本發(fā)明屬于體外細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基。
背景技術：
隨著哺乳動物細胞培養(yǎng)規(guī)模的擴大和生物藥物需求的增長，優(yōu)質細胞培養(yǎng)基的研發(fā)也日益重要。目前，細胞培養(yǎng)基配方需要添加某一范圍內的添加劑，包括不確定的組分如胎牛血清(FCS)、幾種動物衍生蛋白和/或牛源蛋白水解物。細胞培養(yǎng)基中，通常需要添加血清或血清衍生的物質，如白蛋白、轉鐵蛋白或胰島素等，這些物質可能包含能污染細胞培養(yǎng)物及由此獲得的生物制品的多余物質。此外，必須對人血清衍生添加物進行測試，檢測所有已知的能通過血清傳染的病毒包括肝炎和HIV。此外，牛血清及其衍生產品也有受到BSE(牛海綿狀腦病，瘋牛病)污染的風險。此外，所有血清衍生產品都可能被未知的成分污染。在細胞培養(yǎng)中血清或蛋白添加劑是來自于人或其它動物源的情況下，特別在細胞用于生產人用藥物或疫苗情況下，存在許多問題(例如不同批次的組合物品質不同，以及被支原體、病毒或BSE污染的風險)。
甘草在《神農本草經》中列居上品，是歷史最悠久、應用最廣泛的中藥之一，也是中醫(yī)臨床遣方用藥中使用頻率最高的一味中藥，素有十方九草之說。甘草多糖是甘草一種重要的提取物，程安瑋等認為甘草多糖能明顯提高巨噬細胞的能量代謝水平(食品科學，2007，28(12)：431-4)。甘草多糖可增強T細胞、B細胞、NK細胞及單核巨噬細胞對γ干擾素的合成和分泌，進而通過發(fā)揮廣泛的免疫增強作用。
劉霞等研究認為甘草多糖具有促進淋巴細胞增殖作用(中國公共衛(wèi)生，2004，20(5)：572-3)。甘草多糖增加巨噬細胞的吞噬作用，誘導巨噬細胞分泌，增強細胞活性，誘導脾臟的分泌。由對正常小鼠巨噬細胞能量代謝水平及淋巴細胞體外增殖影響的實驗表明，甘草多糖對小鼠巨噬細胞能量代謝及淋巴細胞的增殖有促進作用，體外增強作用隨劑量增加而增加。
王忱等研究表明給予甘草多糖的小鼠的腫瘤明顯小于對照組(臨床腫瘤學雜志，2003，8(2))。王岳五等的實驗也表明，甘草多糖具有一定的抗腫瘤活性，可以延長腹水瘤小鼠的生存期，抑制實體瘤的生長(南開大學學報，2000，33(4)：46-8)。劉滿紅等研究表明，甘草多糖具有很強的清除羥自由基的能力(云南中醫(yī)藥雜志，2009，30(6)：57-8)。聶小華等實驗認為甘草多糖對淋巴細胞增殖有較好的促進作用。史玉榮等研究表明甘草多糖通過誘導小鼠—肉瘤凋亡來抑制腫瘤生長(現代儀器，2005，4(30-2))。
在已有的無血清培養(yǎng)基中，有些無法實現高密度培養(yǎng)過程；有些雖能很好地支持細胞生長，但可能導致細胞表達產物能力降低，甚至喪失；此外，商業(yè)無血清培養(yǎng)基的配方常屬商業(yè)機密，且組分復雜、價格昂貴，既不利于特定細胞株培養(yǎng)技術的研究，也無法直接用于細胞培養(yǎng)過程的研究、開發(fā)和優(yōu)化。
技術實現要素：
為解決上述現有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基，其不包含任何添加的補充性動物源蛋白質和/或重組動物蛋白，添加有甘草多糖，本發(fā)明培養(yǎng)基能使細胞快速增殖并有效提高細胞表達能力。
本發(fā)明培養(yǎng)基是通過以下技術方案實現的：
一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基，包括以下成分及其濃度組成：甘草多糖45-150mg/L，葡萄糖10-20g/L，大豆水解物1.5～3g/L，腐胺0.5～15mg/L，精胺0.1～1.5mg/L，鳥氨酸0.045～1.35mg/L，丙酮酸鈉65～75mg/L，谷氨酰胺0.3～0.75g/L，丙氨酸5～10mg/L，精氨酸0.15～0.25g/L，天冬酰胺7～12mg/L，天冬氨酸8～10mg/L，半胱氨酸25～45mg/L，胱氨酸30～55mg/L，谷氨酸6～18mg/L，甘氨酸20～45mg/L，組氨酸25～40mg/L，異亮氨酸50～100mg/L，亮氨酸55～150mg/L，賴氨酸80～185mg/L，苯丙氨酸50～70mg/L，脯氨酸20～30mg/L，絲氨酸35～50mg/L，蘇氨酸60～80mg/L，色氨酸10～15mg/L，酪氨酸60～100mg/L，纈氨酸60～100mg/L，生物素0.005～0.01mg/L，維生素D 0.50～2.50mg/L，葉酸2.50～8mg/L，硫酸亞鐵1.5～4.5mg/L，硝酸鐵0.1～0.5mg/L，EDTA·2Na 1.5～10mg/L，乙醇胺3.5～8.5mg/L，甘油0.3～0.45mg/L，魚肝油0.1～0.2mg/L，膽固醇0.065～0.15mg/L，亞油酸0.045～0.075mg/L，胸苷0.45～2.0mg/L，次黃嘌呤5～15mg/L，氫化可的松0.045～0.065mg/L，亞硒酸鈉0.04～0.06mg/L，生育酚1.5～3.5mg/L，碳酸氫鈉2.5～3g/L，氯化鈣125～145mg/L，氯化鎂45～65mg/L，硫酸鎂45～65mg/L，氯化鉀350～400mg/L，磷酸二氫鈉65～100mg/L，氯化鈉4.5～5g/L，磷酸氫二鈉75～100mg/L，硫酸鋅0.432～1.25mg/L和硫酸銅0.0025～0.0045mg/L。
優(yōu)選地，含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基由以下成分及其濃度組成：甘草多糖85mg/L，葡萄糖15g/L，大豆水解物2.5g/L，腐胺10.5mg/L，精胺0.75mg/L，鳥氨酸0.75mg/L，丙酮酸鈉72mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，丙氨酸8.5mg/L，精氨酸0.17g/L，天冬酰胺9.5mg/L，天冬氨酸9.35mg/L，半胱氨酸33.5mg/L，胱氨酸46.87mg/L，谷氨酸15.5mg/L，甘氨酸40.25mg/L，組氨酸35mg/L，異亮氨酸87.5mg/L，亮氨酸95.5mg/L，賴氨酸135mg/L，苯丙氨酸65mg/L，脯氨酸27.5mg/L，絲氨酸45mg/L，蘇氨酸77.6mg/L，色氨酸8.3mg/L，酪氨酸78mg/L，纈氨酸96.5mg/L，生物素0.0075mg/L，維生素D 0.135mg/L，葉酸5.5mg/L，硫酸亞鐵3.23mg/L，硝酸鐵0.45mg/L，EDTA·2Na8.5mg/L，乙醇胺4.75mg/L，甘油0.45mg/L，魚肝油0.15mg/L，膽固醇0.13mg/L，亞油酸0.054mg/L，胸苷1.75mg/L，次黃嘌呤12.3mg/L，氫化可的松0.045mg/L，亞硒酸鈉0.055mg/L，生育酚2.5mg/L，碳酸氫鈉2.75g/L，氯化鈣135mg/L，氯化鎂55mg/L，硫酸鎂50mg/L，氯化鉀375mg/L，磷酸二氫鈉85mg/L，氯化鈉4.75g/L，磷酸氫二鈉85mg/L，硫酸鋅0.45mg/L和硫酸銅0.003mg/L。
上述組分及其濃度是發(fā)明人經大量試驗篩選確定的。上述組分中，甘草糖對細胞生長、細胞活性有促進作用，大量實驗研究表明，甘草多糖對細胞內多胺的生物合成具有促進作用，促進細胞的分化。腐胺，精胺，鳥氨酸是多胺類物質，影響細胞的生長與分化，如DNA的復制、轉錄及翻譯等，通過控制腐胺的含量能夠調節(jié)細胞的PH值。葡萄糖，氨基酸，維生素以及無機鹽是細胞生長所需的基礎營養(yǎng)物質。丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源。硫酸亞鐵、硝酸鐵和EDTA·2Na作為轉鐵蛋白的替代物，促進胞內鐵的運輸。胸苷、次黃嘌呤為核酸類物質，在細胞內水解后，為細胞DNA復制，轉錄提供游離的核苷酸和ATP。氫化可的松是一種糖皮脂激素，能夠增加細胞活率和抗體密度。乙醇胺能夠有效清除自由基，提高抗氧化能力。魚肝油、膽固醇和亞油酸屬于脂類物質，脂類不僅儲備能量，且是細胞生物膜的組成部分，在物質轉運和信號轉導中也發(fā)揮重要作用，培養(yǎng)基中添加脂類尤其是脂肪酸，以促進細胞增殖及蛋白表達。
優(yōu)選地，所述甘草多糖由甘草提取得到，提取方法如下：
S1.將甘草粉碎，稱取200-400g置1L燒杯中，加水500～800mL，30～37℃水浴中超聲提取30～150min，過濾，收集濾液；
S2.向上述S1步驟所得濾渣中，再加水400～800mL，30～37℃水浴中再次超聲提取30～150min，過濾，收集濾液；
S3.合并上述S1和S2兩次濾液，旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮至50～35mL，室溫冷卻后將濃縮液5000r/min離心10～15min，棄去雜質沉淀后，緩慢地加入5～6倍量95％乙醇，并不斷用玻璃棒攪拌，使甘草多糖充分析出，靜置24h后，7000r/min離心5～10min得甘草多糖沉淀；
S4.將上述S3甘草糖沉淀再用無水乙醇洗滌2～3次后，60℃下干燥，得甘草多糖。
優(yōu)選地，所述含甘草多糖的無動物來源低蛋白細胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
A.首先稱取甘草多糖，葡萄糖，丙酮酸鈉，大豆水解物，腐胺，精胺，鳥氨酸，檸檬酸鐵，硫酸亞鐵，硝酸鐵，EDTA·2Na，谷氨酰胺，丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸，纈氨酸，生物素，維生素D，葉酸，亞硒酸鈉，生育酚，氯化鈣，氯化鎂，硫酸鎂，氯化鉀，磷酸二氫鈉，氯化鈉，磷酸氫二鈉，硫酸鋅，硫酸銅，胸苷和次黃嘌呤，溶于800mL超純水中，攪拌均勻，得溶液I；
B.向上述溶液I中加入氫化可的松，乙醇胺，甘油，魚肝油，膽固醇和亞油酸，攪拌均勻，得溶液II；
C.向溶液II中加入碳酸氫鈉，攪拌均勻，得溶液III；
調節(jié)培養(yǎng)基PH至7.2～7.4，加超純水定容至1L，用0.22μm的濾膜過濾，除菌，即得。
本發(fā)明培養(yǎng)基適用于淋巴細胞，本發(fā)明培養(yǎng)基各組分搭配合理，具有以下優(yōu)點：
(1)本發(fā)明培養(yǎng)基是一種含甘草多糖的無動物來源的低蛋白細胞培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基不含動物來源血清，批次間穩(wěn)定無干擾，所含蛋白濃度低，有利于產物的分離純化。
(2)本發(fā)明培養(yǎng)基中含有甘草多糖，甘草多糖對細胞生長、細胞活性有促進作用，促進胞內多胺的生物合成，與現有無動物來源低蛋白培養(yǎng)基相比，本發(fā)明培養(yǎng)基不僅能使細胞快速生長，并且能夠提高細胞的表達能力。
附圖說明
圖1不同培養(yǎng)基中細胞生長曲線的測定
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
本發(fā)明中的各組分均為常規(guī)市售產品，均購于索萊寶生化試劑有限公司。本發(fā)明中，培養(yǎng)基A：本發(fā)明實施例1提供的含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基；培養(yǎng)基B：對比例1培養(yǎng)基；培養(yǎng)基C：美國Gibco公司的無血清培養(yǎng)基MSC SFM CTSTM。
實施例1一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基
一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：
甘草多糖85mg/L，葡萄糖15g/L，大豆水解物2.5g/L，腐胺10.5mg/L，精胺0.75mg/L，鳥氨酸0.75mg/L，丙酮酸鈉72mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，丙氨酸8.5mg/L，精氨酸0.17g/L，天冬酰胺9.5mg/L，天冬氨酸9.35mg/L，半胱氨酸33.5mg/L，胱氨酸46.87mg/L，谷氨酸15.5mg/L，甘氨酸40.25mg/L，組氨酸35mg/L，異亮氨酸87.5mg/L，亮氨酸95.5mg/L，賴氨酸135mg/L，苯丙氨酸65mg/L，脯氨酸27.5mg/L，絲氨酸45mg/L，蘇氨酸77.6mg/L，色氨酸8.3mg/L，酪氨酸78mg/L，纈氨酸96.5mg/L，生物素0.0075mg/L，維生素D 0.135mg/L，葉酸5.5mg/L，硫酸亞鐵3.23mg/L，硝酸鐵0.45mg/L，EDTA·2Na8.5mg/L，乙醇胺4.75mg/L，甘油0.45mg/L，魚肝油0.15mg/L，膽固醇0.13mg/L，亞油酸0.054mg/L，胸苷1.75mg/L，次黃嘌呤12.3mg/L，氫化可的松0.045mg/L，亞硒酸鈉0.055mg/L，生育酚2.5mg/L，碳酸氫鈉2.75g/L，氯化鈣135mg/L，氯化鎂55mg/L，硫酸鎂50mg/L，氯化鉀375mg/L，磷酸二氫鈉85mg/L，氯化鈉4.75g/L，磷酸氫二鈉85mg/L，硫酸鋅0.45mg/L和硫酸銅0.003mg/L。
本發(fā)明甘草糖的提取方法，分為以下步驟：
S1.將甘草粉碎，稱取400g置1L燒杯中，加水800mL，33℃水浴中超聲提取150min，過濾，收集濾液；
S2.向上述S1步驟所得濾渣中，再加水800mL，36℃水浴中再次超聲提取30min，過濾，收集濾液；
S3.合并上述S1和S2兩次提濾液，旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮至50～35mL，室溫冷卻后將濃縮液5000r/min離心15min，棄去雜質沉淀后，緩慢地加入6倍量95％乙醇，并不斷用玻璃棒攪拌，使甘草多糖充分析出，靜置24h后，7000r/min離心10min得甘草多糖沉淀；
S4.將上述S3甘草糖沉淀再用無水乙醇洗滌3次后，60℃下干燥，得甘草多糖。
含甘草多糖的無動物來源低蛋白細胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
A.首先稱取甘草多糖，葡萄糖，丙酮酸鈉，大豆水解物，腐胺，精胺，鳥氨酸，檸檬酸鐵，硫酸亞鐵，硝酸鐵，EDTA·2Na，谷氨酰胺，丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸，纈氨酸，生物素，維生素D，葉酸，亞硒酸鈉，生育酚，氯化鈣，氯化鎂，硫酸鎂，氯化鉀，磷酸二氫鈉，氯化鈉，磷酸氫二鈉，硫酸鋅，硫酸銅，胸苷和次黃嘌呤，溶于800mL超純水中，攪拌均勻，得溶液I；
B.向上述溶液I中加入氫化可的松，乙醇胺，甘油，魚肝油，膽固醇和亞油酸，攪拌均勻，得溶液II；
C.向溶液II中加入碳酸氫鈉，攪拌均勻，得溶液III；
調節(jié)培養(yǎng)基PH至7.2～7.4，加超純水定容至1L，用0.22μm的濾膜過濾，除菌，即得。
實施例2一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基
一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：
甘草多糖45mg/L，葡萄糖20g/L，大豆水解物3g/L，腐胺15mg/L，精胺1.5mg/L，鳥氨酸1.35mg/L，丙酮酸鈉75mg/L，谷氨酰胺0.75g/L，丙氨酸10mg/L，精氨酸0.25g/L，天冬酰胺12mg/L，天冬氨酸10mg/L，半胱氨酸45mg/L，胱氨酸55mg/L，谷氨酸18mg/L，甘氨酸45mg/L，組氨酸40mg/L，異亮氨酸100mg/L，亮氨酸150mg/L，賴氨酸185mg/L，苯丙氨酸70mg/L，脯氨酸30mg/L，絲氨酸50mg/L，蘇氨酸80mg/L，色氨酸15mg/L，酪氨酸100mg/L，纈氨酸100mg/L，生物素0.01mg/L，維生素D 2.50mg/L，葉酸8mg/L，硫酸亞鐵4.5mg/L，硝酸鐵0.5mg/L，EDTA·2Na 10mg/L，乙醇胺8.5mg/L，甘油0.45mg/L，魚肝油0.2mg/L，膽固醇0.15mg/L，亞油酸0.075mg/L，胸苷2.0mg/L，次黃嘌呤15mg/L，氫化可的松0.065mg/L，亞硒酸鈉0.06mg/L，生育酚3.5mg/L，碳酸氫鈉3g/L，氯化鈣145mg/L，氯化鎂65mg/L，硫酸鎂65mg/L，氯化鉀400mg/L，磷酸二氫鈉100mg/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鈉100mg/L，硫酸鋅1.25mg/L，硫酸銅0.0045mg/L。
本發(fā)明甘草多糖提取方法、培養(yǎng)基的制備方法與實施例1類似。
實施例3一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基
一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：
甘草多糖150mg/L，葡萄糖10g/L，大豆水解物1.5g/L，腐胺0.5mg/L，精胺0.1mg/L，鳥氨酸0.045mg/L，丙酮酸鈉65mg/L，谷氨酰胺0.3g/L，丙氨酸5mg/L，精氨酸0.15g/L，天冬酰胺7mg/L，天冬氨酸8mg/L，半胱氨酸25mg/L，胱氨酸30mg/L，谷氨酸6mg/L，甘氨酸20mg/L，組氨酸25mg/L，異亮氨酸50mg/L，亮氨酸55mg/L，賴氨酸80mg/L，苯丙氨酸50mg/L，脯氨酸20mg/L，絲氨酸35mg/L，蘇氨酸60mg/L，色氨酸10mg/L，酪氨酸60mg/L，纈氨酸60mg/L，生物素0.005mg/L，維生素D 0.50～2.50mg/L，葉酸2.50～8mg/L，硫酸亞鐵1.5～4.5mg/L，硝酸鐵0.1～0.5mg/L，EDTA·2Na 1.5～10mg/L，乙醇胺3.5～8.5mg/L，甘油0.3～0.45mg/L，魚肝油0.1～0.2mg/L，膽固醇0.065～0.15mg/L，亞油酸0.045～0.075mg/L，胸苷0.45～2.0mg/L，次黃嘌呤5～15mg/L，氫化可的松0.045～0.065mg/L，亞硒酸鈉0.04～0.06mg/L，生育酚1.5～3.5mg/L，碳酸氫鈉2.5～3g/L，氯化鈣125～145mg/L，氯化鎂45～65mg/L，硫酸鎂45～65mg/L，氯化鉀350～400mg/L，磷酸二氫鈉65～100mg/L，氯化鈉4.5～5g/L，磷酸氫二鈉75～100mg/L，硫酸鋅0.432～1.25mg/L，硫酸銅0.0025～0.0045mg/L。
本發(fā)明甘草多糖提取方法、培養(yǎng)基的制備方法與實施例1類似。
對比例1一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基
一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：
乳糖85mg/L，葡萄糖15g/L，大豆水解物2.5g/L，腐胺10.5mg/L，精胺0.75mg/L，鳥氨酸0.75mg/L，丙酮酸鈉72mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，丙氨酸8.5mg/L，精氨酸0.17g/L，天冬酰胺9.5mg/L，天冬氨酸9.35mg/L，半胱氨酸33.5mg/L，胱氨酸46.87mg/L，谷氨酸15.5mg/L，甘氨酸40.25mg/L，組氨酸35mg/L，異亮氨酸87.5mg/L，亮氨酸95.5mg/L，賴氨酸135mg/L，苯丙氨酸65mg/L，脯氨酸27.5mg/L，絲氨酸45mg/L，蘇氨酸77.6mg/L，色氨酸8.3mg/L，酪氨酸78mg/L，纈氨酸96.5mg/L，生物素0.0075mg/L，維生素D 0.135mg/L，葉酸5.5mg/L，硫酸亞鐵3.23mg/L，硝酸鐵0.45mg/L，EDTA·2Na8.5mg/L，乙醇胺4.75mg/L，甘油0.45mg/L，魚肝油0.15mg/L，膽固醇0.13mg/L，亞油酸0.054mg/L，胸苷1.75mg/L，次黃嘌呤12.3mg/L，氫化可的松0.045mg/L，亞硒酸鈉0.055mg/L，生育酚2.5mg/L，碳酸氫鈉2.75g/L，氯化鈣135mg/L，氯化鎂55mg/L，硫酸鎂50mg/L，氯化鉀375mg/L，磷酸二氫鈉85mg/L，氯化鈉4.75g/L，磷酸氫二鈉85mg/L，硫酸鋅0.45mg/L和硫酸銅0.003mg/L。
與實施例1的區(qū)別在于，用甘露聚糖替換甘草多糖。
制備方法與實施例1類似。
試驗例1細胞生長曲線的測定
將小鼠細胞進行細胞分離，分離步驟如下：
(1)將小鼠斷頸處死，浸入乙醇中浸泡；
(2)在無菌操作臺中小心剪開小鼠的腹部外皮，用大頭針固定，再剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠的脾臟；
(3)在培養(yǎng)皿中放入小鼠臟器淋巴細胞分離液(使用前搖勻淋巴細胞分離液)。用鑷子固定尼龍網，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞分離液中(每研磨一只脾臟花費的時間最好控制在之內，防止在研磨過程中液體揮發(fā)，使得密度與滲透壓改變，影響分離效果)；
(4)把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到離心管中，離心前慢慢往分離液液面上分別覆蓋一層大約1mL的A培養(yǎng)基或B培養(yǎng)基；
(5)1500r/min離心，離心結束后淋巴細胞會漂浮上來，在所覆蓋層下面聚集；
(6)吸出淋巴細胞層，再加入離心。傾倒上清液，加入3-5mLPBS重懸，800r/min離心10min離心棄去上清，取一定體積的淋巴細胞懸液倍稀釋20倍后進行淋巴細胞計數。最終用后分別用A培養(yǎng)基或B培養(yǎng)基將淋巴細胞懸液稀釋成1x107個細胞/mL。
細胞生長曲線的測定：
將細胞懸液分別加入含A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基和C培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，將細胞搖勻，在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取樣，利用MTT法測定生長曲線，結果如圖1所示。
由圖1可知，本發(fā)明培養(yǎng)基與另兩種培養(yǎng)基相比適應期更短，增值速度更高，培養(yǎng)效果更優(yōu)；培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C第216h生長達到高峰，第264h開始衰亡，而培養(yǎng)基A第168h到達高峰，第360h才開始衰亡，可見，本發(fā)明培養(yǎng)基可以延遲MSCs進入衰亡期，延長細胞生長的周期。由此可知本發(fā)明實施例1提供的含甘草多糖的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基有利于細胞的生長。
試驗例2流式細胞術鑒定表面標志的表達水平
利用試驗例1所得淋巴細胞懸液分別用A、B培養(yǎng)基37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后收集。用PE標記的抗小鼠B220mAB染色，然后分別FITC標記的CD86、PerCP標記的抗小鼠CD80、FITC標記的CD40、APC標記的抗小鼠CD138染色。避光室溫孵育，用洗漆兩次。用緩沖液重懸細胞，采用流式細胞儀進行檢測細胞表面標記的表達水平，具體結果如表1所示。
表1細胞表面標記蛋白熒光強度
注：與培養(yǎng)基B相比，*表示P<0.05，培養(yǎng)基A中CD86表達量差異顯著；
##表示P<0.01，培養(yǎng)基A中CD80表達量差異極為顯著；
&&表示P<0.01，培養(yǎng)基A中CD40表達量極為顯著；
＊＊表示P<0.01，培養(yǎng)基A中CD138表達量極為顯著。
由表1可知，培養(yǎng)基A與培養(yǎng)基B相比，CD86表達量差異顯著，CD80、CD40和CD138表達量差異極為顯著，說明本發(fā)明提供的含一種含甘草多糖的無動物來源低蛋白的細胞培養(yǎng)基能夠顯著提高淋巴細胞的表達量。