本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及鉍化合物具有引發(fā)細胞自噬的作用。還涉及了鉍化合物在制備細胞自噬模型中的應用及構建細胞自噬模型的方法。

背景技術：

鉍為銀白色至粉紅色的金屬，質脆易粉碎，鉍的化學性質較穩(wěn)定。鉍在自然界中以游離金屬和礦物的形式存在。以前鉍被認為是相對原子質量最大的穩(wěn)定元素。鉍主要用于制造易熔合金，熔點范圍是47～262℃，最常用的是鉍同鉛、錫、銻、銦等金屬組成的合金，用于消防裝置、自動噴水器、鍋爐的安全塞，一旦發(fā)生火災時，一些水管的活塞會“自動”熔化，噴出水來。在消防和電氣工業(yè)上，用作自動滅火系統(tǒng)和電器保險絲、焊錫。鉍合金具有凝固時不收縮的特性，用于鑄造印刷鉛字和高精度鑄型。鉍作為一種半金屬越來越受到人們的關注，廣泛應用于除冶金外的化工、電子、宇航、醫(yī)藥等領域。

在醫(yī)學領域作為藥物成分應用已經有300多年的歷史。鉍化合物具有收斂、止瀉、治療胃腸消化不良癥，外科利用鉍藥的收斂作用來處理創(chuàng)傷和止血，在放射治療中，用鉍基合金代替鋁為患者防止身體其他部位受到輻射制造護板。

隨著細菌耐藥性的增加，傳統(tǒng)的三聯(lián)療法在根除幽門螺旋桿菌方面已經不能有效的發(fā)揮作用。添加了鉍化合物的鉍劑在根除幽門螺旋桿菌方面效果顯著。常見的一些鉍劑如枸櫞酸鉍鉀、膠體果膠鉍、次水楊酸鉍等被用來治療人類各種腸胃疾病，如胃腸炎、腹瀉、消化不良等腸胃病，在胃中，與胃酸相互作用形成氯氧化鉍的無定形沉淀。

然而鉍化合物造成的急性中毒幾乎沒有報道。有研究發(fā)現(xiàn)長期或過多攝入鉍劑會造成腎毒性，此外還會造成骨關節(jié)病、牙齦炎、口腔炎等副作用。盡管長期服用鉍類藥物會引發(fā)這些不良反應，但是對于具體的毒性機制了解甚少，幾乎沒有相關的報道。目前人們研究較多的是以膠體枸櫞酸鉍鉀或次水楊酸鉍為代表的鉍鹽導致的腎毒性的一些動物體內試驗，研究發(fā)現(xiàn)在腎中鉍的濃度最高，可能會減小腎小球的濾過率以及腎血流量等。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供了鉍化合物具有引發(fā)細胞自噬的作用。

自噬作為一種正常的細胞生理現(xiàn)象對于維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定是不可缺少的，通過去除受損傷的細胞器和有毒的大分子以此來維持內環(huán)境穩(wěn)定。本質上，自噬是一種代謝過程，能夠控制能量平衡，自噬出現(xiàn)障礙會導致一些代謝疾病，如神經退行性疾病、心肌病、癌癥等。自噬通常分為三種，即巨自噬、微自噬和分子伴侶調節(jié)的自噬，研究較多的是巨自噬通常簡稱為自噬。多種因素可以誘導自噬的產生，例如當細胞受到化學藥物的刺激、微生物感染、缺氧、饑餓、機械損傷等。自噬的過程復雜，將損傷嚴重的細胞器或有害物質吞噬到自噬體，最終通過溶酶體酶將其消化降解和回收再利用達到維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的目的。

與自噬相關的基因有很多，統(tǒng)一命名為細胞自噬相關基因(ATG)。LC3蛋白作為自噬發(fā)生的標志物被廣泛的用來檢測自噬的發(fā)生。正常情況下，LC3蛋白大多以LC3I型存在于胞漿中，當自噬發(fā)生時，LC3I經過修飾后轉換成LC3II型，LC3II結合在自噬體膜上，通過Western Blot檢測時會發(fā)現(xiàn)LC3II明顯升高，由于LC3I型彌散的分布在胞漿中，LC3II呈聚集狀結合在自噬體膜上，因此當發(fā)生自噬時通過免疫熒光圖片會看到有明顯的亮點聚集。

在一個具體實施例中，通過MTT實驗檢測鉍化合物對細胞毒性作用，結果顯示，鉍化合物對人肝癌細胞、人靜脈內皮細胞、非小肺癌細胞或人胚胎腎細胞具有一定的細胞毒性，尤其是對人胚胎腎細胞的毒性最大。

在一個具體實施例中，采用鉍化合物處理細胞，通過Western Blot技術提取了自噬標記物蛋白LC3蛋白，發(fā)現(xiàn)經過鉍化合物處理的細胞，LC3蛋白的表達量明顯上升，表明鉍化合物能夠引起人胚胎腎細胞等細胞的自噬效應產生。

因此，本發(fā)明提供了鉍化合物具有引發(fā)細胞自噬的作用。即鉍化合物在制備引發(fā)細胞自噬的產品中的應用。

本發(fā)明還提供了鉍化合物在制備細胞自噬模型中的應用。

本領域技術人員可以理解，所述鉍化合物可以為鉍離子，也可以為鉍納米顆粒。

作為優(yōu)選，所述鉍離子為五水硝酸鉍、檬酸鉍、水楊酸鉍或氯化鉍。

作為優(yōu)選，所述鉍納米顆粒為硫化鉍納米顆粒或氯氧化鉍納米顆粒。

本發(fā)明所述鉍類化合物可以用來處理人永生化表皮細胞、人肝癌細胞、人靜脈內皮細胞、非小肺癌細胞或人胚胎腎細胞，誘導細胞產生自噬效應，廣泛應用于醫(yī)藥領域或化妝品領域，用于制造藥品或護膚品。

按照本發(fā)明，所述產品為藥品或護膚品。

本發(fā)明的另一個目的是提供構建細胞自噬模型的方法，鉍化合物溶于溶劑后添加至細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述構建細胞自噬模型的方法中，所述鉍化合物為鉍離子或鉍納米顆粒。

作為優(yōu)選，所述鉍離子為五水硝酸鉍、檬酸鉍、水楊酸鉍或氯化鉍。

作為優(yōu)選，所述鉍納米顆粒為硫化鉍納米顆?；蚵妊趸G納米顆粒。

本發(fā)明所述方法先將鉍化合物溶于溶劑后得到一定的溶液。所述包括但不限于水、PBS、DMSO或乙醇水溶液。

優(yōu)選的，所述水為無菌水。

優(yōu)選的，所述乙醇水溶液中乙醇濃度為5v/v％。

進一步的，將鉍化合物溶于溶劑時優(yōu)選新鮮配制，并在用于細胞培養(yǎng)之前進行超聲處理。

本發(fā)明將上述鉍化合物溶于溶劑得到溶液添加至細胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞。作為優(yōu)選，所述細胞培養(yǎng)基DMEM高糖培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述細胞培養(yǎng)基中所述細胞培養(yǎng)基中鉍離子濃度2.5～20μg/ml，鉍納米顆粒濃度為160μg/ml。

本領域技術人員可以理解，培養(yǎng)的細胞為人永生化表皮細胞、人肝癌細胞、人靜脈內皮細胞、非小肺癌細胞或人胚胎腎細胞。優(yōu)選為人胚胎腎細胞。

按照本發(fā)明，所述構建細胞自噬模型的方法中所述細胞的培養(yǎng)優(yōu)選為37℃培養(yǎng)24h以上。

由上述技術方案可知，本發(fā)明提供了鉍化合物具有引發(fā)細胞自噬的作用。同時提供了鉍化合物在制備細胞自噬模型中的應用及構建細胞自噬模型的方法。通過MTT實驗檢測鉍化合物對細胞毒性作用，結果顯示，鉍化合物對人永生化表皮細胞、人肝癌細胞、人靜脈內皮細胞、非小肺癌細胞或人胚胎腎細胞具有一定的細胞毒性，尤其是對人胚胎腎細胞的毒性最大。采用鉍化合物處理細胞，通過Western Blot技術提取自噬標記物蛋白LC3蛋白，發(fā)現(xiàn)經過鉍化合物處理的細胞，LC3蛋白的表達量明顯上升。表明鉍化合物能夠引起人胚胎腎細胞等細胞的自噬效應產生，可廣泛應用于醫(yī)藥領域或化妝品領域，用于制造藥品或護膚品。本發(fā)明構建細胞自噬模型的方法，將鉍化合物溶于溶劑后添加至細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞即得，操作簡單，可用于研究鉍化合物對人體的毒副作用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT實驗)檢測五水硝酸鉍和硫化鉍納米顆粒對于HEK293細胞的毒性測試結果圖，其中圖A為硫化鉍納米顆粒在不同濃度下(0、2.5、5、10、20、40、80、160μg/ml)對選取的人肝癌細胞(HepG2)、人靜脈內皮細胞(HUVEC)、非小肺癌細胞(A549)、人胚胎腎細胞(HEK293)的細胞毒性；圖B為鉍離子在不同濃度下(0、2.5、5、10、20、40、80、160μg/ml)對HEK293細胞的細胞毒性；

圖2示Western Blot檢測鉍離子和鉍納米顆粒處理HEK293細胞后LC3蛋白的表達量的結果圖，其中，鉍離子選擇的濃度分別為0、2.5、5、10、20μg/ml，硫化鉍納米顆粒選擇的濃度為160μg/ml。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

如無特殊說明，本發(fā)明實施例中所涉及的試劑均為市售產品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。

實施例1：鉍離子和硫化鉍納米顆粒對細胞活力的影響。

細胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)人肝癌細胞(HepG2)、人靜脈內皮細胞(HUVEC)、非小肺癌細胞(A549)、人胚胎腎細胞(HEK293)4種細胞，選取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的細胞備用。

硫化鉍納米顆粒的細胞毒性檢測：將培養(yǎng)的4種細胞(人肝癌細胞、人靜脈內皮細胞、非小肺癌細胞、人胚胎腎細胞)分別接種到96孔板中，每孔8×10³個細胞，過夜培養(yǎng)使其充分貼壁生長。去掉原液，分別用加有硫化鉍納米顆粒濃度為2.5、5、10、20、40、80、160μg/ml的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48h，未添加硫化鉍納米顆粒的DMEM作為對照組。去掉上述溶液，加入濃度為0.5mg/ml的MTT溶液放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，之后，去掉MTT溶液，每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)溶液放于37℃振蕩10min，檢測其OD值，統(tǒng)計細胞活力，結果見圖1。

鉍離子的細胞毒性檢測：以五水硝酸鉍為例。將HEK293細胞接種到96孔板中，每孔8×10³個細胞，過夜培養(yǎng)使其充分貼壁生長。將五水硝酸鉍通過超聲將其溶于無菌水中，快速將其添加到DMEM高糖培養(yǎng)基中，將其配制成鉍離子濃度依次為2.5、5、10、20、40、80、160μg/ml培養(yǎng)液，未添加鉍離子的DMEM作為對照組，依次加入孔板中培養(yǎng)細胞48h。去掉上述溶液，加入濃度為0.5mg/ml的MTT溶液放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，之后，去掉MTT溶液，每孔加入100μl DMSO溶液放于37℃振蕩10min，檢測其OD值，統(tǒng)計細胞活力，結果見圖1。

結果顯示：硫化鉍納米顆粒對HEK293細胞的毒性最大，且呈濃度依賴，與其會導致腎毒性相符，對其他三種細胞造成的毒性相對較小。在濃度為40μg/ml時，HEK293細胞活力約為80％，當濃度為160μg/ml時，HEK293細胞活力僅為約60％。而鉍離子對HEK293細胞的毒性較為明顯，當鉍離子濃度為80μg/ml時，HEK293細胞的活力僅為約50％，表明鉍化合物及其納米顆粒對腎細胞毒性尤為明顯。

實施例2：鉍化合物及其納米顆粒引起HEK293細胞自噬。

HEK293細胞的制備：以常規(guī)方法培養(yǎng)HEK293細胞，選取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的細胞備用。

將所培養(yǎng)的細胞接種到6孔板中，每孔3×10³個細胞，培養(yǎng)過夜使其充分貼壁。將五水硝酸鉍通過超聲將其溶于無菌水中，快速將其添加到DMEM培養(yǎng)基中，將其配制成鉍離子濃度依次為2.5、5、10、20μg/ml培養(yǎng)液，將硫化鉍納米顆粒配成濃度為160μg/ml的培養(yǎng)液，將配置好的培養(yǎng)液加到6孔板中培養(yǎng)細胞24h。分別用胰酶消化收集細胞，用細胞裂解液在冰上裂解細胞并用BCA試劑盒對蛋白進行定量。通過Western Blot技術檢測LC3蛋白的表達，LC3作為自噬的標記物可以檢測自噬的發(fā)生。

細胞提取蛋白定量后，經過電泳以及轉膜后，用兔LC3一抗與脫脂奶粉以1:1000體積比配成稀釋液標記LC3蛋白，4℃過夜。TBST溶液清洗3遍，山羊抗兔二抗與脫脂奶粉以1:2000體積比配成稀釋液處理1h。加顯影液后檢測LC3蛋白的表達量。結果見圖2。

結果顯示：與對照組相比，鉍離子處理后的細胞表達LC3蛋白的量明顯增加，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，鉍離子濃度為20μg/ml時，LC3蛋白的濃度最高。與對照組相比，經硫化鉍納米顆粒處理的細胞，LC3蛋白的表達量明顯增加。

綜上所述，通過對HEK293細胞用不同濃度的鉍離子及硫化鉍納米顆粒處理后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，自噬的標記物LC3蛋白的表達量明顯增加，證明了鉍離子及其納米顆粒能誘發(fā)人胚胎腎細胞發(fā)生自噬效應。