脂肪酸酯的生產(chǎn)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于從糖類生產(chǎn)至少一種脂肪酸酯的生物技術(shù)方法和細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酸酯在商業(yè)上可以用于若干目的。例如，生物柴油（一種替代燃料）包含酯 (例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等）。一些低分子量的酯是揮發(fā)性的，具有令人愉快的氣味， 這使得它們可用作芳香劑或調(diào)味劑。脂肪酸酯也被用作大漆、油漆、清漆等的溶劑。酯也可 以用作樹脂和塑料中的軟化劑，增塑劑、阻燃劑，以及在汽油和油中的添加劑。此外，酯可以 在聚合物、薄膜、紡織品、染料和藥品的制造中使用。因此，脂肪酸酯在當(dāng)今時代是非常有用 的。
[0003] 可以從石油中提取脂肪酸酯。但是這種方法耗能且昂貴。并且，由于頻繁裂化粗 石油中的長鏈烴以產(chǎn)生更小的單體，這是個低效的方法。然后這些單體被用作原材料以制 造更復(fù)雜的特殊化學(xué)品。裂化汽油或石油的這種方法是對環(huán)境有害的。并且，由于這些起 始材料的成本與石油價格掛鉤，以及預(yù)期未來石油價格增長，制備這些脂肪酸酯的成本也 相對于石油價格的增長而增長。
[0004] 由于石油造成的固有挑戰(zhàn)，因而存在對于不需要像石油那樣經(jīng)勘探、提取、長距離 運輸、或充分精煉的可再生的石油來源的需要。還存在對于能夠經(jīng)濟地生產(chǎn)，且不會引起像 石油工業(yè)和基于石油的燃料燃燒所產(chǎn)生的環(huán)境破壞的可再生石油來源的需要。
[0005] 在若干生物燃料中可以發(fā)現(xiàn)脂肪酸酯。然而，來自這些生物燃料和/或基于植物 的燃料的脂肪酸酯產(chǎn)率低。因此，需要開發(fā)脂肪酸酯的替代生物來源。一個選項是為了有 效生產(chǎn)脂肪酸酯而重組改造微生物物種。
[0006] 已知脂肪酸酯是?；o酶A分子和任何鏈長的醇之間（有時在蠟酯合酶的存在 下）的縮合反應(yīng)的產(chǎn)物。例如，脂肪酸酯可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丁醇、2-甲基丁 醇、3-甲基丁醇、或戊醇與酰基輔酶A分子的縮合產(chǎn)物。一些情況下，可以通過向培養(yǎng)基中 供應(yīng)反應(yīng)中用到的醇（例如，甲醇或乙醇）來生產(chǎn)脂肪酸酯，如脂肪酸甲基酯（"FAME"）或 脂肪酸乙酯（"FAEE"）。類似地，可以通過供應(yīng)脂肪醇來生產(chǎn)蠟酯。
[0007] 大多數(shù)脂肪酸酯具有上述有用的功能。這些酯之一，月桂酸甲酯 CH3(CH2)1。⑶OCH3(水不溶性、透明的、無色酯）在商品化工業(yè)包括制藥和化妝品工業(yè)上有若 干用途。
[0008] 然而，目前用于制備脂肪酸酯的方法是效率低的，因為它們產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，其 導(dǎo)致資源浪費。并且，當(dāng)前可用的方法不允許選擇特定的脂肪酸酯。因而存在對于更節(jié)能 且特定地生產(chǎn)脂肪酸酯包括月桂酸甲酯的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明嘗試通過提供至少一種從遺傳改造的微生物生產(chǎn)脂肪酸酯的方法來解決 上述問題。特別地，所述脂肪酸酯在外源醇，如外源性乙醇、外源性甲醇等存在下，通過培養(yǎng) 被遺傳改造以產(chǎn)生脂肪酸和表達至少一種蠟酯合酶的微生物來生產(chǎn)。
[0010] 根據(jù)一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)至少一種脂肪酸酯的微生物細(xì)胞，其中所述 細(xì)胞被遺傳修飾以包含：
[0011]-至少一個第一遺傳突變，其使所述細(xì)胞產(chǎn)生至少一種脂肪酸和/或其?；o酶 A，其中所述脂肪酸包含至少5個碳原子；和
[0012] -至少一個第二遺傳突變，其相對于野生型細(xì)胞增加所述細(xì)胞中至少一種蠟酯合 酶的活性，且所述蠟酯合酶具有與SEQ ID NO :1-8的多肽及其組合，或與任何用于催化脂肪 酸和/或其?；o酶A轉(zhuǎn)化為脂肪酸酯的多肽的功能性片段至少50%的序列同一性。
[0013] 特別地，所述細(xì)胞能夠通過細(xì)胞中相對于野生型細(xì)胞的丙二酸單酰輔酶A依賴性 和丙二酸單酰ACP非依賴性脂酰輔酶A代謝途徑的增加的酶活性來生產(chǎn)脂肪酸和/或其酰 基輔酶A。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的任何方面的微生物細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。其可以是哺乳 動物細(xì)胞（諸如，例如人的細(xì)胞）、植物細(xì)胞或微生物如酵母、真菌或細(xì)菌，其中，可以使用 微生物，具體是細(xì)菌和酵母。
[0015] 合適的細(xì)菌、酵母或真菌具體是作為細(xì)菌、酵母或真菌菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏庫 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))GmbH(DSMZ)，Brunswick， Germany的那些細(xì)菌、酵母或真菌根據(jù)本發(fā)明合適的細(xì)菌屬于http ://www. dsmz. de/ species/bacteria. htm列出的屬，根據(jù)本發(fā)明合適的酵母屬于http ://www. dsmz. de/ species/yeasts. htm列出的那些屬，且根據(jù)本發(fā)明合適的真菌為http ://www. dsmz. de/ species/fungi. htm 列出的那些D
[0016] 具體而言，所述細(xì)胞可以選自屬：曲霉屬（Aspergillus)、棒桿菌屬 (Corynebacterium)、短桿菌屬（Brevibacterium)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、不動桿菌 屬（Acinetobacter)、產(chǎn)喊桿菌屬（Alcaligenes)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、副球菌 屬（Paracoccus)、乳球菌屬（Lactococcus)、念珠菌屬（Candida)、畢赤酵母屬（Pichia)、 漢森酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、酵母屬（Saccharomyces)、埃 希氏菌屬（Escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬（Zymomonas)、耶氏酵母屬（Yarrowia)、甲基桿 菌屬（Methylobacterium)、雷爾氏菌屬（Ralstonia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、紅螺 菌屬（Rhodospirillum)、紅細(xì)菌屬（Rhodobacter)、伯克氏菌屬（Burkholderia)、梭菌 屬（Clostridium)和貪銅菌屬（Cupriavidus) tj更具體而言，所述細(xì)胞可以選自構(gòu)巢曲 霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、廣泛產(chǎn)喊菌（Alcaligenes Iatus)、巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、黃 色短桿菌（Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)、 須芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis)、巴西伯克氏菌（Β· brasilensis)、 Β· caledonica、加勒比伯克氏菌（Β· caribensis)、石竹伯克氏菌（Β· caryophylli)、 B.fungorum、唐菖蒲伯克氏菌（B. gladioli)、格氏伯克氏菌（B.glathei)、莢殼伯克氏菌 (B. glumae)、B. graminis、B. hospita、B. kururiensis、吩嗪伯克氏菌（B. phenazinium)、 B. phymatum、B. phytofirmans、植物伯克氏菌（B. plantarii)、B. sacchari、新加坡伯 克氏菌（Β· singaporensis)、Β· sordidicola、Β· terricola、Β· tropica、Β· tuberum、 B. ubonensis、B. unamae、B. xenovorans、B. anthina、P比略伯克氏菌（B. pyrrocinia)、泰國 伯克氏菌（B.thailandensis)、布蘭克念珠菌（Candida blankii)、皺糟念珠菌（Candida rugosa)、谷氨酉愛棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)、Corynebacterium efficiens、 大腸桿菌（Escherichia coli)、多形漢森酵母（Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵 母（Kluveromyces Iactis)、扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens)、善變副球 菌（Paracoccus versutus)、阿根廷假單胞菌（Pseudomonas argentinensis)、P.borbori、 香茅醇假單胞菌（P. citronellolis)、變黃假單胞菌（P. flavescens)、門多薩假單胞菌 (P. mendocina)、硝基還原假單胞菌（P. nitroreducens)、食油假單胞菌（P. oleovorans)、 類產(chǎn)堿假單胞菌（Ρ· pseudoalcaligenes)、食樹脂假單胞菌（Ρ· resinovorans)、 稻草假單胞菌（P. straminea)、桔黃假單胞菌（P. aurantiaca)、致金色假單胞菌 (P. aureofaciens)、綠針假單胞菌（P. chlororaphis)、莓實假單胞菌（P. fragi)、隆德假 單胞菌（P. Iundensis)、腐臭假單胞菌（P.taetrolens)、P.antarctica、產(chǎn)氮假單胞菌 (P. azotoformans)、Φ. blatchfordae'、P. brassicacearum、P. brenneri、P. cedrina、皺紋 假單胞菌（Ρ· corrugata)、焚光假單胞菌（Ρ· fluorescens)、Ρ· gessardii、Ρ· libanensis、 P. mandelii、邊緣假單胞菌（P. marginalis)、地中海假單胞菌（P. mediterranea)、 P. meridiana、P. migulae、霉味假單胞菌（P. mucidolens)、P. orientalis、人參假單 胞菌（P. panacis)、P. proteolytica、羅氏假單胞菌（P. rhodesiae)、類黃假單胞菌 (P. synxantha)、賽維瓦爾假單胞菌（P. thivervalensis)、托拉氏假單胞菌（P. tolaasii)、 韋龍氏假單胞菌（P. veronii)、脫氮假單胞菌（P. denitrificans)、百日咳假單胞菌 (P. pertucinogena)、P. cremoricolorata、黃褐假單胞菌（P. fulva)、蒙氏假單胞菌 (P. monteilii)、摩氏假單胞菌（P. mosselii)、P. parafulva、惡臭假單胞菌（P. putida)、 巴利阿里假單胞菌（P. balearica)、施氏假單胞菌（P. stutzeri)、扁桃假單胞菌 (P. amygdali)、榛色假單胞菌（P. avellanae)、番木瓜假單胞菌（P. caricapapayae)、 菊苣假單胞菌（P. cichorii)、暈斑假單胞菌（P. coronafaciens)、無花果假單胞菌 (P. ficuserectae)、'向日葵假單胞菌（P. helianthi) '、苦楝假單胞菌（P. meliae)、薩氏 假單胞菌（P. savastanoi)、丁香假單胞菌（P. syringae)、番前假單胞菌（P. tomato)、綠黃 假單胞菌（P. viridiflava)、P. abietaniphila、嗜酸假單胞菌（P. acidophila)、傘菌假單 胞菌（P. agarici)、嗜堿假單胞菌（P. alcaliphila)、解堿假單胞菌（P. alkanolytica)、淀 粉皮假單胞菌（P. amylodera