痛苦小，細胞量充足等優(yōu)點，但是目前對于脂肪干細胞的培養(yǎng)，卻缺乏一套完整的體系，脂肪干細胞的培養(yǎng)效果并不理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述不足，本發(fā)明提供一種脂肪干細胞分離培養(yǎng)方法，通過建立一套完整的脂肪干細胞分離培養(yǎng)體系，提高脂肪干細胞的培養(yǎng)效率，其技術(shù)方案如下：

S1，洗滌脂肪組織，除去血細胞，向T175培養(yǎng)瓶中加入50ml脂肪組織、100ml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動3min以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3～5min，使不同相分離，吸去下層水相，重復S1步驟三次，直到下層液較為清澈；

S2，I型膠原酶消化，加入0.1％預熱的I型膠原酶溶液，封口，劇烈晃動T175培養(yǎng)瓶5～10s，置于振動氣浴鍋中，37℃，70rpm，消化60min，每隔15min劇烈晃動培養(yǎng)瓶5～10秒，直到脂肪組織看起來較為平滑；

S3，分離脂肪基質(zhì)血管組分，將消化后的脂肪組織用無菌40目濾網(wǎng)分裝到50ml的離心管中，室溫下400g離心10min，得到的沉淀即為脂肪基質(zhì)血管組分；

S4，凈化沉淀，離心后，脂肪基質(zhì)血管組分沉積于離心管底部，用移液管自上而下除去上層油脂和下層的膠原酶溶液，再加入適量生理鹽水重懸細胞，吹散，室溫400g離心10min，離心完畢，再次吸取上層清液，最后加入10ml培養(yǎng)基懸浮細胞，將細胞匯總到50ml離心管中，過100目篩，再次在室溫下，300g離心10min；

S5，細胞種植，離心后加20ml培養(yǎng)基充分混勻，按照每平方厘米接種0.16ml抽脂得到的脂肪量進行接種，即每個T75培養(yǎng)瓶中接種12ml抽脂脂肪量，每100ml脂肪組織，最終可以接種8個T75培養(yǎng)瓶，進行未處理脂肪量和最終得到的細胞懸液換算，進而接種細胞；

S6，細胞培養(yǎng)，將T75培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱，原代培養(yǎng)第24h后，進行全量換液，此后每隔3天全量換液，并且保持在二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；

S7，原代細胞收獲，7天左右，原代培養(yǎng)的細胞克隆團的面積百分比到達70％～80％時，收獲原代細胞，在T75培養(yǎng)瓶中每75cm²加入2ml由125％Trypsin～0.01％EDTA組成的消化酶溶液，消化1.5～2.5min，再加入培養(yǎng)基2～3ml反復吹打瓶底至細胞大部分脫落,將脫落下來的原細胞移入50ml離心管中，并往原T75培養(yǎng)瓶中加入4～5ml氯化鈉注射液沖洗瓶壁，最終加入50ml離心管中并定容至50ml，使用移液管吹打懸浮后，通過100目無菌濾網(wǎng)過濾，過濾液收集到另一個50ml離心管中，1000rpm，10min離心洗滌；

S8，原代細胞傳代，觀察單個離心管內(nèi)余下細胞沉淀量，適當合并數(shù)個離心管中細胞沉淀至1個離心管中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細胞，定容至30ml，吹打混勻，取樣計數(shù)，計數(shù)后進行1000rpm，10min二次離心，去除上清液，在離心管中加入培養(yǎng)基適量，輕輕吹打重懸浮細胞，定容后接種至新的培養(yǎng)容器中，傳代細胞密度為5000～6000個/cm²，即(3.75～4.5)×10⁵個cells/T75，在培養(yǎng)容器上標示細胞代數(shù)與培養(yǎng)時間等信息，將培養(yǎng)容器放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)，直至培養(yǎng)至細胞融合達85％～90％。

進一步，在S1步驟中，T175培養(yǎng)瓶需用75％的酒精擦拭外壁。

進一步，在S2步驟中，I型膠原酶溶液的預熱方法為提前半小時于37℃的氣浴搖床預熱。

進一步，在S4步驟中，移液管吸取下層的膠原酶溶液時，需要在脂肪基質(zhì)血管組分沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細胞。

進一步，在S6、S8步驟中，培養(yǎng)箱中溫度為37±0.5℃，二氧化碳體積分數(shù)為5±0.2％。

進一步，在S4至S8步驟中，所述培養(yǎng)基為Media31+GF30。

本發(fā)明提供的脂肪干細胞分離培養(yǎng)方法可以通過規(guī)范脂肪干細胞分離培養(yǎng)的步驟以及具體的操作中的各項參數(shù)，建立一套完整的脂肪干細胞分離培養(yǎng)體系，提高脂肪干細胞分離培養(yǎng)效率、產(chǎn)出率，降低生產(chǎn)成本。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為脂肪干細胞分離培養(yǎng)步驟；

圖2為I型膠原酶消化時間實驗細胞計數(shù)統(tǒng)計圖；

圖3為傳代密度細胞形態(tài)統(tǒng)計圖；

圖4為傳代密度細胞計數(shù)結(jié)果圖；

圖5為培養(yǎng)基篩選實驗細胞計數(shù)結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明提供一種脂肪干細胞分離培養(yǎng)方法，通過建立一套完整的脂肪干細胞分離培養(yǎng)體系，提高脂肪干細胞的培養(yǎng)效率，包括以下步驟。

S1，洗滌脂肪組織，除去血細胞，向外壁用75％的酒精擦拭過的T175培養(yǎng)瓶中加入50ml脂肪組織、100ml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動3min以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3～5min，使不同相分離，吸去下層水相，重復S1步驟三次，直到下層液較為清澈。

S2，I型膠原酶消化，加入0.1％的I型膠原酶溶液，所述I型膠原酶溶液提前半小時于37℃的氣浴搖床預熱，然后封口，劇烈晃動T175培養(yǎng)瓶5～10秒，置于振動氣浴鍋中，37℃，70rpm，消化60min，每隔15min劇烈晃動培養(yǎng)瓶5～10秒，直到脂肪組織看起來較為平滑。

膠原酶是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，常用劑量為最終濃度200U/ml(約為1mg/mL)或0.03％～0.3％。本發(fā)明所采用的I型膠原酶用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離，使消化組織中連接部分其成為單個細胞，用于哺乳動細胞的分離。

如圖2，為I型膠原酶消化時間實驗細胞計數(shù)統(tǒng)計圖，在37℃氣浴搖床中，70轉(zhuǎn)每分鐘，分別消化1h、2h和3h的時間長度，通過考察培養(yǎng)過程中的細胞形態(tài)和最終的細胞收獲量來確定那個消化的時間長度是消化脂肪組織的最佳時間。在其他條件相同的情況下，采用0.1％的I型膠原酶對脂肪組織分別消化1h、2h和3h的時間長度，對培養(yǎng)過程中脂肪干細胞的生長情況進行拍照，在相同的時間點收獲細胞進行細胞計數(shù)，對比收獲的細胞數(shù)量的變化。從細胞形態(tài)上看I型膠原酶I消化2h和3h與消化1h對比沒有明顯區(qū)別。原代細胞得量，消化3h比消化1h和2h有明顯的增多，1h和2h相比沒有明顯變化，分析原因可能是消化時間越長消化越充分，同時會有更多的其他非目的細胞也會消化下來，所以相對細胞量要多；同時消化時間越久對細胞的損傷越大。傳代過程中各消化時間對細胞的收獲量的影響區(qū)別不大。綜合考慮細胞形態(tài)和細胞收獲量以及時間成本等因素，本發(fā)明采用I型膠原酶消化1h。

S3，分離脂肪基質(zhì)血管組分，將消化后的脂肪組織用無菌40目濾網(wǎng)分裝到50ml的離心管中，室溫下400g離心10min，得到的沉淀即為脂肪基質(zhì)血管組分。

S4，凈化沉淀，離心后，脂肪基質(zhì)血管組分沉積于離心管底部，用移液管自上而下除去上層油脂和下層的膠原酶溶液，注意，移液管吸取下層的膠原酶溶液時，需要在脂肪基質(zhì)血管組分沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細胞，移除上層油脂和下層的膠原酶溶液后，需要再加入適量生理鹽水重懸細胞，吹散，室溫400g離心10min，離心完畢，再次吸取上層清液，最后加入10ml培養(yǎng)基懸浮細胞，將細胞匯總到50ml離心管中，過100目篩，再次在室溫下，300g離心10min。

S5，細胞種植，離心后加20ml培養(yǎng)基充分混勻，按照每平方厘米接種0.16ml抽脂得到的脂肪量進行接種，即每個T75培養(yǎng)瓶中接種12ml抽脂脂肪量，每100ml脂肪組織，最終可以接種8個T75培養(yǎng)瓶，進行未處理脂肪量和最終得到的細胞懸液換算，進而接種細胞。

S6，細胞培養(yǎng)，將T75培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱，原代培養(yǎng)第24h后，進行全量換液，此后每隔3天全量換液，并且保持在二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

S7，原代細胞收獲，7天左右，原代培養(yǎng)的細胞克隆團的面積百分比到達70％～80％時，收獲原代細胞，在T75培養(yǎng)瓶中每75cm²加入2ml由125％Trypsin～0.01％EDTA組成的消化酶溶液，消化1.5～2.5min，再加入培養(yǎng)基2～3ml反復吹打瓶底至細胞大部分脫落,將脫落下來的原細胞移入50ml離心管中，并往原T75培養(yǎng)瓶中加入4～5ml氯化鈉注射液沖洗瓶壁，最終加入50ml離心管中并定容至50ml，使用移液管吹打懸浮后，通過100目無菌濾網(wǎng)過濾，過濾液收集到另一個50ml離心管中，1000rpm，10min離心洗滌。

S8，原代細胞傳代，觀察單個離心管內(nèi)余下細胞沉淀量，適當合并數(shù)個離心管中細胞沉淀至1個離心管中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細胞，定容至30ml，吹打混勻，取樣計數(shù)，計數(shù)后進行1000rpm，10min二次離心，去除上清液，在離心管中加入培養(yǎng)基適量，輕輕吹打重懸浮細胞，定容后接種至新的培養(yǎng)容器中，傳代細胞密度為5000～6000個/cm²，即(3.75～4.5)×10⁵個cells/T75，在培養(yǎng)容器上標示細胞代數(shù)與培養(yǎng)時間等信息，將培養(yǎng)容器放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)，直至培養(yǎng)至細胞融合達85％～90％。

每一種類型的細胞種類，因為有它自身所特有的一些特征，所以增殖能力、大小和形態(tài)方面也是不一樣的。細胞傳代過程中，傳代的密度是很重要的，過低則細胞容易老化，不容易長起來，過高細胞則收獲量變少。我們設(shè)置了幾個傳代密度，根據(jù)這些不同密度的比較，從而鑒定出一個最適合脂肪干細胞傳代的密度。設(shè)置的傳代密度如下：2.5×10⁵/T75、5.0×10⁵/T75、7.5×10⁵/T75；2.0×10⁵/T75、3.0×10⁵/T75、4.0×10⁵/T75?？疾旒毎螒B(tài)、融合度，細胞收獲量兩個指標。

如圖3，為傳代密度細胞形態(tài)統(tǒng)計圖，從細胞形態(tài)上來看，不同傳代密度對細胞形態(tài)的影響沒有明顯變化。如圖4，為傳代密度細胞計數(shù)結(jié)果圖，7.5×10⁵組接種兩天細胞融合度大于90％，收獲計數(shù)；2.5×10⁵、5.0×10⁵組接種三天收獲計數(shù)；7.5×10⁵組相對于5.0×10⁵組細胞收獲量沒有明顯差異，5.0×10⁵組較2.5×10⁵組細胞收獲量有明顯增加。為進一步得到最佳傳代密度，設(shè)置2.0、3.0、4.0×10⁵組，傳代三天后收獲。4.0×10⁵組較其他兩組細胞收獲量有增加，比5.0×10⁵組要稍少。所以本發(fā)明采用的細胞傳代密度為5300cells/cm²，即4.0×10⁵/T75。

在本實施例中，S6、S8步驟中，培養(yǎng)箱中溫度為37±0.5℃，二氧化碳體積分數(shù)為5±0.2％。

如圖5，為培養(yǎng)基篩選實驗細胞計數(shù)結(jié)果圖，將幾種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果進行了對比，從而確定出最適合脂肪干細胞生長的培養(yǎng)基?？梢姡珼MEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基脂肪干細胞增殖緩慢，并且在P1代出現(xiàn)衰老現(xiàn)象(細胞增殖緩慢，細胞形態(tài)不再成成纖維狀，細胞突觸變多，細胞立體感變差)；DMEM/F12+因子30培養(yǎng)基和Media31+GF30培養(yǎng)基細胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的成纖維狀，兩者細胞形態(tài)相差不大。P0代Media31+GF30培養(yǎng)基細胞收獲量是2.5×10⁶/T75,DMEM/F12+因子30培養(yǎng)基細胞收獲量是1.3×10⁶/T75，DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基細胞收獲量是1.0×10⁶/T75。在P1代Media31+GF30培養(yǎng)基細胞收獲量是1.7×10⁶/T75,DMEM/F12+30培養(yǎng)基細胞收獲量是1.3×10⁶/T75，DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)基細胞收獲量是3.75×10⁵/T75。在P2代Media31+GF30培養(yǎng)基細胞收獲量是1.65×10⁶/T75,DMEM/F12+因子30培養(yǎng)基細胞收獲量是1.45×10⁶/T75。從以上數(shù)據(jù)我們可以看到，在P0代Media31+GF30培養(yǎng)基細胞收獲量明顯大于其他兩種培養(yǎng)基。綜合考慮在S4至S8步驟中，所使用的培養(yǎng)基為Media31+GF30。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。