本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是一株肺炎克雷伯氏菌噬菌體vB_KpnM_he1(klebsiella peneumoniae phage vB_KpnM_he1)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

克雷伯氏菌屬(Klebsiella)為腸桿菌科中一類有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，其中肺炎克雷伯氏菌(又稱肺炎桿菌)、臭鼻克雷伯氏桿菌和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌與人類關(guān)系密切，特別是肺炎克雷伯氏菌，其所致疾病占克雷伯氏菌屬感染的95％以上，為呼吸道感染的重要病原體，常引起重癥肺炎，還可引起泌尿道感染、膽道感染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病。

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)廣泛分布于自然界的土壤、水和農(nóng)產(chǎn)品及林產(chǎn)品中，在人和動(dòng)物的腸道及呼吸道內(nèi)也常見，是典型的條件致病菌，常于動(dòng)物抵抗力下降時(shí)引起暴發(fā)性流行，如奶牛的乳房炎、家兔的腸炎、肺炎，雛雞腹瀉，綿羊的傳染性口炎，大熊貓的腹瀉、肝炎，豬腹瀉，貂肺炎和豚鼠肺炎等。以奶牛為例，肺炎克雷伯氏菌感染可引起奶牛乳房炎，造成產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，而且病原菌還具有通過食物鏈(奶產(chǎn)品)傳遞給人類的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)人類健康造成潛在危害。

青霉素類、頭孢類和碳青霉烯類等β-內(nèi)酰胺類藥物是防治肺炎克雷伯氏菌感染最主要的藥物，其中青霉素類和頭孢類藥物在治療肺炎克雷伯氏菌感染中廣泛使用，但由于長(zhǎng)期的藥物選擇性壓力，病原菌表現(xiàn)出了對(duì)這些藥物嚴(yán)重的耐藥性。

NDM-1基因?yàn)樾碌吕锝饘佴?內(nèi)酰胺酶基因，該基因編碼的蛋白為一種水解酶，可以水解幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類藥物，并且攜帶NDM-1基因的細(xì)菌一般同時(shí)攜帶其它種類的耐藥基因，表現(xiàn)出對(duì)多種藥物的耐藥性(Multi-drug resistance)，因此，含有NDM-1基因的細(xì)菌被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。肺炎克雷伯氏菌本身就是一種重要的人獸共患性細(xì)菌，而攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌(如2015年浙江省首次檢出1株攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌《中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)》)能夠?qū)θ酸t(yī)臨床上使用的β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致臨床治療的失敗。

目前人醫(yī)臨床上針對(duì)NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的感染，主要采取的治療措施仍是抗生素療法，即選擇對(duì)該菌敏感的非β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行治療，但是抗生素長(zhǎng)期使用亦可能激發(fā)或誘導(dǎo)病原菌的進(jìn)一步超乎人類想象的變異，產(chǎn)生更為可怕的“超級(jí)耐藥細(xì)菌”(Super bugs)，因此，尋找一種有效的抗生素替代療法成為擺在全球科學(xué)工作者面前的重要科學(xué)問題。

噬菌體是一種殺滅細(xì)菌的病毒，寄生于細(xì)菌并利用細(xì)菌來(lái)復(fù)制繁殖，最后將細(xì)菌裂解死亡，由于其天然的殺菌特性，而被科學(xué)家認(rèn)為是潛在的“超級(jí)細(xì)菌的有效克星”，而噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌的特異性高、強(qiáng)大的裂解能力以及對(duì)人類和動(dòng)物(產(chǎn)品)沒有毒副作用、不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留等優(yōu)勢(shì)而顯示出了比抗生素更加廣闊的應(yīng)用前景和價(jià)值。

噬菌體制劑的研制開發(fā)和應(yīng)用無(wú)疑是解決這一問題的理想方法，在噬菌體產(chǎn)品開發(fā)方面，東歐一些國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)某些噬菌體產(chǎn)品應(yīng)用于人類皮膚金葡菌感染的治療，美國(guó)也批準(zhǔn)某些產(chǎn)品應(yīng)用于動(dòng)物性食品的表面消毒，如2006年美國(guó)FDA批準(zhǔn)李斯特噬菌體制劑在禽產(chǎn)品和芝士上應(yīng)用，用于消毒。

吉林大學(xué)2013年公開了一株NDM-1肺炎克雷伯氏菌的噬菌體(路榮，《NDM-1肺炎克雷伯氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及其對(duì)小鼠菌血癥的治療研究》，碩士論文，2013.6)，路榮公開的噬菌體NKP-1是用ATCCBAA-2146(美國(guó)ATCC保藏中心)為宿主分離的，噬菌體NKP-1裂解譜很窄，僅能裂解ATCC BAA-2146宿主菌，這就限制了該噬菌體的進(jìn)一步應(yīng)用。另有，吉林大學(xué)的逯茵茵(逯茵茵，《肺炎克雷伯氏菌裂解性噬菌體的分離和鑒定》，碩士論文，2015.6)公開的噬菌體和其中屬于長(zhǎng)尾科病毒，屬于足尾科病毒，而屬于滴狀病毒，與本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的病毒外觀形狀差異迥異，不屬于同一類噬菌體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種能裂解肺炎克雷伯氏菌的噬菌體vB_KpnM_he1，該噬菌體具有較寬的裂解譜，不僅可以裂解NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌，也可以裂解不攜帶NDM-1的肺炎克雷伯氏菌，既可以裂解標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-2146，也可以裂解從乳房炎牛奶和奶牛糞便中分離的肺炎克雷伯氏菌臨床株，可以單獨(dú)或與其他物質(zhì)復(fù)配使用，為消毒凈化環(huán)境提供一種安全、無(wú)毒的噬菌體產(chǎn)品，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種肺炎克雷伯氏菌噬菌體，所述噬菌體保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760，申請(qǐng)人將該噬菌體自命名為vB_KpnM_he1。該噬菌體具有呈正二十面體的頭部和可伸縮的尾部；噬菌體在固體培養(yǎng)基上可以形成透亮空斑，周圍無(wú)暈環(huán)，邊緣清晰規(guī)則，直徑為1-2mm；基因組核酸的酶切圖譜顯示該噬菌體核酸是雙鏈DNA(dsDNA)；根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)2005年發(fā)表的《病毒分類—國(guó)際病毒分類委員會(huì)第八次報(bào)告》，vB_KpnM_he1屬于肌尾病毒科(Myoviridae)。該噬菌體在30-70℃中放置60min，活性穩(wěn)定，在80℃中則失活；處于pH5.0-10.0時(shí)，其效價(jià)與初始效價(jià)無(wú)顯著性差異。

本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在制備防治NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌感染的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在殺滅環(huán)境中NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在制備防治NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述藥物劑型為粉劑或液體劑型。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在制備防治NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌感染的藥物中的應(yīng)用是指，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌體在制備防止奶牛乳房炎藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在殺滅環(huán)境中NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用，所述環(huán)境包括養(yǎng)殖環(huán)境和醫(yī)療環(huán)境。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在殺滅環(huán)境中NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用，所述養(yǎng)殖環(huán)境包括料槽、地面、墻壁、墊料、飼料、飲水或空間環(huán)境。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌體在殺滅環(huán)境中NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用是指，將濃度為10⁸PFU/mL的肺炎克雷伯氏菌噬菌體液噴施于環(huán)境中，施用量為1mL/m²

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)肺炎克雷伯氏菌噬菌體vB_KpnM_he1具有較強(qiáng)的殺滅活性和較寬的裂解譜，既可以特異性裂解NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌，也可以殺滅不含NDM-1基因的其它多重耐藥的肺炎克雷伯氏菌，應(yīng)用于制備防治肺炎克雷伯氏菌感染的藥物中可實(shí)現(xiàn)廣譜殺菌的效果。

(2)該噬菌體vB_KpnM_he1經(jīng)小鼠試驗(yàn)，毒副作用小，安全性高；由于NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌噬菌體具有較好的親水相，容易配制成噴灑液、藥浴液或注射液，對(duì)環(huán)境的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的污染可進(jìn)行有效殺滅。

附圖說明

圖1.噬菌體vB_KpnM_he1噬菌斑照片。

圖2.噬菌體vB_KpnM_he1的透射電鏡照片。

圖3.溫度對(duì)噬菌體vB_KpnM_he1活性影響示意圖。

圖4.pH值對(duì)噬菌體vB_KpnM_he1活性影響示意圖。

圖5.培養(yǎng)基中噬菌體vB_KpnM_he1殺菌效果示意圖。

圖6.奶牛料槽中噬菌體vB_KpnM_he1殺菌效果示意圖。

具體實(shí)施方式

為方便理解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例中所涉及的試劑、器材，若非特別說明，均由商業(yè)渠道購(gòu)買獲得。

實(shí)施例中涉及的宿主菌為NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌臨床株，為江蘇地區(qū)某奶牛場(chǎng)的奶牛乳房炎奶樣中分離得到。

1mol/L無(wú)菌CaCl₂溶液(1L)：用天平稱量111gCaCl₂固體，倒入燒杯加水溶解，將溶液倒入1L容量瓶并用蒸餾水潤(rùn)洗燒杯2-3次，潤(rùn)洗液一并倒入容量瓶,再向容量瓶里加蒸餾水至刻度為止，混勻后高壓滅菌備用。

蛋白胨水(200mL)：稱取4g蛋白胨，1g氯化鈉于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.4后，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

1.2％LB瓊脂培養(yǎng)基(200mL)：稱取2g胰蛋白胨，2g氯化鈉，1g酵母粉及2.4g瓊脂于200mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

0.6％LB瓊脂培養(yǎng)基(200mL)：稱取2g胰蛋白胨，2g氯化鈉，1g酵母粉及1.2g瓊脂于200mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

LB液體培養(yǎng)基(200mL)：稱取2g胰蛋白胨，2g氯化鈉，1g酵母粉于200mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

SM溶液(1L)：稱取6.055gTris于20mL蒸餾水溶解，使用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.5，定容至50mL，然后加入5.8gNaCl和2gMgSO₄,溶解后定容至1L，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

實(shí)施例1噬菌體分離及制備

將宿主菌劃線接種于1.2％LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆接種于1ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)5-6h后作為宿主菌培養(yǎng)物備用。

2015年夏季，采集江蘇省南京市某奶牛場(chǎng)污水，取上清經(jīng)雙層濾紙過濾，10000rpm離心20min，再用0.22μm濾膜過濾上清；取10mL過濾后的上清，加入0.5mL宿主菌過夜培養(yǎng)物，再加入無(wú)菌CaCl₂母液至終濃度1.25mM混勻后，加入20ml LB液體培養(yǎng)基，室溫作用30min，再放置于37℃培養(yǎng)6～8h后；然后取培養(yǎng)物以12000rpm，4℃，離心30min，取上清；取此上清10mL，再次加入0.5mL宿主菌過夜培養(yǎng)物，加入無(wú)菌CaCl₂母液至終濃度1.25mM混勻后，加入20ml LB液體培養(yǎng)基，按上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)離心，獲得富集的上清；按照以上的試驗(yàn)方法再富集一次，將富集三次的上清用0.22μm濾膜過濾，形成噬菌體原液。

將1.2％LB瓊脂平板分為2個(gè)區(qū)域：吸取以上宿主菌培養(yǎng)物0.1mL滴于平板正中央，用涂棒將菌液均勻地涂開；待其晾干后，取上述噬菌體原液10μL滴于其中一個(gè)區(qū)域；待自然晾干后，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h后，觀察滴加噬菌體區(qū)域有無(wú)空斑形成。

如果有空斑形成，證明有噬菌體存在。取噬菌體原液100μL，進(jìn)行一系列的10倍稀釋。取10^-2、10^-4和10^-6稀釋液各0.1mL與宿主菌培養(yǎng)物0.1mL混勻，室溫作用15min后，加入約4mL融化的0.6％LB瓊脂培養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入1.2％LB瓊脂培養(yǎng)基平板上層，搖勻平置10min，待其凝固，置于37℃溫箱培養(yǎng)12h后觀察，獲得形成單個(gè)噬菌斑的雙層平板。

實(shí)施例2噬菌體擴(kuò)增和純化

在實(shí)施例1形成噬菌斑的雙層平板上，用移液器的槍頭挑取直徑較大的單個(gè)噬菌斑，接種于3～5ml LB液體培養(yǎng)基中，加入噬菌體宿主菌液0.1mL，混勻，室溫作用15min，37℃培養(yǎng)10～14h，12000rpm，4℃離心10min，取上清，加入0.3％氯仿；重復(fù)雙層實(shí)驗(yàn)，如此反復(fù)挑取4-5次單個(gè)噬菌斑，將噬菌體純化成大小一樣的噬菌斑。

取1mL新鮮培養(yǎng)的宿主菌，加0.3mL噬菌體裂解液(以單個(gè)噬菌體培養(yǎng)物與宿主菌分別按照1:1、1:10和1:100的比例)。37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入100mLLB液體培養(yǎng)基，再加入CaCl₂母液至終濃度1.25mM，37℃搖振培養(yǎng)12～16h，12000rpm，4℃離心10min，取上清，即為噬菌體裂解液。

PEG純化：在50ml裂解液中加入RNase A、DNaseⅠ至終濃度均為1μg/mL，37℃溫育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴1h或4℃過夜；4℃離心10000rpm 10min，去上清液；加2mL SM液，充分洗滌沉淀，室溫作用1h；加入等體積的氯仿抽提，溫和振蕩30s；4℃，5000rpm離心10min以分離有機(jī)相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純化的噬菌體。

CsCl等密度梯度離心純化:離心管底部先緩慢加入1.6gm/cc CsCl 10mL，再依次加入1.4gm/cc CsCl 10mL，25％蔗糖5mL，噬菌體裂解液10mL，平衡；加入離心管套中，緩慢懸掛于轉(zhuǎn)子中；打開超速離心機(jī)(Optima L-80XP Ultracentrifuge,Beckman)開關(guān)，設(shè)置轉(zhuǎn)速30000rpm，時(shí)間120min，溫度18℃；離心結(jié)束后待真空下降為0時(shí)，打開倉(cāng)門，取出樣品，關(guān)機(jī)；樣品下端有一層白色帶，即1.4gm/cc與1.6gm/cc間，用細(xì)針頭從帶側(cè)面插入，小心吸取，20mL樣品最終獲得約5-8mL；將樣品置于透析袋中，用10mM Tris-HCl，PH為7.4，100mM MgCl₂緩沖液進(jìn)行透析，2L一次(10-14kd)；最終將樣品吸出，體積約為10mL，測(cè)定噬菌體效價(jià)。

采用雙層平板法檢測(cè)噬菌體效價(jià)：將以上純化的噬菌體液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取相應(yīng)的幾個(gè)梯度的噬菌體稀釋液各0.1mL與宿主菌液0.1mL充分混勻，鋪雙層瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)10h左右，對(duì)每個(gè)瓊脂平皿進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)。選擇出現(xiàn)100-200左右噬菌斑的平皿，根據(jù)稀釋的倍數(shù)計(jì)算得到的噬菌體初始濃度即得噬菌體效價(jià)。純化的噬菌體如圖1所示，噬菌體在1.2％的LB瓊脂培養(yǎng)基中可以形成透亮空斑，周圍無(wú)暈環(huán)，邊緣清晰規(guī)則，直徑為1-2mm。

申請(qǐng)人將純化的噬菌體自命名為vB_KpnM_he1，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位地址：中國(guó)·武漢·武漢大學(xué)，郵編，430072。保藏號(hào)：CCTCC No:M2015760，分類命名：肺炎克雷伯氏菌噬菌體vB_KpnM_he1(Klebsiella peneumoniae phage vB_KpnM_he1)，保藏日期為2015年12月16日。

實(shí)施例3噬菌體vB_KpnM_he1透射電鏡觀察

取實(shí)施例2中PEG純化的噬菌體做電鏡觀察，具體操作步驟為：加10μL樣本滴在銅網(wǎng)上，待其沉淀15min,用濾紙吸去多余的液體，用2％的磷鎢酸(PTA)染色1-2min，干燥后使用透射電鏡(日立H-7650)觀察；觀測(cè)結(jié)果如圖2所示，頭部呈正二十面體，頭部直徑約為80nm，尾長(zhǎng)約為110nm。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)2005年發(fā)表的《病毒分類—國(guó)際病毒分類委員會(huì)第八次報(bào)告》，vB_KpnM_he1屬于肌尾病毒科(Myoviridae)。

實(shí)施例4噬菌體vB_KpnM_he1的溫度和酸堿耐受性實(shí)驗(yàn)

取1mL實(shí)施例2獲得的純化的噬菌體(5.2×10⁸PFU/mL)于30℃～80℃水浴分別作用30min和60min，將樣品冷卻后測(cè)其效價(jià)；分別取pH2.0～13.0的蛋白胨水和2.5×10⁸PFU/mL純化噬菌體等量混合，37℃水浴作用2h后測(cè)其效價(jià)。

溫度檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，噬菌體vB_KpnM_he1在30～50℃分別作用30min和60min后，其活性無(wú)顯著變化；在60℃和70℃作用下，活性有顯著降低；80℃作用30min后，無(wú)噬菌體存活。

pH檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，在pH為2和3時(shí)，檢測(cè)不到噬菌體；pH為4.0和5.0時(shí)，其效價(jià)與初始效價(jià)相差較大，PH為6.0～10.0時(shí)，其效價(jià)與初始效價(jià)無(wú)顯著性差異；而當(dāng)pH為11、12、13時(shí)，檢測(cè)不到噬菌體。

實(shí)施例5噬菌體vB_KpnM_he1宿主譜分析

將實(shí)施例2獲得的噬菌體vB_KpnM_he1效價(jià)調(diào)整為10¹⁰PFU/mL備用。

試驗(yàn)選擇20株乳房炎病牛中分離的肺炎克雷伯氏菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-2146D和ATCC BAA-1706B為對(duì)象，其中10株臨床株攜帶有NDM-1基因，另外10株臨床株為NDM-1基因陰性，對(duì)噬菌體vB_KpnM_he1的宿主譜進(jìn)行分析，具體操作如下：分別取20株肺炎克雷伯氏菌臨床株和2株標(biāo)準(zhǔn)菌株的過夜培養(yǎng)物100μL，滴加在1.2％LB培養(yǎng)基平板中央，用涂棒分別將它們涂制成均勻的菌苔。然后將每個(gè)平板平均分成兩個(gè)區(qū)域，其中一個(gè)區(qū)域，取10μL噬菌體vB_KpnM_he1滴加在菌苔表面，另一個(gè)區(qū)域滴加10μL生理鹽水作對(duì)照，待液滴干燥后倒置于37℃培養(yǎng)12～16h，觀察結(jié)果，如有噬菌斑產(chǎn)生則記為“+”，否則為“-”，結(jié)果如表1所示:

表1.噬菌體vB_KpnM_he1的宿主譜分析

由表1可見，噬菌體vB_KpnM_he1對(duì)20株肺炎克雷伯氏菌臨床株中的13株有裂解作用，裂解率為65％，其中包括7株NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌，分屬于ST1661型(6株)和ST2108型(1株)，6株NDM-1陰性肺炎克雷伯氏菌，分屬于ST2108型(4株)、ST530型(1株)和ST17型(1株)，同時(shí)vB_KpnM_he1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-2146和ATCCBAA-1706也有裂解能力，說明該噬菌體具有寬裂解譜的特性。

實(shí)施例6噬菌體vB_KpnM_he1在培養(yǎng)基中的殺菌效果

取一株NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的過夜培養(yǎng)物1.0mL，用LB將其OD_600nm值調(diào)整為0.5(約為5×10⁸PFU/mL)，分別加入噬菌體vB_KpnM_he1 5×10⁴PFU/mL(MOI＝0.0001)、5×10⁵PFU/mL(MOI＝0.001)、5×10⁶PFU/mL(MOI＝0.01)、5×10⁷PFU/mL(MOI＝0.1)和5×10⁸PFU/mL(MOI＝1)，5×10⁹PFU/mL(MOI＝10)和5×10¹⁰PFU/mL(MOI＝100)于37℃靜置培養(yǎng)，同時(shí)以不加噬菌體作為對(duì)照組。在培養(yǎng)的0、1、2、3、4、5、6、7h檢測(cè)OD_600nm值的變化。

結(jié)果見圖5，與正常細(xì)菌對(duì)照組相比，噬菌體vB_KpnM_he1處理組，30min后，肺炎克雷伯氏菌數(shù)量開始下降，且噬菌體濃度越大，細(xì)菌數(shù)量降低越明顯，當(dāng)MOI>0.01時(shí)，1h時(shí)肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量已控制到較低值，且2h時(shí)OD₆₀₀nm的吸光值接近于0，說明噬菌體vB_KpnM_he1在培養(yǎng)基中殺菌迅速而且徹底。

實(shí)施例7噬菌體vB_KpnM_he1控制NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌感染試驗(yàn)

試驗(yàn)選擇在南京市某奶牛場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)對(duì)象為泌乳期荷斯坦奶牛，選取12頭健康奶牛，使用一株強(qiáng)毒力NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌臨床株(PCR檢測(cè)其攜帶fimH、mrkD、ureA、wabG、uge和alls等毒力基因)進(jìn)行乳房?jī)?nèi)攻毒，攻毒劑量為10⁸CFU，人工建立奶牛乳房炎模型。每頭牛的四個(gè)乳區(qū)都要進(jìn)行攻毒，每天攻毒兩次，連續(xù)攻毒三天。第四天后進(jìn)行觀察，以體細(xì)胞數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，如果至少有一個(gè)乳區(qū)奶樣中的體細(xì)胞數(shù)>50萬(wàn)/mL,并且能從該奶樣中分離得到NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌即為乳房炎模型建立成功。

將這12頭奶牛隨機(jī)分為兩組：噬菌體實(shí)驗(yàn)組和抗生素對(duì)照組，每組6頭奶牛。實(shí)驗(yàn)組奶牛用實(shí)施例2提供(使用CsCl等密度梯度離心純化)的噬菌體稀釋液(終效價(jià)為10¹⁰PFU/mL)，在每次擠奶前和擠奶后用噬菌體進(jìn)行乳頭藥浴，乳頭藥浴每天3次，每次1min，持續(xù)使用30天；對(duì)照組牛使用注射用氨芐西林鈉(上海公誼獸藥廠)進(jìn)行治療。在治療開始的第1d、15d和30d時(shí)，應(yīng)用北京乳房炎檢測(cè)試劑(BMT)對(duì)受試奶牛的乳房炎發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示：

表2.噬菌體治療組和對(duì)照組的乳房炎檢出率

試驗(yàn)30d后，噬菌體藥浴組牛乳房炎的陽(yáng)性乳區(qū)少了4個(gè)，發(fā)病頭數(shù)減少了2頭；抗生素對(duì)照組牛隱性乳房炎的陽(yáng)性乳區(qū)減少了0個(gè)，發(fā)病頭數(shù)減少了0頭。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗生素對(duì)NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌引起的奶牛乳房炎治療無(wú)效，而噬菌體vB_KpnM_he1對(duì)NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌引起的奶牛乳房炎具有一定的防治效果。

具體實(shí)踐中，噬菌體vB_KpnM_he1還可以應(yīng)用于制備其他用于防治NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌感染的藥物，劑型可以是粉劑或液體劑型，感染對(duì)象包括人和動(dòng)物(雞、豬、牛、鵝、鴨等)，以代替抗生素類藥物使用。

實(shí)施例8噬菌體vB_KpnM_he1控制養(yǎng)殖環(huán)境中的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的污染

以奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)作為試驗(yàn)地點(diǎn)，選擇一株NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌臨床株為試驗(yàn)菌株，將濃度為10⁵CFU/mL的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌取1mL均勻噴灑在奶牛料槽表面(約1m²)，然后以1mL濃度為10⁸PFU/mL噬菌體vB_KpnM_he1對(duì)料槽表面實(shí)施噴殺，1h后，使用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)料槽表面NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量。

檢測(cè)結(jié)果如圖6顯示，1h后，料槽表面NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量降到10³CFU以下，5h后，料槽表面NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量降到10CFU以下，說明該噬菌體可以有效殺滅養(yǎng)殖環(huán)境(奶牛料槽表面)中的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌。

實(shí)施例9噬菌體vB_KpnM_he1控制養(yǎng)殖環(huán)境中的NDM-1陰性肺炎克雷伯氏菌的污染

以奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)作為試驗(yàn)地點(diǎn)，選擇一株不攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌臨床株為試驗(yàn)菌株，將濃度為10⁵CFU/mL的肺炎克雷伯氏菌取1mL均勻噴灑在奶牛料槽表面(約1m²)，然后以1mL濃度為10⁸PFU/mL噬菌體vB_KpnM_he1對(duì)料槽表面實(shí)施噴殺，1h后，使用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量。

檢測(cè)結(jié)果顯示，2h后，料槽表面肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量降到10³CFU以下，5h后，料槽表面肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量降到10CFU以下，說明該噬菌體可以有效殺滅養(yǎng)殖環(huán)境(奶牛料槽表面)中的肺炎克雷伯氏菌。

實(shí)施例10噬菌體vB_KpnM_he1控制NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌對(duì)飼料的污染

將過夜培養(yǎng)的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌調(diào)整濃度為10⁵CFU/mL，用小型噴霧器(瓶)將1mL菌液均勻噴灑在攤開的100g青貯飼料(上海金盟飼料有限公司)表面，攤開面積約1m²,然后將純化的噬菌體vB_KpnM_he1以10⁸PFU/mL的濃度實(shí)施噴殺，噴施量1mL，2h后開始檢測(cè)飼料中NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌的數(shù)量。

檢測(cè)結(jié)果顯示，在以10⁸PFU/mL濃度實(shí)施噴殺2h后，青貯飼料中宿主菌的數(shù)量降到10CFU/g以下，說明該噬菌體可以有效殺滅奶牛飼料中污染的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌。

實(shí)施例11噬菌體vB_KpnM_he1的安全性實(shí)驗(yàn)

6-8周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，平均體重27±2g，共40只，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。將小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只；其中一組口服噬菌體vB_KpnM_he1 10⁸PFU/0.25mL/只(實(shí)施例2提供)；對(duì)照組口服等體積PBS。連續(xù)口服14d后，每組脫頸致死5只小鼠，觀察內(nèi)臟、消化道及黏膜變化情況；每組剩余的15只繼續(xù)飼喂，每天取其糞便檢測(cè)噬菌體數(shù)量變化。

結(jié)果顯示，此劑量噬菌體對(duì)小鼠健康及日常行為沒有影響，解剖檢查未見任何異常，且在口服噬菌體結(jié)束7天后，在小鼠糞便中檢測(cè)不到噬菌體。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，如上述實(shí)施例提供的噬菌體vB_KpnM_he1還可以用于殺滅養(yǎng)殖環(huán)境(料槽、地面、墻壁、墊料、飼料或飲水等環(huán)境)或醫(yī)療環(huán)境中的NDM-1陽(yáng)性肺炎克雷伯氏菌，這些依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。