專利名稱：一種人工合成的對鱗翅目高毒力的Bt雙價(jià)融合蛋白及編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種人工合成的對鱗翅目有高毒力的Bt雙價(jià)融合蛋白及其編碼基因，該基因包括Vip83*和Cry9Ca*基因及其所述的構(gòu)成和編碼序列。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是口前最常用的商品化殺蟲微生物，其表達(dá)殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins),營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetativeinsecticidal proteins),對鱗翅目等農(nóng)業(yè)上常見害蟲具有專一'丨生毒殺作用(喻子牛etal.，1996) ο目前，在生產(chǎn)應(yīng)用中使用最多的是殺蟲晶體蛋白(ICPs)，ICPs主要分為倆大類，Cry類蛋白和Cyt類蛋白，截止2009年6月6日，克隆得到的ICPs基因已增至58群449中Cry類基因，2群27種Cyt基因(Crickmoreet al., 1998)。其晶體結(jié)構(gòu)與功能以及殺蟲機(jī)制已有了一定的了解(Li et al.,1991)。Cry類蛋白又稱為δ內(nèi)毒素，在序列結(jié)構(gòu)上分為明顯的N-半段跟C-半段，其中C-半段富含二硫鍵，而N-半段為核心毒性區(qū)，在空間結(jié)構(gòu)上有分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域(Schn印f etal.，1998)。Domain I 6個(gè)親水的α螺旋圍繞一個(gè)疏水的α 5螺旋，Domain II三個(gè)反平行β 折疊片.Domain III 兩個(gè)反平行 β 折疊片形成 β-sandwich (Galitsky et al..2001)。Cry類蛋白在進(jìn)入敏感昆蟲的中腸之后，在堿性環(huán)境下水解，切掉C-半段和N-段的幾個(gè)氨基酸殘基，活化成具有活性的δ內(nèi)毒素，然后Domain II上各突起與敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞的受體鈣粘蛋白(Cadherin-like Protein)結(jié)合，形成毒素寡聚體，然后再與第二受體糖基磷酰肌糖錨定氨基多肽酶(GP1-APN)或者糖基磷酰肌糖錨定堿性磷酸酶(GP1-ALP)結(jié)合(Bravo et al. , 2004),誘使毒素構(gòu)象發(fā)生變化,Domain I中疏水的α 5螺旋伸出插入到昆蟲中場上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，形成膜離子通道，進(jìn)而引起細(xì)胞滲透平衡被破壞，細(xì)胞吸脹破裂，最后導(dǎo)致腸壁破裂，昆蟲死亡(Bravo et al., 2004)。一般認(rèn)為Domain III起到防止毒素被蛋白酶降解的作用，并參與到一部分受體的識別過程(Li et al.，1991)。自1996年轉(zhuǎn)基因作物實(shí)現(xiàn)商業(yè)化以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積每年均以兩位數(shù)的百分率迅速增長。繼2006年突破了 I億公頃后，2007年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.143億公頃，較1996年增長了 67倍(張銳et al.，2007)。轉(zhuǎn)基因作物育種已成為最富活力的農(nóng)業(yè)技術(shù)，不僅創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益，而且顯示出對于未來解決環(huán)境、能源等重大問題的巨大潛力。目前，應(yīng)用在發(fā)酵生物農(nóng)藥和轉(zhuǎn)基因植物的主要為Cry類蛋白，但由于現(xiàn)在使用的Bt.殺蟲基因存在著種類單一，害蟲抗性增加迅速的問題。大多數(shù)為Bt.δ-內(nèi)毒素晶體毒蛋白的CrylAc，少部分為嵌合的CrylAb ;另外許多準(zhǔn)備釋放的轉(zhuǎn)抗蟲基因玉米和水稻大多數(shù)也是這兩種基因。這種單一的抗蟲基因推廣給各種抗蟲作物種植的抗蟲性保持存在較大的風(fēng)險(xiǎn)，會縮短害蟲對這兩種基因產(chǎn)生抗性的時(shí)間。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CrylAc在棉鈴蟲中腸上皮細(xì)胞結(jié)合區(qū)位于鈣粘蛋白Cadherin第1217-1461位于245個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈上。這個(gè)區(qū)域的缺失或者突變可能導(dǎo)致棉鈴蟲抗性的急劇增加(Peng et al.,2010) 因此，開發(fā)新型殺蟲蛋自，或者將不存在交叉抗性的幾種殺蟲蛋白構(gòu)建成融合基因，可以減緩害蟲抗性產(chǎn)生的速率，這已經(jīng)成為當(dāng)前轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)。營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A被譽(yù)為第二代殺蟲蛋白，與殺蟲晶體蛋白ICPs不同，Vip3A蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)生長期所產(chǎn)生的蛋白，對鱗翅目昆蟲具有很獨(dú)特的殺蟲活性，尤其對ICPs有抗性的小地老虎的毒性比CrylAc高260倍，對鞘翅目無效。它不同于Bt芽孢期產(chǎn)生的晶體毒蛋白ICPs，其晶體結(jié)構(gòu)，敏感昆蟲腸道受體，殺蟲作用機(jī)理尚不明確(Estruchet al.，1996)。Vip3A在昆蟲腸道內(nèi)被水解為四種主要蛋白產(chǎn)物，其中33KD的蛋白水解產(chǎn)物為Vip3A蛋白的毒性核心結(jié)構(gòu)。Vip3A毒蛋白只要在pH5.0-10.0時(shí)均可溶解，其C-末端也不被切除，與敏感昆蟲上皮細(xì)胞結(jié)合，誘發(fā)昆蟲細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核溶解，最終昆蟲死亡。這個(gè)可能的毒性機(jī)制不能排除 孔形成機(jī)制(Yu et al.，1997)。與晶體毒素相比較，營養(yǎng)期殺蟲蛋白的研究還剛剛起步不久。Estruch已經(jīng)成功地將Vip3Aa基因與不同的啟動(dòng)子(如PEPC，Ubi和MTL等)構(gòu)成表達(dá)質(zhì)粒通過粒子轟擊法導(dǎo)入玉米愈傷組織，得到的轉(zhuǎn)基因玉米，對小地老虎和草地貪夜蛾的殺蟲效果都很好。peng等評價(jià)了轉(zhuǎn)BtVip3A基因的安全性，急性和亞急性的毒理學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)負(fù)面的作用，證明利用Vip3A進(jìn)行生物害蟲防治是安全的(Peng et al.，2007)。相信在未來的時(shí)間里，營養(yǎng)期殺蟲蛋白在延緩害蟲對Bt毒素抗性進(jìn)化上將發(fā)揮重要作用。Vip83基因是本申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從蘇云金芽孢桿菌YBT-833中克隆得到的，這個(gè)基因與Vip3A存在兩個(gè)氨基酸的差異(即Gln284 — Lys284，Pro804 — Ser8tl4)，屬于Vip3A家族，對小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾等鱗翅目具有毒力(蔡啟良et al.，2002)。Vip3A與ICP兩種毒蛋白在昆蟲中腸作用機(jī)制不同，二者對昆蟲不產(chǎn)生交叉抗性，因此將兩種殺蟲蛋白同時(shí)喂食害蟲可以減緩其產(chǎn)生抗性的速率，目前將Vip3A和Cry9Ca作融合表達(dá)未見先例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對目前轉(zhuǎn)基因Bt.殺蟲蛋白資源存在的不足，本發(fā)明合成了一種能夠提高殺蟲毒力和減緩害蟲抗性的抗蟲融合基因，該基因根據(jù)陸地棉偏愛性密碼子優(yōu)化后的基因序列(其核苷酸序列和編碼的氨基酸序列見序列表SEQ ID NO:1所示，其蛋白質(zhì)的序列見SEQ ID NO:2所示)，本發(fā)明涉及該基因編碼的融合蛋白以及該融合蛋白的用途。本發(fā)明以申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的Vip83基因(參見:Genebank登錄號AY044227)和Cry9Ca基因的氨基酸序列(參見:Genebank登錄號AX100534)為藍(lán)本，根據(jù)陸地棉偏愛的密碼子，優(yōu)化后人工合成了二個(gè)Bt.殺蟲基因，申請人將該兩個(gè)基因分別命名為Vip83*和Cry9Ca*。其中，Cry9Ca*只包括有活性的N-半段δ內(nèi)毒素。申請人將上述得到的Vip83*和Cry9Ca*進(jìn)行融合后得到如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO:2所示蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)目的:申請人:提供了一段殺蟲融合基因，該基因包括從5’ _3’，依次含有編碼Vip83*毒素的核苷酸序列和編碼或切除了 C半段的Cry9Ca*的核苷酸序列；且上述兩個(gè)蛋白的核苷酸序列使用同一個(gè)開放閱讀框內(nèi)，中間用一段腸激酶序列(EK site)分開。該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列全長為4269bp，其中l(wèi)-4269bp為該基因的編碼區(qū)，它編碼1422個(gè)氨基酸。SEQ ID:2是本發(fā)明合成的該基因的蛋白質(zhì)的序列。將上述殺蟲融合基因裝載在PGEX-6P-1表達(dá)載體(購自美國GE Healthcare公司)上，構(gòu)成重組質(zhì)粒PGEVC9C(圖譜見圖7A)，其融合基因位于GST標(biāo)簽后，可以在Escherichia coliBL21 (該大腸桿菌 Escherichia coliBL21 購自 Invitrogen 公司)中進(jìn)行異源表達(dá)，表達(dá)出的融合蛋白大小為183.7kDa(見圖6)，表達(dá)產(chǎn)物對鱗翅目具有毒力，以小菜蛾作為生測昆蟲的結(jié)果表明:Vip83Cry9Ca*的LC50為0.3ug/ml。申請人:已將包含該基因質(zhì)粒pGEVC9C的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α /Bt./6p/pGEVC9C，于2011年10月24日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO:M201136

序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明合成的殺蟲基因Vip83Cry9Ca*核苷酸序列和編碼序列，序列全長為4269bp，其中第l-4269bp處為編碼區(qū)。序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明合成殺蟲基因Vip83Cry9Ca*的蛋白質(zhì)的序列。共1422氨基酸，分子量為159.433.40kDa。圖1:本發(fā)明技術(shù)流程圖。

圖2:是陸地棉偏愛密碼子序列。圖3:Vip83基因和Cry9Ca基因的優(yōu)化如后的序列對比。在基因名稱后有*標(biāo)記的為優(yōu)化后的合成基因。陰影區(qū)黑底白字區(qū)域代表合成的序列與原始序列一致(相同)的核苷酸，淺色陰影區(qū)代表改變后的核苷酸。其中圖3A:是優(yōu)化前后Vip83基因序列的對比。圖3B:是優(yōu)化前后Cry9Ca基因的對比。圖4:優(yōu)化后的Vip83*序列對比野生型Vip83序列各項(xiàng)改變指標(biāo)。其中，圖4A是優(yōu)化前后的Vip83*的CAI值對比，圖4B是優(yōu)化前后的Vip83的GC含量變化。圖5:優(yōu)化后的Cry9Ca*序列對比野生型Cry9Ca序列各項(xiàng)改變指標(biāo)，其中，圖5A是優(yōu)化前后的Cry9Ca的CAI值對比，圖5B是優(yōu)化前后的Cry9Ca的GC含量變化。圖6:用大腸桿菌BL21表達(dá)的殺蟲融合蛋白的SDS-PAGE分析。圖中1.Takara wide range proteins Marker ；2.空載體 pGEX_6P_l ;3.質(zhì)粒pGEVip83 ；4.質(zhì)粒 pGECry9Ca ;5.質(zhì)粒 pGEVC9C.
圖7:是本發(fā)明的實(shí)施例構(gòu)建的所有質(zhì)粒圖譜。其中:圖7A:原核表達(dá)質(zhì)粒PGEVC9C圖譜。圖7B:原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX_6P_l圖譜；圖7C:原核表達(dá)質(zhì)粒pGEVip圖譜:圖7D:原核表達(dá)質(zhì)粒pGEC9C圖譜；圖7E:原核克隆質(zhì)粒pUC57_V83圖譜；圖7F:原核克隆質(zhì)粒PUC57-C9C圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1陸地棉密碼子偏愛的Vip83* ;Cry9Ca*基因優(yōu)化優(yōu)化步驟:使用密碼子偏愛性查詢使用在線數(shù)據(jù)庫Codon UsageDatabase(http://www.kazusa.0r.jp/codon)在 QUERY Box for search with Latinname of organism對話框中輸入Gossypium hirsutum,點(diǎn)擊submit,在彈出的網(wǎng)頁中選擇Gossypium hirsutum。得到陸地棉偏愛氨基酸密碼子序列表(見圖2)。從圖2中可以分析得出，陸地棉使用的基因GC含量為45.83%,第二位，第三位密碼密碼子偏愛A或者T。從Genebank 中查找出 Vip83 (登錄號 AY044227)和 Cry9Ca (登錄號 AX100534)的序列，根據(jù)從Codon Usage Database中得到的圖2所述的偏愛密碼子,采用植物基因高頻使用密碼子部分置換Vip83和Cry9Ca的原始序列對應(yīng)的密碼子，部分去除ATTTA，AATGAA等富含AT序列和不明確內(nèi)含子序列，以及排除基因中大的反向重復(fù)序列和常用的限制性內(nèi)切酶序列，并且去掉Vip83*序列的終止密碼子并在3’端添加了一段腸激酶切點(diǎn)序列，在序列的兩端分別添加PstI和XhoI酶切位點(diǎn)方便今后轉(zhuǎn)基因克隆，后將設(shè)計(jì)好的序列交南京金斯瑞生物科技公司人工化學(xué)合成。優(yōu)化合成后的基因通過EcoRV平末端的酶切位點(diǎn)分別裝載在pUC57-V83(圖譜見圖7E) ;pUC57_C9C(圖譜見圖7F)載體上，優(yōu)化前后的序列對比見圖3A，圖3B。經(jīng)測序后的Blastn分析，人工合成的Vip83*和Cry9Ca*基因氨基酸序列與原始序列完全一致。人工合成后的Vip83*序列核苷酸序列與原始Vip83序列同源性71.4%,偏愛密碼子的分布值CAI從0.78上升到0.87，GC含量的變化從30.91%上升到40.51% (見圖4A，圖4B)，并且在其3’端添加了一段由4個(gè)天冬氨酸I個(gè)賴氨酸構(gòu)成的腸激酶切點(diǎn)及其位點(diǎn)保護(hù)序列(EK site) ο人工合成后的Cry9Ca*序列與原始Cry9Ca序列同源性72.58%，偏愛密碼子的分布值CAI從0.68上升至IJ 0.91，GC含量的變化從64.55%下降到42.62% (見圖5A，圖5B)。實(shí)施例2原核表達(dá)質(zhì)粒pGEVC9C，pGEVip，pGEC9C的構(gòu)建。Vip83*基因的擴(kuò)增:根據(jù) Vip83*序列(序列見圖3A)見，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物5’端添加BamH I酶切位點(diǎn)，3’端去除終止密碼子，添加酶切位點(diǎn)EcoR I，該引物設(shè)計(jì)序列如下:正向引物(5’-Vip83-BamHI):5’ -ACCGGATCCATGAACAAAAACAAT-3’ 下劃線部分為酶切位點(diǎn)。反向引物(3，-Vip83-EcoRI):5’ -AAGGAATTCCTTATCATCATCATC-3’ 下劃線部分為酶切位點(diǎn)。以pUC57-V83 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增 Vip83*。PCR反應(yīng)體系如下(反應(yīng)總體積50 μ I):
IOxTaq buffer (購自北京 Trans 公司)5μ1
高保真dNTP (IOml,購自北京Trans公司)Iμ
模板質(zhì)粒PUC57-V83 (由南京Genscript公司合成)Ιμ
正向引物(5’-Vip83-BamH I，10μΜ)Ιμ
反向引物(3 ’-Vip83-EcoR I，I ΟμΜ)I μ
TaqDNA聚合酶(購自北京全式金公司，2.511/μΙ) Ιμ 加去離子水至50μ1
PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin20s ；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存5min結(jié)束。PCR產(chǎn)物純化采用AxyGen公司PCR純化試劑盒(按照試劑盒的說明書操作)進(jìn)行產(chǎn)物回收純化。質(zhì)粒載體的提取:從劃線平板上挑取保存有PGEX-6P-1載體(圖譜見圖7B，購自美國GE Healthcare公司)單菌落,用裝有5ml LB液體培養(yǎng)基(含有100 μ g/ml Amp購自北京全式金公司)的試管內(nèi)，37°C過夜。取1.5ml LB液體培養(yǎng)基12000rpm離心lmin，棄上清，沉淀中加入 200 μ I 溶液 I (50mM 葡萄糖，25mM Tris.HCI (PH8.0)，IOmM EDAT (ρΗ8.0)，Lysoznyle 20mg/ml ;混勻，加入 400ml 溶液 II (0.2M NaOH, I % SDS),輕輕顛倒混勻，放置l-2min，加入300ml溶液III (3MKAc，用冰乙酸調(diào)至ρΗ4.8)。冰上放置5min。12000rpm離心IOmin,取上清,加入等體積異丙醇，12000min 4°C低溫離心IOmin ;棄上清,沉淀用70%乙醇洗滌后，12000min 4°C低溫離心IOmin ;棄上清，沉淀用50 μ I去離子水溶解。取3μ I電泳檢測。酶解PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pGEX-6P-l =PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI/EcoRI (購自寶生物工程大連有限公司)酶解，得到酶解產(chǎn)物。酶解體系如下:(1)100 μ I酶解體系中含 90 μ I PCR 產(chǎn)物；5μ I IOXH Buffer ；2.5μ I BamH I ；2.5μ I EcoR I。(2) 100 μ I 酶解體系中含 90 μ I pGEX-6P-l 質(zhì)粒載體；5μ I IOXH Buffer ；2.5μ IBamH I ；2.5μ I EcoR I。均在37°C過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)7%的瓊脂糖電泳后，使用AxyGen公司的膠回收試劑盒，按照說明書回收電泳產(chǎn)物。原核表達(dá)質(zhì)粒pGEVip的構(gòu)建:酶連:25 μ I連接體系中含有:經(jīng)BamHI/EcoRI 雙酶切的 pGEX-6P-l 載體 0.03nmol 以及經(jīng) BamH I/EcoR I 雙酶切后的 Vip83*PCR 產(chǎn)物 0.2InmoI ；T4 DNA Iigase (購自 Fermentas 公司)2.5 μ I ;T4 DNAligase Buffer 2.5 μ I ;加水補(bǔ)至 25 μ 1，16 酶連 4h。轉(zhuǎn)化:取酶連產(chǎn)物I μ I與50 μ I大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α (購自Invitrogen公司)混合，加入到預(yù)冷的Imm電轉(zhuǎn)杯(購自BioRad公司)中，在2.1KV電壓下電擊；然后迅速加入600 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C復(fù)蘇Ih ;涂布在含100 μ g/ml氨芐青霉素(Amp)抗生素的LB固體平板上，37°C過夜，挑取轉(zhuǎn)化子，接液體LB培養(yǎng)基抽取質(zhì)粒電泳驗(yàn)證。將把Vip83*基因插入到pGEX-6P-l載體的質(zhì)粒命名為pGEVip (圖譜見圖7C)，質(zhì)粒的DNA序列全長為7366bp，其中Vip83*基因位于GST標(biāo)簽之后(見附圖7，)3’末端添加有由4個(gè)天冬氨酸I個(gè)賴氨酸組成的腸激酶識別切點(diǎn)，終止密碼子使用位于PGEX-6P-1質(zhì)粒之后的多聯(lián)終止密碼子序列防止通讀，構(gòu)建好的PGEVip質(zhì)?？梢员磉_(dá)攜帶有腸激酶切點(diǎn)完整的單價(jià)Vip83*基因，作為單價(jià)對照。大量提取驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子的pGEVip，后使用EcoR I/Xho I限制性內(nèi)切酶(購自寶生物工程大連有限公司)將pGEVip酶解，酶解體系:100 μ I中含，90 μ I pGEVip質(zhì)粒載體；5 μ I IOXH Buffer ；2.5μ I BamHI ；2.5μ I EcoR I。37°C 過夜。Cry9Ca*基因的擴(kuò)增:根據(jù)Cry9Ca*基因的序列(見圖3B)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物5’端添加EcoR I酶切位點(diǎn)，3’端添加酶切位點(diǎn)Xho I，該引物的DNA序列如下所述:
正向引物(5，-Cry9Ca-EcoRI):5’ AAGGAATTCATGGCTGATTACCTT-3’ 下劃線部分為酶切位點(diǎn)反向引物(3，-Cry9Ca-XhoI):5’ AAGCTCGAGTCAATCCTCTTCTGCC-3’ 下劃線部分為酶切位點(diǎn)以pUC57-C9C質(zhì)粒(圖譜見圖7F)為模板，PCR擴(kuò)增Cry9Ca*。PCR體系如下:
IOxTaq buffer (購自北京 Trans 公司)5μ1
高保真dNTP (10ml,購自北京Trans公司)Ιμ
模板質(zhì)粒PUC57-C9C (由南京Genscript公司合成) Ιμ 正向引物(5’-Cry9Ca- EcoR I , I ΟμΜ).I μ
反向引物(3’-Cry9Ca-Xho I，10μΜ)Ιμ
Taq DNA聚合酶(購自北京Trans公司，2.5υ/μ1)Ιμ
加去離子水至50μ1PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin ；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存5min結(jié)束。將擴(kuò) 增出來的Cry9Ca*PCR產(chǎn)物用EcoR I/Xho I限制性內(nèi)切酶酶解，酶解條件跟體系同上一致。原核表達(dá)質(zhì)粒pGEVC9C的構(gòu)建:將上述酶解后的pGEVip載體與Cry9Ca*PCR產(chǎn)物使用純化試劑盒回收。按照上述連接反應(yīng)體系連接，轉(zhuǎn)化。挑去轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證陽性克隆，將正確插入的克隆質(zhì)粒命名為PGEVC9C，質(zhì)粒全長為9235bp，圖譜如圖6所示。原核表達(dá)質(zhì)粒pGEC9C的構(gòu)建:將提取的pGEX-6P-l質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xho I酶解，酶解條件跟體系同上(同原核表達(dá)質(zhì)粒pGEVip的構(gòu)建步驟)一致。瓊脂糖電泳后使用膠回收試劑盒將酶解產(chǎn)物回收，與經(jīng)EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶酶解后的Cry9Ca片段酶連,酶連條件與體系同上一致(同原核表達(dá)質(zhì)粒pGEVip的構(gòu)建步驟)。轉(zhuǎn)化后，挑去轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證陽性克隆，將正確插入的克隆質(zhì)粒命名為pGEC9C(圖譜如圖8所示)，質(zhì)粒全長為6853bp。構(gòu)建好的pGEC9C質(zhì)粒可以表達(dá)完整的Cry9Ca*基因，作為單價(jià)對照實(shí)施例3 Vip83Cry9Ca*融合基因在大腸桿菌中的原核表達(dá)和生物測定。將pGEVC9C質(zhì)粒，pGEVip質(zhì)粒，和pGEC9C質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主BL21。驗(yàn)證陽性克隆，將鑒定正確的克隆子過夜活化，以體積比為1%的接種量轉(zhuǎn)接至IL含100 μ g/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2_3h，當(dāng)A600達(dá)到0.6左右，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5mM, 22°C，180rpm培養(yǎng)25h。離心收集菌體，然后用I % Tris緩沖液(I %Tris, 50mM NaCl)將菌體洗滌一遍，再用50ml 50mM NaNO3,加入2%巰基乙醇溶液重懸菌體。然后使用高壓破碎儀(購自GEA Niro Soari公司型號:NS10012K)破碎細(xì)胞，收集細(xì)胞破碎液。利用SDS-PAGE方法檢測融合蛋白表達(dá)量。濃縮膠濃度為5 %，配方如下:H2O1.4ml
30%Acr-Bis (29:1)0.33ml
IMTris-HCl, pH6.80.02ml
10%十二烷基硫酸鈉(SDS)0.02ml
10%過硫酸銨0.02ml:N,N,N',NT-四甲基乙二胺(TEMED)0.002ml分離膠濃度為12%，配方如下:
H2O2.45ml
30%Acr-Bis (29:1)3ml
IM Tris-HCl, pH8.82.5ml
10%SDS0.075ml
10%過硫酸銨0.075ml
TEMED0.003ml取80 μ I細(xì)胞破碎液，加入20 μ I蛋白上樣緩沖液(5 X，購買自寶生物工程大連有限公司)，沸水浴5min，然后上樣10 μ I電泳檢測，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果見圖6，表明本發(fā)明構(gòu)建的殺蟲融合基因Vip83Cry9Ca*在大腸桿菌中得到正確表達(dá)，加上5’端的GST標(biāo)簽大小為183.7kDa。而作為對照的單價(jià)Vip83*基因和Cry9Ca*基因也得到了止確表達(dá)，Vip83*基因加上5’端得GST標(biāo)簽后大小為114kDa，Cry9Ca*基因加上前邊的GST標(biāo)簽后大小為95.7kDa(見圖6)?！な褂肂ioRad公司的Quantity One ID凝膠分析軟件，以寶生物工程大連有限公司的Wide Range ProteinMarker中的200kDa條帶為標(biāo)準(zhǔn)(濃度約為Ing/ μ I),根據(jù)光密度
定量融合蛋白濃度。殺蟲融合蛋白毒力的生物測定:使用小菜蛾作為測試?yán)ハx，所作生物測定由湖北科諾生物農(nóng)藥技術(shù)公司完成。小菜蛾的測定采用浸葉法，具體步驟是:將甘藍(lán)葉片用清水洗凈晾干，選取鮮嫩一致的甘藍(lán)葉片切成大小相近的塊狀，將誘導(dǎo)的樣品細(xì)胞超聲波破碎(600Hz)，將破碎液兩倍稀釋后浸泡甘藍(lán)葉片lOmin，將葉片晾干，放入生測瓶中，每瓶接2-3齡小菜蛾幼蟲20頭，每個(gè)處理重復(fù)三次，25°C生化培養(yǎng)箱中保溫，培養(yǎng)48h后調(diào)查死、活蟲數(shù)，并觀察幼蟲取食情況。統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用SPSS軟件計(jì)算半致死濃度LC5tl,本發(fā)明合成的殺蟲融合基因Vip83Cry9Ca與單價(jià)殺蟲基因Vip83，Cry9Ca對小菜蛾的毒力測定如表I所示。表I本發(fā)明合成的殺蟲融合基因?qū)π〔硕甑亩玖?br> 權(quán)利要求
1.一種人工合成的融合殺蟲基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。
2.一種融合殺蟲蛋白，其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO:2所述，其分子量為159.433.40kDa。
3.—種表達(dá)蘇云金芽胞桿菌殺蟲融合蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α /Bt./6p/pGEVC9C，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCNO:M2011363，它包含如序列表SEQ ID NO:2所述的蛋白質(zhì)的序列。
4.權(quán)利要要求I所述的基因在制備蘇云金芽胞桿菌微生物制劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述的大腸桿菌在制備蘇云金芽胞桿菌微生物制劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所 述的殺蟲蛋白在制備蘇云金芽胞桿菌微生物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對鱗翅目有毒的人工合成的蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因，該人工合成的基因包含Vip83Cry9Ca*基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列。包含該基因質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α/Bt./6p/pGEVC9C保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NOM2011363。經(jīng)過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明該殺蟲融合基因?qū)[翅目具有毒性，可專一性毒殺小菜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲。本發(fā)明公開了上述融合蛋白在轉(zhuǎn)基因殺蟲微生物方面的應(yīng)用。
文檔編號A01N63/02GK103074353SQ201110330060
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者劉子鐸, 董方, 林擁軍, 史瑞平 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)