一種魚類腸道上皮細(xì)胞的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及魚類腸道上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]魚類分布廣，幾乎棲居于所有水環(huán)境中，從淡水的湖泊到咸水的海洋。也是中國人餐桌上不可多得的一道美食，可以提供豐富的蛋白質(zhì)，又是唯一的天然多不飽和脂肪酸(n3)來源。近年來，人們對魚類需求的日益增高，促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時也吸引了大量優(yōu)秀研究人員的目光。腸道是魚重要的免疫器官，包涵許多淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。同時魚體的消化能力和吸收功能依靠著腸道健康。在細(xì)胞層面上利用魚類腸道上皮，可以進(jìn)行營養(yǎng)代謝如細(xì)胞自噬，腸道健康如腸屏障，和腸道發(fā)育等等各方面的研究。但是市場上由于技術(shù)瓶頸，腸上皮細(xì)胞系鮮有見到，對于魚類而言目前國內(nèi)外各大細(xì)胞庫內(nèi)均沒有銷售。
[0003]原代細(xì)胞培養(yǎng)是目前魚類腸細(xì)胞培養(yǎng)的唯一手段。但是由于低等脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)操作繁瑣，易污染，成本較高，還未見到公開發(fā)表的專利。已有文獻(xiàn)中僅參考哺乳類腸原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行魚類細(xì)胞培養(yǎng)，并不能完全適用，導(dǎo)致原代腸上皮細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定，成功率低，易污染等。因此提供一種可靠的，可行性高的魚類腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對低等脊椎動物的特點，提出了一種高效的，低成本的腸原代細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明的方法分離得到的魚類腸上皮細(xì)胞穩(wěn)定，成功率高，無污染。
[0005]本發(fā)明提出了一種分離培養(yǎng)魚腸道上皮細(xì)胞的方法，所述方法包括:
[0006](1)實驗用魚準(zhǔn)備:徹底排空腸道；
[0007](2)腸道組織清洗；在清洗培養(yǎng)基中清洗魚腸道組織；
[0008](3)蛋白酶消化:將上述腸道組織在蛋白酶中消化，得到消化產(chǎn)物；
[0009](4)細(xì)胞過濾和收集:過濾上述消化產(chǎn)物，收集細(xì)胞，得到過濾物；
[0010](5)鋪明膠:利用明膠對細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行鋪板；
[0011](6)細(xì)胞培養(yǎng):在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0012]具體地，所述方法包括:
[0013](1)實驗用魚準(zhǔn)備:饑餓24hr，徹底排空腸道。
[0014](2)魚類腸道組織清洗:取出魚腸道，短暫在酒精中浸泡，去除靠近肛門端約2cm后，在hanks平衡鹽中清洗第一道。后剪成約1cm小段，分段擠出內(nèi)容物，并在清洗培養(yǎng)基中清洗。接著剪開腸段，在新的培養(yǎng)基中清洗。重復(fù)此過程。
[0015](3)蛋白酶消化:在酶混液中消化，得到消化產(chǎn)物。
[0016](4)細(xì)胞過濾和收集:利用細(xì)胞篩，得到過濾物。轉(zhuǎn)速不大于lOOOrpm，離心重懸5次。
[0017](5)鋪板:利用明膠進(jìn)行鋪板。
[0018](6)細(xì)胞培養(yǎng):28±0.5°C的溫度，5% C02濃度下，利用DMEM并添加其他營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)。
[0019]優(yōu)選地，所述魚的大小為100g左右。
[0020]所述步驟(1)中，所述排空腸道的方法為饑餓12?24h，優(yōu)選地，排空腸道時間應(yīng)大于20h，腸道取出后在酒精中浸泡5s?10s，再在清洗培養(yǎng)基中進(jìn)行清洗。優(yōu)選地，所述酒精濃度應(yīng)為75% ;所述清洗過程應(yīng)在清洗培養(yǎng)基中洗滌大于8次。
[0021 ] 所述步驟(2)中，所述清洗培養(yǎng)基為包括雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基。
[0022]其中，所述青霉素、鏈霉素的添加量分別為200IU/ml、200IG/ml。
[0023]所述步驟(3)中，所述蛋白酶為膠原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的混合液，或胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的混合液，所述酶混合液的用量為所述酶混合液的用量與組織多少及容器大小有關(guān)，浸沒過組織塊即可。
[0024]其中，所述膠原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的重量比為4:1，所述胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的重量比為1:1.2。具體地，所述酶濃度可以為1.2mg/ml膠原蛋白酶XI和0.3mg/ml中性蛋白酶的混合液或者胰蛋白酶lmg/ml和1.2mg/ml膠原蛋白酶XI的混合液。
[0025]其中，當(dāng)采用膠原蛋白酶XI和中性蛋白酶I消化腸道組織時，應(yīng)在37°C水浴搖床條件下，對清潔后的腸組織消化30min ;或者當(dāng)采用胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI消化腸道組織時，應(yīng)在37°C水浴搖床條件下，先用胰蛋白酶消化lOmin?15min，后去除胰蛋白酶液，換為膠原蛋白酶XI消化15min?20min。
[0026]所述步驟(4)中，利用細(xì)胞篩對消化產(chǎn)物進(jìn)行過濾，細(xì)胞篩大小為100 μ m，在轉(zhuǎn)速不大于lOOOrpm下，離心重懸。優(yōu)選地，離心重懸5次。
[0027]所述步驟(5)中，鋪板明膠濃度應(yīng)為0.01g/ml明膠，在37°C下孵育lh。
[0028]所述步驟(6)中，所述細(xì)胞在溫度為28±0.5°C，C02濃度為5%的條件下培養(yǎng)。
[0029]其中，所述步驟(6)中，所述培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，0.01mg/ml胰島素，0.02mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，10mmol/L HEPES, 100IU/ml青霉素和100IG/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基PH為7.2?7.4。
[0030]本發(fā)明還提出了一種清洗培養(yǎng)基，其特征在于，所述清洗培養(yǎng)基為包括青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。其中，所述青霉素和鏈霉素為雙抗；所述青霉素、鏈霉素的添加量分別為 200IU/ml、200IG/ml。
[0031]本發(fā)明還提出了一種細(xì)胞消化液，其特征在于，所述細(xì)胞消化液為酶混合液，包括膠原蛋白酶XI和中性蛋白酶I，或胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI。所述細(xì)胞消化液用于如上所述的魚類腸道細(xì)胞的分離。
[0032]其中，所述膠原蛋白酶XI和中性蛋白酶I的重量比為4:1，或者所述胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的重量比為1:1.2。
[0033]本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，0.0lmg/ml胰島素，0.02mg/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白，10mmol/L HEPES, 100IU/ml 青霉素和 100IG/ml 鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基pH為7.4。
[0034]優(yōu)選地，所述方法所用液體經(jīng)過0.22 μ m無菌篩進(jìn)行過濾。
[0035]清洗培養(yǎng)基中所用青霉素和鏈霉素濃度分別是培養(yǎng)用培養(yǎng)基中青霉素和鏈霉素的二倍。清洗培養(yǎng)基中的青霉素和鏈霉素用于殺菌；培養(yǎng)用培養(yǎng)基中的青霉素和鏈霉素用于抑制細(xì)菌生長，由于高濃度青霉素和鏈霉素會對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因此采用含適宜濃度的抗生素如青霉素和鏈霉素對得到合適的細(xì)胞分離結(jié)果至關(guān)重要。
[0036]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提出了一種用于分離魚類腸上皮細(xì)胞的方法，所述方法采用的原料簡單易得，價格低廉，所述方法操作簡單，分離得到的腸上皮細(xì)胞穩(wěn)定，成功率高，無污染。
【附圖說明】
[0037]圖1為魚類腸道上皮細(xì)胞最初分離時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍(酶液為重量比為1:1.2的胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的混合液)。
[0038]圖2為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)2天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍(酶液為重量比為1:1.2的使用胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的混合液)。
[0039]圖3為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)4天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍(酶液為重量比為1:1.2的使用胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的混合液)。
[0040]圖4為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)8天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍(酶液為重量比為1:1.2的使用胰蛋白酶和膠原蛋白酶XI的混合液)。
[0041]圖5為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)4天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍(酶液為重量比為4:1的使用膠原蛋白酶XI和中性蛋白酶的混合液)。
[0042]圖6為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)使用不同清洗手段，2天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200 倍。
[0043]圖7為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)使用單一酶液(膠原蛋白酶XI)消化細(xì)胞，1天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍。
[0044]圖8為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)使用單一酶液消化細(xì)胞(胰蛋白酶消化lOmin)，1天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍。
[0045]圖9為魚類腸道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)使用單一酶液消化細(xì)胞(胰蛋白酶消化20min)，1天時細(xì)胞形態(tài)圖，顯微鏡200倍。
【具體實施方式】
[0046]結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0047]本發(fā)明給予的實施例是為了更好的講解說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實施例。相關(guān)技術(shù)人員在不背離創(chuàng)新宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明的任一步驟進(jìn)行合理改進(jìn)。
[0048]實施例1魚類腸上皮細(xì)胞的分離
[0049](一 )實施動物:80g左右羅非魚
[0050](二)實驗試劑:Hanks平衡鹽(sigma公司)，DMEM(gibco公司)，胎牛血清(gibco公司)，膠原蛋白酶XI (sigma公司)，胰蛋白酶(sigma公司)，胰島素(sigma公司)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(sigma 公司)，HEPES (sigma 公司)
[0051](三)實施步驟:將實驗所需試劑過0.22 μm無菌篩；將實驗所需六孔細(xì)胞板鋪上0.01 g/ml明膠37 °C孵育lhr，棄掉明膠。取80g羅非魚在28 V過夜曝氣靜水中饑餓約24hr，后麻醉。在無菌環(huán)境下取出魚腸道整腸，短暫在75%酒精中浸泡，去除末端2cm，將整腸浸泡在Hanks平衡鹽溶液中，剪成約1cm小段，清洗內(nèi)容物，進(jìn)行第一遍清潔。后換成含二倍濃度雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，將腸段剖開，洗凈內(nèi)容物。該過程重復(fù)八次。將洗凈的腸組織收入10ml離心管加入lmg/ml胰蛋白酶6ml，水浴搖床lOmin后，800rpm離心倒掉上清。向離心管中加入1.2mg/ml膠原蛋白酶XI 6ml，重懸，水浴搖床20mi