本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分泌抗1-氨基-乙內(nèi)酰脲單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

呋喃妥因(Nitrofurantoin，CAS No.67-20-9)，屬于硝基呋喃類藥物，是一種人工合成的抗菌藥，常作為廣譜類抗生素用于預(yù)防和治療由沙門(mén)氏菌和埃希氏菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病。但近年來(lái)的研究表明，硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能誘發(fā)癌癥，因而引起了人們的高度重視，多國(guó)已禁止了此類藥物在治療和飼料中的使用。

由于硝基呋喃類藥物的熱和化學(xué)不穩(wěn)定性，常以檢測(cè)其代謝產(chǎn)物1-氨基-乙內(nèi)酰脲(AHD)作為殘留標(biāo)示物判定動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程是否使用呋喃妥因。

目前，AHD殘留的檢測(cè)方法主要有液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫膠體金法(GICT)，LC-MS/MS法具有定量精度高的特點(diǎn)，但儀器成本高、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，因而不適用于基層單位的應(yīng)用，無(wú)法滿足農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)準(zhǔn)入和產(chǎn)地準(zhǔn)出制度實(shí)施后對(duì)檢測(cè)方法時(shí)效性的需求。ELISA和GICT是利用抗體與抗原的高特異性、高靈敏度反應(yīng)為核心發(fā)展起來(lái)的免疫學(xué)檢測(cè)方法。ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、可實(shí)現(xiàn)高通量定量檢測(cè)；缺點(diǎn)是試劑盒需冷藏保存、反應(yīng)過(guò)程需控制溫度，主要適用于大批量樣品的檢測(cè)和基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。GICT法檢測(cè)靈敏度略低于ELISA法，但具有操作簡(jiǎn)便、快速、且試劑盒可在常溫保存等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合開(kāi)展快速檢測(cè)。

開(kāi)發(fā)藥物殘留檢測(cè)免疫試劑盒所面臨的主要難題除了檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性問(wèn)題，還有其核心原料(抗體)批量小、批間差異大且價(jià)格昂貴。出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性分別是由于方法的特異性和靈敏度不夠，而免疫學(xué)檢測(cè)方法的特異性和靈敏度又主要由抗體所決定。常用的單克隆抗體生產(chǎn)方法是將雜交瘤細(xì)胞輸入動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)動(dòng)物腹部膨大產(chǎn)生腹水時(shí)，再抽取腹水獲得抗體，如CN 105586316 A公開(kāi)了的一種呋喃妥因殘留標(biāo)示物氨基乙內(nèi)酰脲的單克隆抗體制備方法，但此方法不足之處為小鼠腹水量少而且動(dòng)物個(gè)體差異使每只動(dòng)物所產(chǎn)抗體的質(zhì)量和產(chǎn)量均有較大差異，從而造成抗體批量小且批間差異大；而有些國(guó)家和地區(qū)禁止在動(dòng)物體內(nèi)制備抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種分泌抗1-氨基-乙內(nèi)酰脲單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，該雜交瘤細(xì)胞株能夠在體外培養(yǎng)條件下大量分泌高靈敏度、高特異性的抗1-氨基-乙內(nèi)酰脲的單克隆抗體。

一種分泌抗1-氨基-乙內(nèi)酰脲單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為雜交瘤細(xì)胞株2G9A3-35H11，已于2015年8月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2015141；中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心。

本發(fā)明提供了所述雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)1-氨基-乙內(nèi)酰脲的試劑盒或試紙條中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種所述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，包括：

(1)將牛血清白蛋白和1-氨基乙內(nèi)酰脲-4-羧苯基肟混合制備偶聯(lián)物，再用所述偶聯(lián)物免疫動(dòng)物，獲得脾細(xì)胞。

(2)將所述脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選、克隆后，獲得所述雜交瘤細(xì)胞株；

所述1-氨基乙內(nèi)酰脲-4-羧苯基肟與牛血清白蛋白的投料摩爾比為30～60:1；所述偶聯(lián)物的偶聯(lián)率為3～20:1。

具體地，步驟(1)中，利用對(duì)醛基苯甲酸對(duì)呋喃妥因代謝物1-氨基乙內(nèi)酰脲(1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD)進(jìn)行衍生化，衍生物1-氨基乙內(nèi)酰脲-4-羧苯基肟(AHD-CP)與牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶聯(lián)生成AHD-CP-BSA，高分辨率離子肼質(zhì)譜法對(duì)聯(lián)物進(jìn)行驗(yàn)證。

作為優(yōu)選，AHD-CP與牛血清白蛋白的投料摩爾比為30:1；所述偶聯(lián)物的偶聯(lián)比平均值為5.48:1。

步驟(2)中，所述脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，用AHD-CP與AHD-CP–OVA(AHD-CP與卵清蛋白偶聯(lián)物)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)法篩選、經(jīng)克隆后，獲得所述雜交瘤細(xì)胞株。

作為優(yōu)選，所述的篩選和克隆在無(wú)抗菌素的條件下進(jìn)行。

具體地，所述的動(dòng)物為BALB/c小鼠。所述骨髓瘤細(xì)胞為復(fù)壯的SP2/0細(xì)胞。

所述雜交瘤細(xì)胞株的抗體基因型：重鏈(IgG)V基因?yàn)镸usmus IGHV6-6*02F，J基因?yàn)镸usmus IGHJ1*03F，D基因?yàn)镸usmus IGHD2-5*01F；輕鏈(kappa)V基因?yàn)镸usmus IGKV9-124*01F。

本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體由所述的雜交瘤細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。

具體地，所述單克隆抗體的亞型為IgG1k鏈，與呋喃妥因代謝物有特異性反應(yīng)。

作為優(yōu)選，所述單克隆抗體通過(guò)雜交瘤細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株體外培養(yǎng)的方式獲得。

具體地，本發(fā)明采用雜交瘤細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞上清液，再利用硫酸銨沉淀法和透析法獲得初步純化的抗體。

本發(fā)明還提供了所述的單克隆抗體在檢測(cè)動(dòng)物源食用農(nóng)產(chǎn)品殘留1-氨基-乙內(nèi)酰脲中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)1-氨基-乙內(nèi)酰脲的試劑盒，含有所述的單克隆抗體。

具體地，所述的試劑盒中含有所述雜交瘤細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體、酶標(biāo)板、1-氨基-乙內(nèi)酰脲標(biāo)準(zhǔn)品，酶標(biāo)記物(酶標(biāo)二抗)、底物和終止液，其中，酶標(biāo)板上包被有人工合成的抗原(競(jìng)爭(zhēng)物)。使用時(shí)，待檢樣品與抗體加入酶標(biāo)板完成反應(yīng)后，再加入酶標(biāo)記物，若樣品中含有呋喃妥因代謝物，則會(huì)與酶標(biāo)板上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，再加入底物反應(yīng)，終止顯色。顯色強(qiáng)度與樣品中殘留的1-氨基-乙內(nèi)酰脲量成反比。根據(jù)1-氨基-乙內(nèi)酰脲標(biāo)準(zhǔn)品做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中的呋喃妥因代謝物的含量。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)1-氨基-乙內(nèi)酰脲的試紙條，包括：樣品墊、標(biāo)記物墊、反應(yīng)膜和吸樣墊，所述標(biāo)記物墊包被有膠體金或酶標(biāo)記的所述的單克隆抗體。

本發(fā)明的試紙條中，所述反應(yīng)膜的檢測(cè)線(T線)處包被有AHD-CP-牛血清蛋白偶聯(lián)物(AHD-CP-BSA)，所述反應(yīng)膜的質(zhì)控線(C線)處包被有二抗。所述二抗選用羊抗鼠IgG。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為：

本發(fā)明以AHD-CP與牛血清白蛋白形成的偶聯(lián)物為抗原，免疫BALB/c小鼠，再將免疫后得到的脾臟細(xì)胞與復(fù)壯的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，并采用不添加抗菌素的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)多次篩選和克隆獲得雜交瘤細(xì)胞株；該雜交瘤細(xì)胞株在體外培養(yǎng)時(shí)可大量分泌抗AHD衍生化產(chǎn)物的特異性抗體，可用于呋喃妥因代謝物的快速、準(zhǔn)確免疫檢測(cè)和免疫分析。

附圖說(shuō)明

圖1為免疫抗原(AHD-CP-BSA)的質(zhì)譜圖；

圖2為生物膜干涉法驗(yàn)證陽(yáng)性克隆抗原-抗體間親和力；

圖3為生物膜干涉法測(cè)試不同濃度AHD-CP對(duì)抗原-抗體反應(yīng)的抑制效果；

圖4為雜交瘤細(xì)胞株2G9A3-35H11的染色體標(biāo)本；

圖5為單抗對(duì)AHD-CP競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6為重組純化蛋白(Protein G)純化抗體電泳圖；

圖7為免疫膠體金試劑條檢測(cè)添標(biāo)樣本及同類藥物交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

雜交瘤細(xì)胞株2G9A3-35H11于2015年8月26日送達(dá)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，該細(xì)胞株的存活性于2015年9月10日檢測(cè)結(jié)果為存活，保藏編號(hào)CCTCC No:C2015141。

該雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)呋喃妥因代謝物的衍生物(AHD-CP)與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)物(AHD-CP-BSA)為抗原免疫BALB/c小鼠，將免疫后小鼠的脾臟細(xì)胞與經(jīng)復(fù)壯的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用不添加抗菌素的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)篩選和6次克隆獲得。具體過(guò)程如下：

1、半抗原合成

稱取300mg對(duì)4-羧基苯甲醛(4-Carboxybenzaldehyde,4-CBA)于1mL蒸餾水中，滴加二甲基亞砜(DMF)至4-CBA完全溶解，攪拌中加入100mg呋喃妥因代謝物1-氨基-2-乙內(nèi)酰脲(1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD)，37℃反應(yīng)16h，冷卻至室溫，過(guò)濾水洗得白色固體即為呋喃妥因代謝物的4-羧基苯甲醛衍生物(AHD-CP)。

2、抗原的合成

2.1免疫抗原合成

2.1.1稱取28mg AHD-CP溶于2mL DMF，攪拌中加入30mg DCC，15mg NHS，4℃反應(yīng)4h，4000r/min離心10min，上清液為A液。

2.1.2稱取牛血清白蛋白(BSA)250mg，溶于10ml 0.1mol/L PBS(pH＝8.0)緩沖溶液中，加入DMF 1mL，溶解制備B液。

2.1.3攪拌下A液逐滴加入B液中，密封燒杯，4℃反應(yīng)16h。

2.1.4將反應(yīng)液5000r/min離心10min，取上清液，再用PBS(pH＝7.4)4～10℃透析，每天換PBS 3次，透析3天后收集免疫抗原(AHD-CP-BSA)溶液。

2.1.5用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定AHD-CP-BSA(抗原批號(hào)：130305-1)濃度為7.45mg/mL。

2.1.6抗原鑒定：用高分辨率離子肼質(zhì)譜檢測(cè)AHD-CP-BSA出現(xiàn)雙峰，其主峰和次峰分子量分別為67284.7989、71220.4375(見(jiàn)圖1)，以相同方法測(cè)得BSA分子量為66366.2578，計(jì)算偶聯(lián)比為：

據(jù)此得出偶聯(lián)比分布區(qū)間為3～20，且主要集中分布于3～4之間。

2.1.7將抗原分裝，于－20℃冰箱保存。

2.1.8通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)AHD-CP：BSA摩爾投料比為6：1～300：1合成的免疫抗原，結(jié)合后續(xù)的免疫試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)投料比為30：1～60：1可獲得較抗體效價(jià)和抑制率較高的動(dòng)物血清。

2.2包被原合成

將BSA換成100mg OVA，以同樣的方法合成包被抗原(AHD-CP-OVA)。

3.免疫動(dòng)物

首次免疫劑量約為100μg/只，例如取7.45mg/mL AHD-CP-BSA溶液40μL+110μLPBS+150μL弗氏完全佐劑，充分乳化后，免疫3只6周齡的Balb/c小鼠，每只分4～5點(diǎn)(每點(diǎn)約0.2mL)皮下注射；第2次～第5次免疫抗原劑量為60μg/只，加弗氏不完全佐劑乳化，每隔2周免疫1次，腹腔免疫與皮下免疫間隔實(shí)施；第5次免疫3周后，以100μg/只的劑量從尾靜脈加免。

4.血清抗體的檢測(cè)

從第3次免疫開(kāi)始，每次免疫第10天從小鼠尾部或眼框少量采血，用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)和AHD-CP對(duì)抗原抗體反應(yīng)的抑制率。

ELISA檢測(cè)方法：以pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋將AHD-CP-OVA稀釋成500ng/mL的包被液，100μL/孔加入96孔板酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，洗板后每孔加150μL 10％脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)，洗板后陰干備用；將血清用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)做10²～10⁷倍梯度稀釋測(cè)定抗體效價(jià)；用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)抑制率，即在對(duì)照孔中加50μL PBS，在競(jìng)爭(zhēng)孔中加50μL 100ng/mL AHD-CP標(biāo)準(zhǔn)溶液，將血清稀釋至適當(dāng)濃度，對(duì)照孔和競(jìng)爭(zhēng)孔各加入50μL血清稀釋液，后續(xù)步驟按間接ELISA方法操作；選對(duì)照孔OD值為0.8～1.2稀釋度的一組計(jì)算抑制率。

抑制率(％)＝[1﹣(OD_{競(jìng)爭(zhēng)孔}-OD_空白)/(OD_{對(duì)照孔}-OD_空白)]×100。

本發(fā)明所涉及的雜交瘤細(xì)胞株的脾細(xì)胞來(lái)源于經(jīng)6次免疫的Balb/c小鼠，第五次免疫后10天所采的血清，用ELISA方法測(cè)得其效價(jià)為6.4×10⁵，對(duì)100ng/mL AHD-CP標(biāo)準(zhǔn)溶液的抑制率為56％，10天后，以100μg/只的劑量從尾靜脈進(jìn)行第六次免疫，3天后取小鼠脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合。

5.SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的復(fù)壯

將5×10⁶個(gè)/mL的SP2/0細(xì)胞分多點(diǎn)注入Balb/c小鼠背部皮下，每點(diǎn)0.1～0.2mL，當(dāng)瘤體膨大至直徑為0.3～0.5cm時(shí)，融合當(dāng)天將小鼠引椎處死，在無(wú)菌條件下取出瘤體，將其制成細(xì)胞懸液，采用密度梯度離心法純化SP2/0細(xì)胞。

6.細(xì)胞融合

飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前1天，取一只6周齡的空白小鼠引椎處死，在無(wú)菌條件下先后取腹水和脾臟；腹水用1640培養(yǎng)基稀釋→400g離心8min→沉淀用1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)制成40mL細(xì)胞懸液；將脾臟研碎→過(guò)篩→400g離心8min，沉淀用培養(yǎng)基重新制成懸液，再離心1次→用1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)制成160mL細(xì)胞懸液；取40mL脾臟細(xì)胞懸液與40mL腹水細(xì)胞懸液混合，以200μl/孔鋪4塊細(xì)胞培養(yǎng)板；其余的脾臟細(xì)胞懸液再以200μl/孔，鋪6塊板；將10板飼養(yǎng)細(xì)胞在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)24h。

細(xì)胞融合：融合當(dāng)天，將AHD-CP-BSA免疫后的小鼠引椎處死→在無(wú)菌條件下取脾臟→取5.8×10⁷個(gè)脾細(xì)胞與6.3×10⁶個(gè)SP2/0細(xì)胞在0.8mL 50％PEG4000介導(dǎo)下融合→經(jīng)200g，12min低速離心去除PEG后，向融合細(xì)胞中慢慢加入40mL 1640培養(yǎng)基(含20％胎牛血清+10％HAT)，小心混勻后→以40μL/孔加入含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，共鋪了10塊板。

7.細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)；融合后第1～2周，用1640培養(yǎng)基+12％胎牛血清+2％HAT的選擇培養(yǎng)基；第3～4周，將2％HAT改為加2％HT的過(guò)渡培養(yǎng)基；第5周后，停用HT，并將胎牛血清添加量降為10％。篩選板在第10天和第20天各補(bǔ)充一次飼養(yǎng)細(xì)胞，為了提高細(xì)胞活力和分泌抗體的特異性，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不添加任抗菌素。

8.陽(yáng)性孔篩選

細(xì)胞融合后第三天開(kāi)始，每天觀察雜交瘤細(xì)胞狀況，第4天在顯微鏡觀察到已有少量雜交瘤細(xì)胞開(kāi)始增殖→第6天，第一次半換液，即每孔吸取100μL培養(yǎng)基上清用于檢測(cè)抗體，加入100μL新鮮的HAT選擇培養(yǎng)基→第7天，陽(yáng)性孔再取培養(yǎng)基做競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，根據(jù)AHD-CP對(duì)抗體-包被抗原(AHD-CP-OVA)ELISA反應(yīng)的抑制率篩選陽(yáng)性孔→根據(jù)細(xì)胞增殖情況，每2～4天做一次半換液，換出了舊培養(yǎng)基用ELISA方法測(cè)抗體效價(jià)→檢出抗體陽(yáng)性孔，再取樣做適當(dāng)梯度稀釋后，檢測(cè)AHD-CP對(duì)ELISA反應(yīng)的抑制率→選一部分陽(yáng)性孔用生物膜干涉法驗(yàn)證抗體對(duì)抗原親和力(見(jiàn)圖2)和不同濃度AHD-CP對(duì)抗體-抗原反應(yīng)的抑制效果(見(jiàn)圖3)。

9、單克隆細(xì)胞株的建立

細(xì)胞融合后第7天所采集細(xì)胞上清中，競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢出2G9陽(yáng)性孔100ng/mL AHD-CP抑制率為85.6％，第8天對(duì)其進(jìn)行單克隆→2G9克隆后第6天，測(cè)得A3孔100ng/mL AHD-CP抑制率為88％，10ng/mL AHD-CP抑制率為79％，對(duì)其進(jìn)行亞克隆→2G9A3亞克隆后第10天，測(cè)得F1孔1ng/mL AHD-CP抑制率為69％→再經(jīng)過(guò)3次亞克隆獲得本次融合的雜交瘤細(xì)胞株2G9A3-35H11。

2G9A3-35H11細(xì)胞株擴(kuò)增后，將其F₁代凍存10管，F(xiàn)₂代凍存35管，F(xiàn)₃代凍存80管。其中10管F₂代細(xì)胞于2015年8月26日送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該培養(yǎng)物的存活性由保藏中心于2015年9月10日檢測(cè)完畢，結(jié)果為存活，保藏編號(hào)為CCTCC No:C2015141。

10、雜交瘤細(xì)胞染色體標(biāo)本的制作

取一瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2G9A3-35H11細(xì)胞，加入100μg/mL的秋水仙素，至終濃度為0.1μg/mL，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)約30min后，刮下細(xì)胞，離心去上清，收集細(xì)胞；加入8mL 0.075mol/L的氯化鉀，低滲處理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)進(jìn)行預(yù)固定，用吸管輕輕吹打混勻細(xì)胞，200g離心6min，去上清；再加入8mL固定液，用吸管輕輕吹打混勻細(xì)胞，室溫下靜置30min后，200g離心6min，棄上清液，依法重復(fù)固定2次；棄上清液，視細(xì)胞數(shù)量余留適量固定液，輕輕吹散細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的潔凈載玻片上，在酒精燈上過(guò)火，室溫下陰干。將陰干的玻片標(biāo)本加入Giemsa染液，并進(jìn)一步做G顯帶處理。選35個(gè)分裂象做眾數(shù)分析，染色體數(shù)目為72-94條，平均染色體數(shù)為85條(圖4)。

11、雜交瘤細(xì)胞抗體基因型檢測(cè)

刮取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2G9A3-35H11細(xì)胞→離心，去上清→沉淀中加入Trizol裂解細(xì)胞→提取RNA→5’RACE反轉(zhuǎn)錄cDNA→PCR獲得抗體重鏈/輕鏈可變區(qū)基因→重鏈及輕鏈可變區(qū)基因克隆測(cè)序→3’RACE反轉(zhuǎn)錄cDNA→PCR獲得抗體重鏈/輕鏈恒定區(qū)基因→恒定區(qū)基因克隆測(cè)序→分析測(cè)序結(jié)果(表1)。

表1抗體基因型分析及等位基因一致性的比較

實(shí)施例2

2G9A3-35H11細(xì)胞株的F₃代用于生產(chǎn)單克隆抗體，抗體的制備方法可采用體內(nèi)制備法或體外制備法。

1、AHD單克隆抗體的體內(nèi)制備

6周齡的雄性Balb/c小鼠，提前2周在其腹腔注射0.5mL液體石臘→取2×10⁶的F₃代雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠腹腔→7～12天后，當(dāng)小鼠稍有膨大時(shí)，再次注射1×10⁶的雜交瘤細(xì)胞→2～5天后，當(dāng)小鼠腹部膨大時(shí)，用大號(hào)針頭抽取腹水→將小鼠引椎處死，用PBS沖洗其腹腔，收集沖洗液，合并入腹水→純化抗體，每只小鼠可獲得5～15mg抗體。

2、AHD單克隆抗體的體外→制備

2G9A3-35H11細(xì)胞株接入玻璃細(xì)胞瓶，加1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)→當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞上清液，并將1瓶細(xì)胞分成2～4瓶，并加入新鮮培養(yǎng)基；約48小時(shí)后，再收集細(xì)胞上清液；此后，約2～3天收集1次細(xì)胞上清液，并將培養(yǎng)量擴(kuò)大2～4倍，控制細(xì)胞量不超過(guò)60％培養(yǎng)瓶底面積。收集細(xì)胞上清液立即加入等體積的飽和硫酸銨，4℃放置2～16小時(shí)，10000g離心30min；棄上清，沉淀用0.02mol·L^-1PBS溶解，再加入50％試樣體積的飽和硫酸銨，搖勻后4℃放置2小時(shí)，10000g離心30min，棄沉淀，取上清；加飽和硫酸銨至占總體積的42％，4℃放置2小時(shí)后10000g離心30min，棄上清，沉淀經(jīng)透析后獲得初步純化抗體，測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)10個(gè)工作日的培養(yǎng)，可獲得2～5g抗體，相比之下，體外制備法的產(chǎn)量和均一性高于體內(nèi)制備法。將抗體小管分裝后，部分冷凍干燥后-20℃保存，其它直接-80℃保存。

將初步純化抗體梯度稀釋后用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)為2.4×10⁶；選取20000倍稀釋度，分別用0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mLAHD-CP標(biāo)準(zhǔn)溶液做競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)得細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中單克隆抗體(單抗)對(duì)AHD-CP的50％抑制濃度(IC₅₀)為0.332ng/mL(圖5)，該單抗與AHD-NP的交叉反應(yīng)率為106％，與呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃西林代謝物(SEM)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、青霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和磺胺嘧啶等其它類別的抗菌素交叉反應(yīng)率＜0.5％。

3、抗體亞型的確定

通過(guò)IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP檢測(cè)，本發(fā)明細(xì)胞株所產(chǎn)抗體亞型為IgG1kchain(kappa chain)。

4、抗體的純化和保存

用Protein G對(duì)抗體進(jìn)一步純化，以0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH2.8)洗脫抗體后，立即用1mol/L的Tris-HCl(pH＝9.0)將洗脫液pH值調(diào)至中性，獲得高純抗體。用間接ELISA方法檢測(cè)純化前、后抗體效價(jià)，流穿液(CT)中未檢測(cè)到抗體效價(jià)。將純化后抗體、CT和細(xì)胞上清做SDS-PAGE電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示高純抗體重鏈和輕鏈的分子量分別約為55kd和25kd(圖6)，無(wú)其它雜帶，電泳結(jié)果表明：抗體已高度純化，流穿液和細(xì)胞上清中的雜蛋白主要是BSA。

將純化的抗體用30K超濾離心管濃縮至2mg/mL，無(wú)菌分裝，經(jīng)冷凍干燥后，密封-20℃保存。

實(shí)施例3ELISA方法檢測(cè)雞肉中呋喃妥因代謝物(初步純化抗體的應(yīng)用)

(1)包被：以pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋AHD-CP-OVA至300ng/mL，100μL/孔加入酶標(biāo)板微孔條中，4℃過(guò)夜，洗板后每孔加200μL 10％脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)，洗板后陰干備用。

(2)樣本預(yù)處理：準(zhǔn)備雪山麻雞胸肌樣本3個(gè)，稱取1±0.05g的均質(zhì)樣本，每個(gè)樣本稱12份，以1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別做0、0.2、0.5、1.0μg/kg添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。每份試樣中加入4mL去離子水、0.5mL 1mol/L鹽酸和100μL 0.01mol/L2-硝基苯甲醛(2-NP)溶液，置于56℃水浴2h，加入5mL 0.1mol/L K₂HPO₄、0.4mL 1mol/LNaOH和5mL乙酸乙酯，旋渦3min，4000r/min離心10min。取出2.5mL乙酸乙酯到另一試管中氮?dú)獯蹈伞Ｓ?mL正己烷溶解干燥物，用1mL PBS充分混合，在室溫下，4000r/min離心10min，取50μL下層無(wú)機(jī)相用于分析。

(3)抗體準(zhǔn)備：取經(jīng)初步純化的抗體，用PBS稀釋1000倍，備用。

(4)測(cè)定：將樣本液和0、0.1、0.2、0.5、1、2、5ng/mL的AHD-NP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本液50μL到對(duì)應(yīng)微孔中；每孔加50μL抗體溶液，用蓋板膜蓋板后，37℃孵育1小時(shí)；加250μL洗滌緩沖液洗板3次；加入100μL酶標(biāo)二抗，37℃孵育1小時(shí)；加250μL洗滌緩沖液洗板6次，用吸水紙拍干；加入100μL顯色液，室溫避光顯色20min；加入100μL終止液；用酶標(biāo)儀于450nm處，測(cè)定每孔吸光度值。

(5)結(jié)果計(jì)算：用標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本液的吸光度值(B)比0標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(B₀)計(jì)算相對(duì)吸光度值，用相對(duì)吸光度值(％)對(duì)應(yīng)AHD-NP標(biāo)準(zhǔn)溶液自然對(duì)數(shù)做半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖；對(duì)應(yīng)樣本液中AHD-NP濃度從校正曲線算出；

相對(duì)吸光度值＝B/B₀×100％；

式中A為樣本液的相對(duì)吸光度值對(duì)應(yīng)的AHD-NP濃度，n為樣本稀釋倍數(shù)，115為AHD的分子量，248為AHD-NP的分子量，m為樣本質(zhì)量。

(6)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度：方法最低定量限(LOQ)為0.1μg/kg。添加0.2μg/kg，回收率為69％～123％；添加0.5μg/kg，回收率為70％～110％；1.0μg/kg，回收率為72％～101％。樣本變異系數(shù)小于20％。

實(shí)施例4免疫膠體金(GICT)法檢測(cè)水產(chǎn)品中AHD殘留(高純抗體的應(yīng)用)

(1)膠體金溶液的制備：膠體金顆粒的平均大小為30nm，制備方法為在100mL去離子水中加入1mL 1％檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入2mL 1％氯金酸，繼續(xù)煮沸10min，冷卻后，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)膠體金標(biāo)記AHD抗體的制備：取1mg高純AHD單抗凍干粉，加水1mL使其溶解，20,000rpm離心30min，取上清液備用→取100mL膠體金溶液，用0.1mol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.5→在600轉(zhuǎn)/min攪拌條件下，逐滴加入500μL AHD單抗→攪拌5min，逐滴加入500μL5mg/mL BSA→10min后，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，再攪拌15min→20,000r/min離心15min，棄上清液，加入10mL pH＝7.4PBS緩沖液(含0.4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2％BSA的PBS緩沖液(pH＝7.4)溶解，用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑條的組裝

試劑條的各部分組成成分和功能如下：

A、塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測(cè)區(qū)、控制區(qū))的作用。

背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。

B、樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。

C、膠體金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有呋喃妥因代謝物單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物，為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場(chǎng)所。

D、硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。

E、吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過(guò)程中多余的溶液吸收。

用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，37℃烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記呋喃妥因代謝物單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。

檢測(cè)試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測(cè)試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。

(4)樣品制備：取經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)AHD的南美白對(duì)蝦、河蟹和青魚(yú)樣本各1個(gè)，稱取2g勻質(zhì)樣本于50mL離心管中，加入4mL去離子水，0.5mL 1M鹽酸，0.1mL樣本衍生化試劑，充分混合3min；60℃水浴條件下孵育1h；取出后加入5mL 0.1M磷酸氫二鉀，0.4mL 1M氫氧化鈉，6mL乙酸乙酯，充分混合1min，4000r/min，離心5min；移取乙酸乙酯上層溶液3mL于5mL離心管中，60℃下空氣吹干；向吹干的試管中加入1mL正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.3mL復(fù)溶液，充分混勻，4000r/min，離心1min；吸取0.1mL下層溶液，待檢。

(5)GICT法檢測(cè)：從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100μL滴加到加樣孔中，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)；在5～10min讀取結(jié)果，其他時(shí)間判讀無(wú)效。同時(shí)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)作為對(duì)比。

(6)用陰性南美白對(duì)蝦樣本做添標(biāo)和交叉反應(yīng)試驗(yàn)：分別添加0.5、1.0、5.0、50μg/kgAHD做添標(biāo)試驗(yàn)；添加100μg/kgAOZ、SEM和AMOZ做同類藥物交叉反應(yīng)試驗(yàn)；添加200μg/kg青霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和磺胺二甲嘧啶做不同類型抗菌素的交叉反應(yīng)試驗(yàn)。添標(biāo)樣本和交叉反應(yīng)試驗(yàn)樣本預(yù)處理方法同上。

(7)結(jié)果判讀

讀取結(jié)果時(shí)，將試劑板水平置于觀察者正面。

陰性(－)：T線顯色比C線深或一樣深，表示樣品中呋喃妥因代謝物殘留含量低于檢出限。

陽(yáng)性(+)：T線顯色比C線淺，或T線無(wú)顯色，表示樣品中呋喃妥因代謝物殘留含量高于檢出限；T線顯色比C線越淺，表示樣品中呋喃妥因代謝物殘留含量越高。

無(wú)效：未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說(shuō)明書(shū)，并用新的試劑板重新測(cè)試。

(8)檢測(cè)結(jié)果：所檢測(cè)蝦、蟹、魚(yú)均為陰性樣品，與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果相符；添標(biāo)樣本的檢測(cè)結(jié)果和同類藥物的交叉反應(yīng)情況(見(jiàn)圖7)；交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明試劑條上的T線顯色均比C線略深，判斷為陰性，因此該GICT試劑條與AOZ、SEM、AMOZ、青霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和磺胺二甲嘧啶的交叉反應(yīng)率＜1％。