專利名稱：：細菌毒力因子及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及細菌病原體。更特別地，本發(fā)明部分涉及細菌病原體的分泌蛋白及其使用方法。
背景技術：
：大腸桿菌(Escherichiacoli)是多樣性極高的有機體。除了是正常的腸道菌群之外，E.coli的菌株還可引起膀胱感染，腦膜炎和腹瀉。腸出血性(Enterohemorrhagic)E.coli包括至少5種E.coli，其能引起從類似霍亂的腹瀉到極端大腸炎的多種癥狀。每種腸出血性E.coli都具有一套包括粘合素，侵襲素和/或毒素的特異性毒力因子，其負責引起特異性的腹瀉。致腸病性(Enteropathogenic)E.coli(EPEC)是世界范圍內(nèi)嬰兒腹瀉的最主要原因。EPEC疾病的特征是嚴重程度不同的水樣腹瀉，以及嘔吐和通常伴隨脫水的發(fā)燒。除了在發(fā)達國家的日間看護和托兒所中孤立的爆發(fā)之外，EPEC在發(fā)展中國家對嬰幼兒(＜6個月)也是一種主要的地方病健康威脅。在世界范圍內(nèi)，EPEC是嬰幼兒中最主要的細菌介導性腹瀉的原因，據(jù)估計EPEC每天可使數(shù)十萬兒童致死。腸出血性E.coli(EHEC)，也稱為產(chǎn)志賀氏毒素的E.coli(STEC)或產(chǎn)細胞毒素的E.coli(VTEC)，能引起比EPEC(腸性大腸炎)更嚴重的腹瀉，且約占10％的病例，該疾病還可演變成常見的致死性腎臟疾病，溶血性尿毒癥綜合征(HUS)。EHECO157:H7是加拿大和美國最常見的血清型，并且與食物和水中毒有關(3)。其他血清型的EHEC也在亞洲、歐洲和南美洲引起了一些更為嚴重的問題，而北美洲的嚴重情況略差。EHEC寄居于牛并引起A/E損傷，但在成年動物中并不引起疾病，相反卻將有機體擴散至環(huán)境中。由于相對稀少的EHEC就足以感染人類，所以這會引起嚴重的健康問題。與諸如腸毒素性(enterotoxigenic)E.coli的其他E.coli腹瀉不同，由EHEC和EPEC引起的腹瀉并不是由毒素介導的。相反，EPEC和EHEC結合于腸表面(EPEC結合于小腸，EHEC結合于大腸)并引起了特征性的組織損傷，成為附著和消失(A/E)損傷(8)。A/E損傷的特點在于在細菌附著位置上腸刷狀緣表面的溶解和上皮微絨毛的喪失(消失)。一旦發(fā)生結合，細菌就位于類似杯狀的突出物或基架上。在上皮細胞中支撐這一基架的是幾種細胞骨架成分，包括肌動蛋白和與肌動蛋白相連的細胞骨架蛋白。A/E損傷的形成和在附著細菌下方的富含肌動蛋白的基架是A/E病原體的組織病理學標志(1，2)。該病理學可在體外培養(yǎng)的細胞中重現(xiàn)，且基架形成也可通過熒光肌動蛋白染色分析得以觀察(2，11)。A/E損傷的形成可能是破壞所述刷狀緣和微絨毛，流體分泌以及腹瀉的原因。EPEC和EHEC屬于A/E病原體家族，其包括若干種在兔子(REPEC)，豬(PEPEC)和小鼠(Citrobacterrodentium(腸粘膜肥厚癥菌))中引起疾病的EPEC樣動物病原體。這些病原體包括致病島(PAI)，其編碼特異性的分泌系統(tǒng)并分泌對疾病至關重要的毒力因子。一般認為形成A/E損傷的基因在單染色體致病島中是成簇分布的，稱為腸上皮細胞消失座位(LEE)，其包括III型分泌系統(tǒng)(TTSS)，分泌的效應蛋白及其同源的伴侶蛋白(4-8)。所述LEE包括41個基因，使其成為更復雜的PAI。所述LEETTSS的主要功能是將效應物傳遞入宿主細胞中，在那里其破壞宿主細胞功能并介導疾病(9，10，34)?，F(xiàn)已鑒定了5種LEE編碼的效應物(Tir，EspG，EspF，Map和EspH)(35-40)。(針對易位緊密粘附素(intimin)受體的)Tir被易位入宿主細胞中，在那里其與宿主細胞骨架蛋白和信號蛋白結合，并在細菌附著位點啟動了肌動蛋白聚合(31，44)，導致了在附著細菌下方形成了肌動蛋白基架結構，其通過細菌外膜蛋白緊密粘附素與Tir的細胞外環(huán)直接作用。CesT作為Tir穩(wěn)定和分泌的伴侶蛋白發(fā)揮作用(18，19)。還對A/E病原體中的四種其他LEE編碼的TTSS易位效應物進行了表征EspH增強了肌動蛋白基架的延伸(40)；EspF在分解腸上皮細胞的緊密聯(lián)合中具有作用(38)；EspG與志賀桿菌微管結合效應物VirA相關(36，55)；Map位于線粒體(37)，還具有肌動蛋白動力學的作用(48)。(針對LEE編碼的調(diào)節(jié)子的)Ler是目前已鑒定的僅有的LEE編碼的調(diào)節(jié)子。發(fā)明概述本發(fā)明部分根據(jù)的是對A/E病原體的幾種新普通分泌蛋白的鑒定。在一方面，本發(fā)明提供了包括多肽或其片段或變異體，或包括這種多肽的細胞培養(yǎng)上清液的組合物，其中基本上純的所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任意一種或多種序列基本上相同的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了包括核酸分子的組合物，其中所述核酸分子包括與SEQIDNO1-21或60-72的任意一種或多種序列基本上相同的核酸序列；以及包括核酸分子的組合物，其中所述核酸分子編碼與SEQIDNO22-43，或其片段的任意一種或多種序列基本上相同的多肽序列。所述組合物還包括生理可接受的載體，或還包括佐劑。所述組合物還包括多肽或核酸分子，例如EspA，EspB，EspD，EspP，Tir，志賀氏毒素1，志賀氏毒素2或緊密粘附素。所述多肽或核酸分子可能是基本上純的。在其他方面，本發(fā)明還提供了細菌或其制備方法，其中所述細菌在諸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE，nleF，nleG或nleH或其同源物的基因上有突變，或在其基因組上在與SEQIDNO1-21或60-72基本上相同的核酸序列上有突變。在一些實施方案中，所述細菌可以是A/E病原體，例如腸出血性E.coli(EHEC；例如EHECO157:H7或EHECO157:NM)，致腸病性E.coli(EPEC；例如EPECO127:H6)或Citrobacterrodentium(腸粘膜肥厚癥菌)。在某些實施方案中，所述突變可以減弱毒力，或者所述突變可發(fā)生在所述A/E病原體的基因組核酸序列中，所述核酸序列與選自SEQIDNO1-21或60-72的序列基本上相同。所述細菌可與佐劑一起作為組合物提供。在某些實施方案中，所述細菌可以是活的。在某些實施方案中，所述細菌可以是死的。給藥方式可以是口服或經(jīng)腸道外給藥。在其他方面，本發(fā)明還提供了在樣本中測定A/E病原體存在的方法，所述方法是通過，提供樣本；以及測定以下物質的存在包括與選自SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體中的任意一種或多種序列基本上相同的核酸序列的核酸序列；編碼與選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列，或者包括與選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子或多肽的存在說明在所述樣本中(例如蛋、糞便、血液或腸)存在有A/E病原體。所述測定包括用與選自SEQIDNO1-21或60-72的序列基本上相同的探針或引物，或編碼與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其部分基本上相同的多肽的核酸序列接觸所述核酸序列，或者所述方法包括用抗體接觸所述氨基酸序列，所述抗體特異性地結合于選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列。在其他方面，本發(fā)明還通過鑒定動物感染了A/E病原體或具有A/E病原體感染的風險；以及向所述動物給藥有效量的組合物，提供了在動物(例如，人，反芻動物，例如綿羊(羊屬)，山羊，牛(牛屬)，等等；獲任一其他動物，例如，豬，兔，家禽(例如，鴨，雞，火雞)等等)體內(nèi)引起針對A/E病原體或其成分的免疫反應的方法，或降低A/E病原體集群或擴散的方法，所述組合物包括與SEQIDNO22-43、59或73-84中任意一種或多種序列基本上相同的氨基酸序列的多肽；編碼與選自SEQIDNO22-43、59或73-84的序列基本上相同的多肽序列的核酸序列；包括與SEQIDNO1-21或60-72的任意一種或多種序列基本上相同的核酸序列的核酸分子；或包括這些多肽的細胞培養(yǎng)上清液，由此在所述動物體內(nèi)引起免疫反應，或降低所述A/E病原體在所述動物中的集群或擴散。在其他方面，本發(fā)明還提供了減弱A/E病原體毒力的方法，所述方法包括在所述A/E病原體中突變諸如nleA，nleB，nleC，nleD，nleE，nleF，nleG或nleH或其同源物中的基因，或在所述A/E病原體基因組中突變一種或多種核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNO1-21或60-72，由此減弱毒力。在其他方面，本發(fā)明還提供了篩選減弱A/E病原體毒力的化合物的方法，所述方法包括提供一個系統(tǒng)(例如，細胞，如EHEC、EPEC或C.rodentium細胞，動物模型，或體外系統(tǒng))，該系統(tǒng)包括包括與SEQIDNO22-43、59或73-84、或其片段或變異體基本上相同的一種或多種氨基酸序列的多肽；編碼與選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體基本上相同的一種或多種序列的核酸序列；或包括與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體基本上相同的任意一種或多種序列的核酸分子；提供測試化合物；及測定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)所述多肽或核酸分子的表達、分泌或生物活性，其中所述多肽或核酸分子的改變，例如表達、分泌或生物活性的降低說明該化合物減弱了A/E病原體的毒力。在其他方面，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生A/E病原體毒力因子的方法，該方法包括提供重組細胞，所述重組細胞包含包括與SEQIDNO22-43、59或73-84或其片段或變異體的任一氨基酸序列基本上相同的多肽；編碼與選自SEQIDNO22-43、59或73-84或其片段或變異體的任一氨基酸序列基本上相同的多肽序列的核酸序列；或包括與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體中任一序列基本上相同的核酸序列的核酸分子；在允許所述多肽表達和/或分泌的條件下培養(yǎng)所述重組細胞，且任選地，分離所述多肽。在一些實施方案中，所述多肽可從所述細胞中分泌出來。在其他方面，本發(fā)明還通過鑒定動物感染了A/E病原體或具有感染A/E病原體的風險；及向所述動物給藥有效量的減弱A/E病原體毒力的化合物，其中所述化合物抑制包括與SEQIDNO22-43、59或73-84或其片段或變異體中任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的表達和分泌，提供了治療或預防由A/E病原體引起的感染的方法。在一些實施方案中，所述化合物可以是與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體中任一序列基本上相同的核苷酸序列互補的反義核酸分子，或者是siRNA。在其他方面，本發(fā)明還提供了包括與SEQIDNO22-43、59或73-84的序列基本上相同的氨基酸序列的重組多肽，或包括與SEQIDNO1-21或60-72的序列基本上相同的核酸序列的分離的核酸分子；和/或包括這些核酸序列的載體；和或包括這些載體的宿主細胞(例如，A/E病原體，例如腸出血性E.coli(EHEC)，致腸病性E.coli(EPEC)或Citrobacterrodentium。所述載體可以能夠整合入A/E病原體的基因組也可以不能整合入A/E病原體的基因組。在其他方面，本發(fā)明還提供了基于本發(fā)明的所述組合物、細菌、多肽或核酸分子在制備引起針對A/E病原體或其成分產(chǎn)生免疫反應、或降低在動物中A/E病原體的擴散或集群的藥物中的用途。在其他方面，本發(fā)明還提供了包括在樣本中測定A/E病原體的試劑以及教導在樣本中測定A/E病原體的包裝說明書的試劑盒。所述試劑包括與選自SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的任意一種或多種基本上相同的核酸序列，或編碼與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任意一種或多種基本上相同的多肽的核酸序列基本上相同的探針或引物探針或引物，或特異性地結合于選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任意一種或多種序列的抗體?！癆/E病原體”是一種病原體，例如致病性的E/coli細菌，其可以結合于動物的腸表面，例如牛、綿羊、山羊、豬、兔、狗、貓等等的動物，或例如雞、鴨、火雞等等的禽類，并引起特征性的組織損傷，稱作附著和消失(A/E)損傷(8)。一般地，A/E致病性感染可導致腹瀉，腸性大腸炎，腎臟疾病(例如溶血性尿毒癥綜合征)。然而，A/E病原體感染并不一定會表現(xiàn)出疾病的癥狀；感染了A/E病原體的宿主動物可以是該病原體的攜帶者，并保持健康且未罹患疾病。因此，感染了A/E病原體或具有感染A/E病原體風險的哺乳動物，包括農(nóng)業(yè)動物，例如家禽，如雞，火雞，鴨，或反芻動物，如牛，綿羊，山羊等等，或其他農(nóng)業(yè)動物，如豬的動物，以及人類都并未表現(xiàn)出疾病的癥狀，作為感染了A/E病原體的結果，他們易患有嚴重的腸疾病。示例性的A/E病原體包括且不限于腸出血性E.coli(EHEC)(也稱為產(chǎn)志賀氏毒素的E.coli(STEC)或產(chǎn)細胞毒素的E.coli(VTEC))，例如EHEC血清型O157(例如，EHECO157:H7，其基因組序列在登錄號為AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC_002695或NC_002655)，或0158，05，08，018，026，045，048，052，055，075，076，078，084，91，0103，0104，0111，0113，0114，0116，0118，0119，0121，0125，028，0145，0146，0163，0165；致腸病性E.coli(EPEC)；以及感染小鼠(例如，Citrobacterrodentium)；兔(例如，RDEC-1株，例如O15H-)；豬；綿羊；狗和其他動物的致病性E.coli。許多A/E病原體菌株是可商業(yè)獲得的，例如，通過美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，Manassus，VA，美國。還可以從被感染的個體中分離A/E病原體，例如，通過在補充有頭孢克肟和亞碲酸鹽或免疫磁性富集物的山梨醇MacConkey瓊脂上直接涂布，然后在相同的培養(yǎng)基上進行涂布(72，107，108)得以分離。“蛋白”，“肽”或“多肽”是二種或更多種氨基酸的任意鏈，包括自然發(fā)生或非自然發(fā)生的氨基酸或氨基酸類似物，無論翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)的情況。本發(fā)明的“氨基酸序列”，“多肽”，“肽”或“蛋白”可包括具有異常連接、交聯(lián)和末端帽子，非肽鍵或其他修飾基團的多肽或蛋白。這些修飾基團也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。術語“修飾基團”是指包括直接附著于所述肽結構(例如，通過共價軛合)的結構，以及那些間接附著于所述肽結構(例如，通過穩(wěn)定的非共價連接或通過共價偶聯(lián)于其他的氨基酸殘基或其模擬物、類似物或衍生物，其可以位于所述核心肽結構的側翼)的結構。例如，所述修飾基團可以偶聯(lián)于肽結構的氨基末端或羧基末端，或偶聯(lián)于所述核心結構域側翼的肽或肽模擬結構?；蛘?，所述修飾基團可以軛合于肽結構的至少一個氨基酸殘基的側鏈，或偶聯(lián)于所述核心結構域側翼的肽或肽模擬區(qū)域(例如，通過賴氨酰殘基的ε氨基，通過天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基，通過酪氨酰殘基、絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基，或在氨基酸側鏈上的其他適合的反應基團)。共價偶聯(lián)于所述肽結構的修飾基團可通過本領域中公知的方式和方法結合于連接性化學結構，包括，例如酰胺，烷氨基，氨基甲酸鹽或尿素鍵。術語“核酸”或“核酸分子”包括了RNA(正鏈和負鏈)和DNA，包括cDNA，基因組DNA和合成的(例如化和合成的)DNA。所述核酸可以是雙鏈的或單鏈的。當以單鏈存在時，所述核酸可以是有義鏈或反義鏈。核酸分子可以是兩種或更多種共價結合核苷酸的任意鏈，包括自然產(chǎn)生或非自然產(chǎn)生的核苷酸，或核苷酸類似物或衍生物?！癛NA”是指兩種或更多種共價結合、自然發(fā)生或被修飾的核糖核苷酸的序列。該術語中修飾RNA的一個例子是磷硫酰RNA。“DNA”是指兩種或更多種共價結合、自然發(fā)生或被修飾的脫氧核苷酸的序列?！癱DNA”是指通過依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)的反應從RNA模板產(chǎn)生的互補或拷貝DNA。因此，“cDNA克隆”是指在克隆載體中攜帶的，互補于感興趣的RNA分子的雙鏈DNA序列?！盎パa”是指兩種核酸，例如DNA或RNA，含有能夠形成沃森-克里克堿基對的足夠數(shù)量的核酸，從而在所述兩種核酸之間形成雙鏈區(qū)域。因此，在一條DNA或RNA鏈中的腺嘌呤與相互補DNA鏈中的胸腺嘧啶或相互補RNA鏈中的尿嘧啶配對。應該理解，核酸分子中的每一個核苷酸并不必須與相互補鏈的核苷酸形成匹配的沃森-克里克堿基對才能形成雙鏈。如果一個核酸分子可與另一個核酸分子在較嚴謹?shù)臈l件下雜交，那么該核酸分子是與另一個核酸分子“互補”的。在此使用的“細胞培養(yǎng)上清液”一般是指從培養(yǎng)的細菌或其他有機體(例如，酵母)或細胞(例如，昆蟲細胞)中得到的上清液，所述培養(yǎng)物能夠向所述細胞培養(yǎng)基中分泌出含有與SEQIDNO22-43、59或73-84或其片段或變異體中任一序列基本上相同的氨基酸序列的一種或多種多肽。在一些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)上清液是基本上純的，即，基本上沒有細菌細胞或這些細胞的裂解物。在一些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)上清液可以含有EspA，EspB，EspD，Tir，緊密粘附素(intimin)，志賀氏毒素1或2，EspP多肽或其片段或集合物。所述細菌可以是A/E病原體，例如，EHEC，EPEC或Citrobacterrodentium，其在一些實施方案中可以被修飾或突變成主要表達或分泌此述的蛋白，所述細菌也可以是其他的細菌，例如，非致病細菌，例如諸如HB101的非致病E.coli，或者非A/E病原體，可通過例如重組或其他技術對其進行修飾或突變，從而將此述的一種或多種蛋白，例如，含有與SEQIDNO22-43、59或73-84或其片段或變異體中、或其免疫原性的部分的任一序列基本上相同的氨基酸的多肽分泌到所述細胞培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，所述細菌不是EHEC和EPEC。在一些所述細菌是A/E病原體的實施方案中，其可以含有進一步的修飾，所述修飾會削弱其表達或分泌多肽(例如，EspA，EspB，EspD，Tir，緊密粘附素，志賀氏毒素1或2，或EspP)的能力，所述多肽是在沒有所述修飾時的正常分泌的。在一些實施方案中，可對其他的有機體(例如，酵母)或細胞(例如，昆蟲細胞)進行修飾或突變，例如，通過重組或其他技術，從而向所述細胞培養(yǎng)基中分泌一種或多種此述的蛋白，例如，含有與SEQIDNO22-43，或其免疫原性部分的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。當某種化合物從其天然伴隨成分中分離出來的時候，該化合物是“基本上純的”或“分離的”。通常地，當其至少為樣本中所述總材料的10％、20％、30％、40％、50％或60％，或更通常地至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％重量比時，該化合物是基本上純的。因此，例如，通過化學合成或重組技術生產(chǎn)的多肽通?；旧喜缓衅涮烊唤Y合的成分。如果通過物理技術，例如離心，沉淀，柱層析，凝膠電泳，HPLC等等將某種多肽與其天然結合的成分分離，則該多肽一般是基本上純的。當某種核酸分子沒有與所述編碼序列緊鄰(即共價連接)時，該核酸分子通常是基本上純的或“分離的”，而所述編碼序列通常在所述有機體的自然發(fā)生基因組中是相鄰的，從所述有機體中得到了本發(fā)明的DNA。因此，“分離的”基因或核酸分子是指并不位于通常在所述基因或核酸分子(例如在基因組序列中)側翼，但和/或已完全或部分地從其他轉錄序列(作為cDNA或RNA文庫)中純化出來的基因或核酸分子。例如，本發(fā)明的分離的核酸可以是根據(jù)自然發(fā)生的復雜細胞環(huán)境中基本上分離出來的。在某些情況下，所述分離的材料可以形成部分的組合物(例如，含有其他物質的粗提取物)，緩沖體系或試劑混合物。在其他情況中，所述材料可以被純化成完全均一的狀態(tài)，正如通過PAGE或諸如HPLC的柱層析測定的那樣。該術語因此包括，例如，整合入載體的重組核酸，例如自我復制的質?；虿《荆换蜻M入原核生物或真核生物的基因組DNA的核酸，或以獨立于其他序列的分離的分子存在的核酸(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。其還包括了編碼其他多肽序列的部分雜交基因的重組核酸。優(yōu)選地，分離的核酸包括所有存在的大分子類型中的至少50％、80％或90％(摩爾比)。因此，分離的基因或核酸分子可以包括通過化學合成或重組方式得到的基因或核酸分子。包含于載體中的重組DNA也包括在此述的“分離”定義之內(nèi)。同樣，分離的核酸分子還包括了異源宿主細胞中的重組DNA分子，以及溶液中部分或完全純化的DNA分子。本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)和體外RNA轉錄本也包括在“分離的”核酸分子之內(nèi)。這樣的分離的核酸分子在制備所編碼的多肽中非常有用，可作為分離同源序列的探針(例如，從其他哺乳動物種類中)，作為基因定位的探針(例如，通過與染色體的原位雜交)，或作為測定所述基因在系統(tǒng)中表達的探針(例如，人類組織，例如外周血)，例如Northern雜交分析?？梢酝ㄟ^例如從天然來源進行提??；通過表達編碼多肽化合物的重組核酸分子；或通過化學合成可得到基本上純的化合物?？梢圆捎萌我膺m合的方法進行純度的分析，例如柱層析，凝膠電泳，HPLC等等。基本上純的細胞，例如，細菌細胞的制劑，其中污染的細胞并不具有所希望的突變基因型，或并未表達或分泌足量所希望的多肽，在所述制劑細胞中其組成低于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的總數(shù)量。本發(fā)明中的各種基因和核酸序列可以是重組序列。術語“重組子”是指重組的東西，因此當參照核酸構建體進行制備時，該術語是指由結合到一起或由分子生物學方法制備的核酸序列構成的分子。當參照蛋白或多肽進行制備時，術語“重組子”是指由分子生物學技術構建的采用重組核酸構建體進行表達的蛋白或多肽分子。當參照遺傳組合物進行制備時，術語“重組子”是指具有新的在父代基因組中未出現(xiàn)的等位基因組合的配子和后裔。重組核酸構建體可包括連接于或被操作變?yōu)檫B接于天然并不連接或天然在不同位點的核酸序列的核苷酸序列。參照作為“重組子”的核酸構建體可由此說明可使用遺傳工程，即通過人工干預對所述核酸分子進行操作。可通過轉化示例性地將重組核酸構建體引入宿主細胞中。這樣的重組核酸構建體可包括來自所述相同宿主細胞類型或來自不同宿主細胞類型的序列，其可被分離出來并重新導入所述宿主類型的細胞。作為所述宿主細胞原始轉化的結果，或作為隨后的重組和/或修復事件的結果，重組核酸構建體序列可整合入宿主細胞基因組。對核酸或蛋白而言，本文所使用的“異源”一詞是指通過人工干預進行操作，使其不處于其天然發(fā)現(xiàn)的位置上。例如，可將來自一個物種的核酸序列引入其他物種的基因組中，或者將來自一個基因座位的核酸序列移動至相同物種的其他基因座位或染色體外座位。異源蛋白包括，例如，表達來自異源編碼序列的蛋白，或表達來自天然不能表達所述蛋白的細胞中的重組基因的蛋白?！盎旧舷嗤摹毙蛄惺桥c參考序列相比僅有一個或多個保守性替換區(qū)別的氨基酸或核苷酸序列，正如在本文中所討論的那樣，或在所述序列位點的一個或多個非保守型替換，缺失或插入并不會破壞所述氨基酸或核酸分子的生物學功能。這樣的序列可以是從10％-90％的任一整數(shù)，或更一般地在所述氨基酸或核苷酸水平與用于比較的序列有至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多至96％、97％、98％或99％的一致，例如，排列程序(96)或FASTA。對多肽而言，所述比較序列的長度可以是至少2、5、10或15個氨基酸，或至少20、25或30個氨基酸。在其他實施方案中，所述比較序列的長度可以是至少35、40或50個氨基酸，或超過60、80或100個氨基酸。對核酸分子而言，所述比較序列的長度可以是至少5、10、15、20或25個核苷酸，或是至少30、40或50個核苷酸。在其他實施方案中，所述比較序列的長度可以是至少60、70、80或90個核苷酸，或超過100、200或500個核苷酸?？刹捎霉部色@得的序列分析軟件(例如，GeneticsComputerGroup的序列分析軟件包，威斯康星大學生物工程中心，1710大學大道，麥迪遜，Wis.53705，或者是來自于國立醫(yī)學圖書館的BLAST軟件，或如本文所述的軟件)方便地測定序列一致性?？捎密浖氖纠≒ile-up和PrettyBox。通過指定對各種替換，缺失，取代和其他修飾的同源性程度進行比對，這些軟件可對類似的序列進行匹配?？蛇x擇地，或除此之外，如果兩個核酸序列在較高的嚴謹條件下能雜交的話，則這兩個核酸序列也是“基本上相同的”。在一些實施方案中，較高的嚴謹條件是，例如，能允許與使用至少500個核苷酸長度的DNA探針，在含有0.5MNaHPO4，pH7.2，7％SDS，1mMEDTA和1％BSA(組分V)的緩沖液，在65℃，或在含有48％甲酰胺，4.8×SSC，0.2MTris-Cl，pH7.6，1xDenhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖和0.1％SDS的緩沖液，在42℃條件下的雜交相當?shù)碾s交條件(這些是對Northern或Southern雜交的常見的較高的嚴謹條件)。雜交實施的時間可以是約20-30分鐘，或約2-6小時，或約10-15小時，或超過24小時或更長。高嚴謹性的雜交也依賴于由分子生物學家實施的多種常規(guī)技術的成功，例如高保真性的PCR，DNA測序、單鏈構象多態(tài)分析以及原位雜交。與Northern或Southern雜交不同，這些技術通常是采用相對較短的探針進行的(例如，通常為約16個核苷酸或更長的序列進行PCR或測定，以及約40個核苷酸或更長的序列進行原位雜交)。用于這些技術中的所述高嚴謹條件是分子生物學領域所屬技術人員公知的(61)?；旧舷嗤男蛄锌梢允?，例如，與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任一序列基本上相同的氨基酸序列，或與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的任一序列基本上相同的核酸序列。在一些實施方案中，基本上相同的序列可以是，例如，與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的任一序列互補或雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，基本相同的序列可以源自A/E病原體?！疤结槨被颉耙铩笔悄芘c含有互補序列的(所述靶)的另一種DNA或RNA分子堿基配對的，具有確定序列的單鏈DNA或RNA分子。所得雜交分子的穩(wěn)定性依賴于所發(fā)生的堿基配對的程度，并受到諸如所述探針和靶分子之間互補程度，以及所述雜交條件嚴謹程度的參數(shù)影響。雜交嚴謹性的程度受到了諸如溫度、鹽濃度和諸如甲酰胺的有機分子的濃度的參數(shù)的影響，并可通過本領域所屬技術人員公知的方法來確定。針對此述的核酸序列或其部分的特異性探針或引物可以在至少8個核苷酸至超過500個核苷酸的整數(shù)長度進行變化，包括其中的任一的數(shù)值，依賴于雜交的目的以及進行的條件，可以使用所述探針或引物。例如，探針或引物可以是至少8、10、15、20或25個核苷酸長度，或者至少30、40、50或60個核苷酸長度，或可超過100、200、500或1000個核苷酸長度。針對與此述核酸分子的特異性探針或引物可以是從10％-90％的任一整數(shù)，或更一般地有至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多至96％、97％、98％或99％地與使用例如排列程序(96)的此述的核酸序列相同。通過本領域所屬技術人員公知的方法，探針或引物可以是具有可檢測性標記的，或者是放射性的或者是非放射性的。探針或引物可用于涉及核酸雜交的方法，例如核酸測序，通過聚合酶鏈反應的核酸擴增，單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析，限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析，Southern雜交，Northern雜交，原位雜交，電泳遷移率變動分析(EMSA)，和其他本領域所屬技術人員公知的方法。探針或引物可來自于基因組DNA或cDNA，例如，通過擴增，或來自克隆的DNA片段，或者是通過化學合成的?！巴蛔儭卑ó斉c所述父系菌株相比較時，在DNA序列，即有機體的基因組中的任意改變。所述改變可能是自發(fā)產(chǎn)生的，或是通過將所述有機體暴露于突變性的刺激引起的，例如突變性的化學物質，能量，輻射，重組技術，交配或其他用來改變DNA的技術。突變可以包括在此述的任一核苷酸序列中的改變，或者可包括在此述的編碼任一所述多肽的核酸序列中的改變。當與其父系菌株相比時，如果作為突變的結果，所述突變細胞的毒力水平降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，那么該突變可以是“減弱毒力”的。當與所述父系菌株比較時，可以通過測定在所述突變株中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多肽表達的降低，例如，包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽表達的降低，來測定毒力的降低?？梢酝ㄟ^此述的方法或本領域公知的方法測定A/E病原體的毒力。可以通過測定在所述多肽的生物學活性至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的改變，例如，包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽生物學活性，來測定毒力的降低?！癕odulating(調(diào)節(jié))”或“Modulates(調(diào)節(jié))”是指通過增加或降低完成的改變。當與對照或參考樣本或化合物進行比較時，所述增加或降低可以是在介于10％至90％之間任一整數(shù)的改變，或介于30％至60％之間的任一整數(shù)，或也可能超過100％?！皺z測化合物”是任一的自然發(fā)生或人造來源的化合物。檢測化合物可以包括，但不限于，肽、多肽、合成的有機分子，自然發(fā)生的有機分子和核酸分子。檢測化合物可以與公知的諸如本文所述的任一多肽或核酸分子的化合物“競爭”，例如，對毒力的干擾，或對由公知化合物誘導的任一生物學反應的干擾。一般地，當與參考化合物相比較時，檢測化合物可表現(xiàn)出介于10％至200％，或超過500％的任一數(shù)值的調(diào)節(jié)。例如，檢測化合物可表現(xiàn)出至少從10％至200％的任意正整數(shù)或負整數(shù)的調(diào)節(jié)，或至少從30％至150％的任意正整數(shù)或負整數(shù)的調(diào)節(jié)，或至少從60％至100％的任意正整數(shù)或負整數(shù)的調(diào)節(jié)，或任意超過100％的正整數(shù)或負整數(shù)的調(diào)節(jié)。相對于公知的化合物，負調(diào)節(jié)劑的化合物一般可以降低調(diào)節(jié)，而與公知的化合物相比，正調(diào)節(jié)劑的化合物一般可以升高調(diào)節(jié)。“載體”是來自于例如質粒、噬菌體或哺乳動物或昆蟲病毒，或人工染色體的DNA分子，可向其中插入核酸分子，例如，與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的任一序列基本上相同的核酸序列。載體可以含有一種或多種唯一的限制行位點，或可以在限定的宿主或載體有機體中自主復制，因此所克隆的序列是可再生的。載體可以是DNA表達載體，即，能夠指導重組多肽合成的任意自主成分，因此可以用來表達多肽，例如，包括在宿主細胞中的與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。DNA表達載體包括細菌質粒和噬菌體、和哺乳動物和昆蟲質粒和病毒。載體能夠整合入宿主細胞的基因組中，因此經(jīng)由所述載體引入所述宿主細胞基因組的任一修飾都變成了所述宿主細胞的部分基因組。載體也可以不整合入所述宿主細胞的基因組，因此保持其自主復制單位，例如質粒。當抗體識別并與抗原，例如，包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的任一序列基本上相同的氨基酸序列的多肽結合時，所述抗體“特異性地結合”于抗原，但基本上不識別和結合樣本中的其他分子。這樣的抗體具有例如針對所述抗原的親和性，其至少10，100，1000或10000倍高于所述抗體與樣本中其他參考分子的親和性?！皹颖尽笨梢允侨我鈴膫€體中分離的器官，組織，細胞或細胞提取物，例如從被A/E病原體感染的動物中分離的樣本，或給藥了本發(fā)明的一種或多種多肽或核酸分子，或其免疫原性片段的動物。例如，樣本可包括，但不限于，從患者(人或動物)、檢測個體或實驗動物獲得的組織(例如，來自活組織檢查或尸檢)、細胞、血液、血清、乳汁、尿液、糞便、唾液、排泄物、蛋、哺乳動物細胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基，或任意其他標本，或其提取物。樣本還可包括，但不限于，通過正常或轉化的細胞在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物(例如，通過重組DNA或單克隆抗體技術)?！皹颖尽边€可以是在實驗條件下構建的細胞或細胞系，而不是直接從個體直接分離得到的。樣本還可以是無細胞的，人造來源的或合成的。可對所述樣本進行分析，適用本領域公知的方法和/或此述的方法測定來自A/E病原體的基因、基因組、多肽、核酸分子的存在，或測定來自A/E病原體的突變，或測定來自A/E病原體的基因或多肽的表達水平，或測定來自A/E病原體的基因或多肽的生物學功能。例如，諸如測序、單鏈構象多態(tài)(SSCP)分析，或對來自樣本的PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析都可用來測定基因中的突變；ELISA或Western雜交可用來測定多肽或抗體的親和性水平；Northern雜交可用來測定mRNA水平，或可用PCR來測定核酸分子的水平?！懊庖叻磻卑ǖ幌抻冢诮o藥了所述組合物或疫苗之后，一種或多種動物中的以下反應抗體的誘導，特異性針對所述組合物或疫苗的B細胞，T細胞(包括輔助性T細胞，抑制性T細胞，細胞毒性T細胞，γδT細胞)的誘導。因此針對組合物或疫苗的免疫反應一般包括在宿主動物中由細胞和/或抗體介導的對所述感興趣的組合物或疫苗的反應的發(fā)展。一般地，所述免疫反應會導致對A/E病原體產(chǎn)生的感染的預防和降低；導致對A/E病原體產(chǎn)生的對腸的集群的抵抗；或導致對A/E病原體產(chǎn)生的擴散的降低。多肽或核酸分子的“免疫原性片段”是指能夠引起免疫反應的氨基酸或核苷酸序列。因此，免疫原性片段可包括而不限于，此述任意所述序列的任意部分或與該序列基本上相同的序列，其包括一種或多種抗原決定簇(被特異性免疫系統(tǒng)細胞，例如T細胞或B細胞識別的位點)。例如，免疫原性片段可包括但不限于，例如來自此述的一種多種序列的介于6和60個之間任一數(shù)值，或超過60個氨基酸長度的多肽，例如介于10和20個之間任一數(shù)值氨基酸長度的多肽，或介于20和40個氨基酸長度的多肽?？刹捎帽绢I域所屬技術人員公知的標準方法，例如抗原決定簇定位技術或采用例如來自OxfordMolecularGroup的Omiga1.0程序進抗原性或行水療法作圖對這些片段進行鑒定(參見，例如，美國專利第4,708,871號)(76，77，81，92，73)。附圖的簡要描述圖1A-F所示為來自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQIDNOs1-3和22-24)的NleA的核苷酸和氨基酸序列。圖2A-J所示為來自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQIDNOs4-7和25-29和60)的NleB的核苷酸和氨基酸序列。圖3A-F所示為來自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQIDNOs8-10和30-32)的NleC的核苷酸和氨基酸序列。圖4A-F所示為來自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQIDNOs11-13和33-35)的NleD的核苷酸和氨基酸序列。圖5A-H所示為來自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQIDNOs14-17和36-39)的NleE的核苷酸和氨基酸序列。圖6A-H所示為來自C.rodentium，EPEC和EHEC(SEQIDNOs18-21和40-43)的NleF的核苷酸和氨基酸序列。圖7所示為C.rodentiumOrf11/GrlA(SEQIDNO56)與陽性轉錄調(diào)節(jié)因子，CaiF(SEQIDNO57)，以及與未表征的沙門氏菌蛋白(SEQIDNO58)的推斷的氨基酸序列的氨基酸序列比對。下劃線部分是預測的DNA結合蛋白的螺旋-回轉-螺旋基序。*所示為一致的氨基酸殘基，而保守性的改變用+表示。圖8所示為通過來自C.rodentium(pCRorf11)，EHEC(pEHorf11)或EPEC(pRPorf11)的orf11表現(xiàn)出的C.rodentiumΔorf11的互補，以及由C.rodentiumler或orf11表現(xiàn)出的C.rodentiumΔler-Δorf11的雙突變的互補。圖9所示為在EHECO157:H7基因組中含有6個新鑒定的效應物基因的O島的相對位置的示意圖。同樣表示出了志賀氏毒素基因(stx)，LEE和inv-spaTTSS的位置。需要注意的是許多與原噬菌體相關的基因(CP-933和BP-933)。圖10A-B所示為對EHEC分泌蛋白的蛋白組學分析。A.來自野生型EHEC(wt)和III型分泌突變體(escN-)總分泌蛋白的1維SDS-PAGE凝膠電泳。分子量標記的遷移情況如所述凝膠的左側所示(以kDa為單位)。B.來自野生型EHEC的總分泌蛋白的2維凝膠電泳。分子量標記的遷移情況如所述凝膠的左側所示(以kDa為單位)，大約的pI值如凝膠的頂部所示。對采用質譜分析的蛋白點(參見表I)進行了圈畫和編號。圖11A-C所示為NleA的基因組組織，分布和保守情況。A.在EHEC基因組中圍繞nleA的代表性區(qū)域示意圖。箭頭所指為每個ORF的轉錄方向。對ORF的注釋來自于對(3)的修飾。將NleA以粗體突出顯示。B.對來自EPEC，EHEC，REPEC，Citrobacterrodentium(Citro.)和非致病性E.coli菌株HB101的基因組DNA進行的Southern雜交分析。將每個基因組DNA樣本用BamHI(泳道1，4，7，10，13)，EcoRI(泳道2，5，8，11，14)和PstI(泳道3，6，9，12，15)進行消化。C.對來自EHEC，緊密粘附素陽性的原噬菌體，非O157EHEC菌株(O84:H4)，EPEC和Citrobacterrodentium的NleA的多重蛋白序列比對。一致的序列由點(.)代表，與特異性序列相比缺乏的氨基酸由虛線(-)代表。在所述EHEC序列中，將推測的作為跨膜結構域的兩個疏水性部分突出顯示。圖12所示為野生型(wt)EHEC和表達pNleA-HA的III型分泌突變體(escN-)的分泌蛋白(左泳道)，細菌沉淀(右泳道)以及未轉化對照的Western雜交分析。用抗HA(A.)，抗DnaK(B.)，抗Tir(C.)作為探針進行雜交。圖13A-B所示為在ΔnleAEHEC中的III型分泌和易位。A.來自野生型EHEC(wt)和所述ΔnleA突變體的總分泌蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳。分子量標記的遷移情況如所述凝膠的左側所示(以kDa為單位)。B.用抗NleA抗血清對野生型EHEC(wt)和所述ΔnleA突變體的分泌蛋白的Western雜交分析。分子量標記的遷移情況如所述凝膠的左側所示(以kDa為單位)。圖14A-B所示為感染的宿主細胞組分的Western雜交分析。A.用野生型(wt)或表達HA-標記NleA的escN-EHEC感染HeLa細胞，并通過差速離心得到亞細胞組分。用于分析的組分有細菌，未破碎的細胞核細胞骨架(低速沉淀)，宿主細胞胞液(宿主胞液)，以及宿主細胞膜(宿主細胞膜)。使用抗HA，抗DnaK，抗鈣聯(lián)接蛋白(Calnexin)和抗微管蛋白(tubulin)抗體對所述組分進行Western雜交分析。B.將用表達HA-標記NleA的野生型EHEC感染細胞的膜成分提取出來。然后在冰上在高鹽(1MNaCl)，高pH(pH11.4)，中性pH和等滲鹽(對照)中，或在中性pH和含有1％的tritonx100(TritonX100)的等滲鹽中對膜成分進行提取，并且離心從而得到可溶(S)和不可溶(P)的膜組分。將這些成分用于采用抗HA(頂圖)，抗鈣聯(lián)接蛋白(中圖)和抗鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)(底圖)抗體的Western雜交分析。圖15A-D所示為小鼠中Citrobacterrodentium的毒力研究。A.以抗NleA抗血清為探針，對來自野生型C.rodentium(wt)和所述ΔnleA突變體的總細菌提取物進行的Western雜交分析。分子量標記的遷移情況如所述凝膠的左側所示(以kDa為單位)。B.用野生型C.rodentium(黑色方塊)，ΔnleAC.rodentium(空心圓)感染的C3H/HeJ小鼠，以及之前用ΔnleA突變體感染過且隨后用用野生型C.rodentium(垂直小棒)刺激過的小鼠的存活作圖。在感染階段每天對小鼠進行監(jiān)測，一旦有任何小鼠變顯出瀕死癥狀立即處死。所示為在每一組中在每一天存活小鼠與起始小鼠數(shù)量的百分比。C.來自被感染的NIHswiss小鼠的結腸C.rodentium的滴度。感染了野生型C.rodentium(黑色圈)或ΔnleA菌株(空心圓)的小鼠在感染后10天被處死。將結腸組織和糞便塊勻漿并涂布于MacConkey瓊脂上從而測定在處死時所述小鼠結腸中的總C.rodentium負荷。實驗中的每一只小鼠由一個點代表。在圖中每一組的平均值由水平的橫杠表示。D.測定被感染的NIHswiss小鼠的大腸和脾臟重量。感染了野生型C.rodentium(黑色方塊和三角)或ΔnleA菌株(空心圓和三角)的小鼠在感染后10天被處死。分離出結腸(方塊)和脾臟(三角形)并稱重。實驗中的每一只小鼠由一個點代表。在圖中每一組的平均值由水平的橫杠表示。圖16A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs61和73)的NleG同源物的核苷酸和氨基酸序列。圖17A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs62和74)的NleH1的核苷酸和氨基酸序列。圖18A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs63和75)的NleH2的核苷酸和氨基酸序列。圖19A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs64和76)的Z2076的核苷酸和氨基酸序列。圖20A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs65和77)的Z2149的核苷酸和氨基酸序列。圖21A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs66和78)的Z2150的核苷酸和氨基酸序列。圖22A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs67和79)的Z2151的核苷酸和氨基酸序列。圖23A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs68和80)的Z2337的核苷酸和氨基酸序列。圖24A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs69和81)的Z2338的核苷酸和氨基酸序列。圖25A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs70和82)的Z2339的核苷酸和氨基酸序列。圖26A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs71和83)的Z2560的核苷酸和氨基酸序列。圖27A-B所示為來自EHEC(SEQIDNOs72和84)的Z2976的核苷酸和氨基酸序列。發(fā)明詳述采用可用來顯著提高分泌的陽性LEE調(diào)節(jié)劑(LEE活化物的全能調(diào)節(jié)劑(GlobalRegulator)，或GrlA)，我們鑒定了幾種針對A/E病原體的新的常見分泌蛋白(表2)，并使得我們可采用基于蛋白組學的方法對通過所述LEE編碼的TTSS分泌的蛋白進行功能性的篩選。這些新的蛋白，稱為Nle(非LEE編碼的效應物)A-H，存在于含有LEE的病原體中，而并不存在于非致病性的E.coli菌株和非LEE的病原體中，其是由存在于A/E病原體中的3PAI在LEE外部編碼的，并與所述LEE公進化(3，8)。對這些蛋白的鑒定，在一些情況下，使得賦予了之前功能未知的ORF的功能。示例性的蛋白，NleA(p54)，是包括C.rodentium，EPEC和EHEC的A/E病原體中的III型效應物，并在行使毒力中具有重要作用。與LEE不同，NleA是在所述EHEC基因組內(nèi)在噬菌體相關致病島中編碼的。所述LEE編碼的TTSS指導了將NleA易位入宿主細胞中，在那里其定位于高爾基體上。nleA存在于含有LEE的病原體中，而不存在于非致病性的E.coli菌株和非LEE的病原體中。在本發(fā)明的一些實施方案中，這些多肽和編碼這些多肽或其部分的核酸分子可用作針對A/E病原性感染的有效疫苗、治療方法、診斷學或藥物篩選工具，或用作反應試劑。多肽和檢測化合物本發(fā)明所述的化合物包括但不限于，此述的多肽和核酸分子，例如SEQIDNO1-56、59-84，及其片段、類似物或變異體。本發(fā)明所述的化合物還包括orf11/grlA、nleA、nleB、nleB2、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG、nleH(nleH1和/或nleH2)基因或其同源物的產(chǎn)物。本發(fā)明所述的化合物還包括此述的多肽和核酸序列，例如，如編號Z0985(NleB2)、Z0986(NleC)、Z0990(NleD)、Z6020(NleF)、Z6024(NleA)、Z4328(NleB)、Z4329(NleE)、Z6025(NleG類似物)、Z6021(NleH1)、Z0989(NleH2)、Z2076、Z2149、Z2150、Z2151、Z2337、Z2338、Z2339、Z2560、Z2976或L0043(Orf11/GrlA)(登錄號AF071034)的所述的EHEC基因組序列(例如AE005174)及其片段、類似物和變異體。可通過例如在此述多肽的任意位置上，用其他保守的氨基酸殘基，即具有相似的物理、生物學或化學性質的殘基來替換，缺失或插入，并篩選例如對弱化毒力有用的化合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的所述化合物包括特異性結合本發(fā)明所述多肽，例如，SEQIDNO22-43、59或73-84的抗體。在本領域中，眾所周知可以在多肽的結構中進行某些修飾和改變而基本上不改變該多肽的生物學功能，從而得到生物學等同的多肽。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的多肽也可以擴展為生物學等同的多肽，或通過保守性氨基酸替換區(qū)別于本發(fā)明的所述多肽序列的部分序列，或通過不影響生物學功能，例如毒力的非保守性替換得以區(qū)別的“變異體”。正如本發(fā)明所使用的，術語“保守的氨基酸替換”是指在所述多肽的給定位置上一種氨基酸對另一種氨基酸的替換，其中可以在基本上不喪失相關功能的條件下進行所述替換。在進行這樣的變化時，可以在側鏈取代相對相似性，例如，其大小，電荷，疏水性，親水性等等的基礎上進行類似的氨基酸殘基替換，并且可通過常規(guī)的測定分析這些替換對其功能的作用。在此使用的術語“氨基酸”是指那些在天然發(fā)生的蛋白中發(fā)現(xiàn)的L-氨基酸，D-氨基酸以及被修飾的這些氨基酸。因此，本發(fā)明的氨基酸可包括，例如2-氨基脂肪酸；3-氨基脂肪酸；β-丙氨酸；β-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸；哌啶酸；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基異丁酸；3-氨基異丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；鎖鏈素；2，2’-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羥基賴氨酸；別-羥基賴氨酸；3-羥脯氨酸；4-羥脯氨酸；異鎖鏈素；別-異亮氨酸；N-甲基甘氨酸；肌氨酸；N-甲基異亮氨酸；6-N-甲基賴氨酸；N-甲基纈氨酸；戊氨酸；正亮氨酸和鳥氨酸。在一些實施方案中，當氨基酸殘基被替換成具有類似親水值(例如，在±2.0值的范圍內(nèi)，或±2.0，或±1.0，或±0.5)的其他氨基酸時，其中水療系數(shù)為約-1.6的氨基酸，例如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)的下列氨基酸被指定為氨基酸殘基(如美國專利第4,554,101號詳細公開的內(nèi)容，在此將其引入作為參考)，如Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；及Trp(-3.4)，可進行保守的氨基酸替換。在其他實施方案中，當氨基酸殘基被替換成具有類似水療系數(shù)(例如，在±2.0值的范圍內(nèi)，或±2.0，或±1.0，或±0.5)的其他氨基酸時，可進行保守的氨基酸替換。在這樣的實施方案中，在其疏水性和電荷特征的基礎上可對每一種氨基酸殘基指定水療系數(shù)，如下Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。在其他實施方案中，可使用公共可獲得的相似性矩陣(60，70，102，103，94，104，86)進行保守性氨基酸替換。PAM矩陣是基于來源于進化模型的計數(shù)，而Blosum矩陣采用的是來自比對之內(nèi)高度保守模塊的計數(shù)。在PAM或Blosum矩陣中大于零的類似分數(shù)可以用來制備保守性的氨基酸替換。在其他實施方案中，當用所述相同族中的其他氨基酸替換氨基酸，可進行保守性氨基酸替換，其中所述氨基酸被分成非極性，酸性，堿性和中性的族，如下非極性的Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met；酸性的Asp，Glu；堿性的Lys，Arg，His；中性的Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr。保守性的氨基酸改變包括用對應的D-氨基酸、用保守性的D-氨基酸、或用自然發(fā)生的、非遺傳編碼形式的氨基酸替換L-氨基酸，以及L-氨基酸的保守性替換。自然發(fā)生非遺傳編碼的氨基酸包括β-丙氨酸，3-氨基丙酸，2，3-二氨基丙酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，N-甲基甘氨酸(肌氨酸)，羥基脯氨酸，鳥氨酸，瓜氨酸，t-丁基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，N-甲基異亮氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，正亮氨酸，戊氨酸，2-萘基丙氨酸，吡啶基丙氨酸，3-苯并噻吩基丙氨酸，4-氯苯基丙氨酸，2-氟苯基丙氨酸，3-氟苯基丙氨酸，4-氟苯基丙氨酸，青霉胺，1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，β-2-噻吩基丙氨酸，甲硫氨酸亞砜，高精氨酸，N-乙酰賴氨酸，2-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2，4-二氨基丁酸，p-氨基苯丙氨酸，N-甲基纈氨酸，高半胱氨酸，高絲氨酸，磺基丙氨酸，ε-氨基己酸，δ-氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。在其他實施方案中，保守性氨基酸改變包括基于親水性或疏水性，大小或體積，或電荷的考慮的改變。主要根據(jù)所述氨基酸側鏈的性質，一般而言可將氨基酸分為疏水性的或親水性的?；跇藴驶腅isenberg等人的一致性疏水等級(71)，疏水性氨基酸表現(xiàn)出的疏水性大于零，而親水性氨基酸表現(xiàn)出的親水性小于零。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括Gly，Ala，Phe，Val，Leu，Ile，Pro，Met和Trp，而遺傳編碼的親水性氨基酸包括Thr，His，Glu，Gln，Asp，Arg，Ser和Lys。非遺傳編碼的疏水性氨基酸包括t-丁基丙氨酸，而非遺傳編碼的親水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。根據(jù)其側鏈的特征，可將疏水性或親水性氨基酸進一步分組。例如，芳香族氨基酸是具有側鏈的疏水性氨基酸，該側鏈含有至少一個芳環(huán)或雜芳環(huán)，其含有一種或多種諸如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等等的取代基，其中R是獨立的(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基，取代的(C1-C6)烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元雜芳基，取代的5-20元雜芳基，6-26元烷基雜芳基或取代的6-26元烷基雜芳基。遺傳編碼的芳香族氨基酸包括Phe，Tyr和Trp，而非遺傳編碼的芳香族氨基酸包括苯丙氨酸，2-萘基丙氨酸，β-2-噻吩基丙氨酸，1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。非極性氨基酸是在生理pH時側鏈沒有電荷的疏水性氨基酸，且在其所成的鍵中，兩個原子共用的電子對于每個原子的距離相同(即所述側鏈沒有極性)。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Gly，Leu，Val，Ile，Ala和Met，而非遺傳編碼的非極性氨基酸包括環(huán)己基丙氨酸。非極性氨基酸還可被進一步分成脂肪族氨基酸，其是含有脂肪族烴側鏈的疏水性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括Ala，Leu，Val和Ile，而非遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括正亮氨酸。極性氨基酸是在生理pH時側鏈沒有電荷的親水性氨基酸，但在其所成的鍵中，兩個原子共用的電子對離其中的一個原子更近。遺傳編碼的極性氨基酸包括Ser，Thr，Asn和Gln，而非遺傳編碼的極性氨基酸包括N-乙酰賴氨酸和甲硫氨酸亞砜。酸性氨基酸是側鏈pKa值低于7的親水性氨基酸。酸性氨基酸通常由于丟失一個氫離子在生理pH時具有負電荷的側鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Asp和Glu。堿性氨基酸是側鏈pKa值大于7的疏水性氨基酸。堿性氨基酸通常由于與水和氫離子相連在生理pH時具有正電荷的側鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括Arg，Lys和His，而非遺傳編碼的堿性氨基酸包括鳥氨酸，2，3-二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。本領域所屬技術人員應當理解，以上分類并不是絕對的，而且可以多種方式對氨基酸進行分類。此外，可基于公知的狀態(tài)和或特征性的化學、物理，或基于特異性分析的生物學性質，或與之前已鑒定氨基酸的比較來對氨基酸進行分類。氨基酸還可包括具有類似于氨基酸側鏈的雙官能部分。保守性改變還可包括通過例如氨基酸的官能側鏈反應，對非衍生殘基進行化學衍生部分的取代。因此，這些取代基可包括這樣的化合物，其游離的氨基被衍生成鹽酸胺，p-甲苯磺?；?，卞氧羰基，t-丁氧羰基，氯乙?；蚣柞；?。類似地，游離的羧基可被衍生形成鹽，甲基或乙基酯或其他類型的酯或肼，且側鏈可被衍生形成游離羥基的O-?；騉-烷基衍生物，或組氨酸咪唑氮的N-亞氨苯甲基組氨酸。多肽類似物還可包括被化學改變的，例如甲基化，通過諸如乙胺，乙醇胺或乙二胺的烷基胺對C-末端氨基酸的酰胺化，或對氨基酸側鏈的乙?；蚣谆?例如對賴氨酸ε氨基的乙酰化)的氨基酸。多肽類似物還可包括用取代的酰胺(例如，通式為-C(O)-NR的基團，其中R是(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烯基或取代的(C1-C6)炔基)對酰胺鍵進行替換或酰胺鍵的同電子排列體(例如，-CH2NH-，-CH2S，-CH2CH2-，-CH＝CH-(順式和反式)，-C(O)CH2-，-CH(OH)CH2-或-CH2SO-)。所述化合物可以是共價連接的，例如通過聚合或軛合形成共聚物或雜聚物。間隔物和連接物通常由小型的中性分子構成，例如可使用在生理條件下不帶電荷的氨基酸?？刹捎枚喾N方法完成連接。例如可在所述多肽末端加上半胱氨酸殘基，通過控制的氧化將若干多肽共價連接?；蛘?，可采用異雙官能團試劑，例如二硫化物/酰胺形成試劑或硫醚/酰胺形成試劑。所述化合物還可被連接于另一個化合物，該化合物具有例如，調(diào)節(jié)免疫原性反應的功能?？赏ㄟ^例如具有環(huán)部分對所述化合物進行限制?？赏ㄟ^標準化學方法，例如通過使用液相或固相合成方法自動合成多肽或多肽類似物。自動化多肽合成儀是可商業(yè)獲得的，其采用的是本領域公知的技術。還可以使用重組DNA技術，使用諸如在Sambrook等人(110)或Ausubel等人(111)的描述中的標準方法制備多肽和多肽類似物。一般而言，可根據(jù)本領域公知的方法，從天然產(chǎn)物或合成(半合成)提取物或化學文庫的大文庫中對候選化合物進行鑒定。在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領域所屬的技術人員應該理解，檢測提取物或檢測化合物的準確來源并不是本發(fā)明方法的關鍵問題。因此，采用本發(fā)明所述的示例性方法，可以篩選到任意數(shù)量的化學提取物或化合物。這些提取物或化合物的例子包括，但不限于，基于植物、真菌、原核生物或動物的提取物，發(fā)酵培養(yǎng)液和合成化合物，以及對業(yè)已存在化合物的修飾。還有多種方法可用來產(chǎn)生任意數(shù)量化合物，包括但不限于，基于多糖、脂、多肽和核酸的化合物的隨機性或指導性(例如半合成或全合成)合成。合成化合物文庫是可商業(yè)獲得的。另外，以細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫也可從多種來源獲得，包括Biotics(蘇塞克斯，英國)，Xenova(斯勞，英國)，HarborBranch海洋學研究所(Ft.Pierce，佛羅里達州，美國)和ParmaMar，馬薩諸塞州，美國。此外，如果需要的話，根據(jù)本領域公知的方法，例如，通過標準提取和分離方法，可生產(chǎn)例如A/E病原體多肽的天然和合成文庫。而且，如果需要的話，可使用標準的化學，物理或生物化學方法輕而易舉地對任何文庫或化合物進行修飾。當發(fā)現(xiàn)某種粗提取物能夠調(diào)控毒力時，有必要對所述陽性前導提取物進行分離，從而提取出導致所觀察效果的化合組分。因此，提取、分離和純化方法的目的在于在含有毒力調(diào)節(jié)性質的所述粗提取物范圍內(nèi)對其化學實體進行仔細地表征和鑒定。用于對混合物中化合物的活性進行測定的，與在此描述相同分析方法也可用來純化所述活性組分和測定其衍生物。對這些異源提取物進行分離和純化的方法是本領域所公知的。如果需要的話，可根據(jù)本領域公知的方法對表現(xiàn)出作為治療有效制劑的化合物進行化學修飾。隨后可采用針對A/E致病性感染的Citrobater或牛模型，或針對A/E致病性感染的任意其他動物模型對鑒定為具有治療性、預防性、診斷性或其他價值的化合物進行分析。疫苗“疫苗”是含有能夠引起所希望的免疫反應的物質的組合物。疫苗可以選擇、活化或擴展免疫系統(tǒng)的記憶性的B和T細胞，使其能夠例如，清除感染性制劑，例如A/E病原體或其成分。在一些實施方案中，疫苗包括適合的載體，例如佐劑，其是以非特異性方法作用來提高針對特異性抗原或一組抗原的免疫反應的制劑，能夠在需要產(chǎn)生預期免疫反應的任意給定的疫苗劑量中降低抗原的量或能夠降低劑量的頻率。所需要的免疫反應包括全部或部分的針對由A/E病原體引起的擴散(存在于已感染動物，例如哺乳動物的糞便)或集群(存在于已感染動物，例如哺乳動物的腸道)的防護。例如，當與非免疫動物相比較時，所希望的免疫反應可包括在免疫動物中10-100％間，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％針對由A/E病原體引起的擴散或集群的防護。如本發(fā)明所述的疫苗可包括此述的多肽和核酸分子，或其免疫原性片段，并可采用本領域公知或此述的任意給藥形式進行給藥。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述疫苗包括活的A/E病原體，滅活的A/E病原體，或其組分?；畹腁/E病原體，其可以口服疫苗的形式給藥，其可含有能夠影響所述A/E病原體毒力，但不因性免疫反應誘導的不可恢復的遺傳改變。活疫苗能夠在所接種的動物，例如哺乳動物中的腸中集群。在一些實施方案中，可將此述的多肽和核酸分子，或其免疫原性的片段或此述突變的細菌(例如，弱化的細菌)給藥家禽，例如，雞、鴨、火雞等等，從而在所述家禽中引起免疫反應，例如產(chǎn)生抗體。從這些家禽獲得的蛋或其制品，表現(xiàn)出了針對此述多肽和核酸分子或其免疫原性的片段產(chǎn)生免疫反應，可將其給藥于動物，例如，人、牛、山羊、綿羊等等從而在所述動物中引起針對此述多肽和核酸分子或其免疫原性片段的免疫反應。在家禽中產(chǎn)生抗體和給藥這些抗體的方法在Cook，申請日為1998年5月12日的美國專利第5,750,113號；Ivarie等人，申請日為2004年5月4日美國專利第6,730,822號和本文的參考文獻113-117中有詳細描述。可以通過本領域公知的技術，通過添加重組或純化的抗原，例如EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀氏毒素1或2、和/或緊密粘附素對本發(fā)明的疫苗進行進一步補充。例如，已有關于重組子制備和諸如EspA、Tir、EspB和緊密粘附素的EHECO157:H7蛋白的使用的報道(PCT申請公開WO97/40063；PCT申請公開WO99/24576；51)細胞培養(yǎng)可根據(jù)本領域公知的任意方法或此述的方法進行A/E病原體的培養(yǎng)。例如，可首先將行A/E病原體培養(yǎng)于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中約8-48小時，或約12-24小時，然后以約1∶5-1∶100，例如1∶67、或約1∶5-1∶25、或約1∶10，稀釋入M-9基本培養(yǎng)基中，其中添加了20-100mMNaHCO2或NaHCO3，或約30-50mM，或約44mMNaHCO2或NaHCO3；4-20mMMgSO4，或約5-10mM；或約0.8mM-8mMMgSO4，0.1-5％葡萄糖，或約0.2-1％，或約0.4％葡萄糖和0.05-0.5％酪蛋白氨基酸，或約0.07-0.2％，或約0.1％酪蛋白氨基酸。培養(yǎng)一般保持在約37℃，任意的2-10％CO2，或任意的約5％CO2，且生長至在600nm的光密度為0.7-0.8。采用任意適當?shù)姆椒?，例如微過濾或離心去除全部細胞，并使用透析，超濾等等方法將所述上清液濃縮，例如10-1000倍或更高，例如100。采用本領域公知的方法可容易地測定總蛋白?？墒褂迷诖怂龌虮绢I域公知的，包括野生型或突變A/E病原體的任意A/E病原體，例如EHEC的培養(yǎng)物，生產(chǎn)細胞培養(yǎng)上清液。一般而言，所述A/E病原體是在適于III性抗原分泌條件下，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)的(美國專利第6,136,554號和第6,165,743號)(51，74)。其他基因的分離和鑒定根據(jù)此述的核苷酸和氨基酸序列，例如，SEQIDNO1-56或59-84，可以使用標準方法對其他基因進行分離和鑒定。任意的A/E病原體都可作為這些基因的來源。在一些實施方案中，可使用此述的核酸序列來設計探針或引物，包括根據(jù)該序列的任意一條DNA鏈簡并的寡核苷酸探針或引物。然后可使用標準的擴增或雜交技術，使用所述探針或引物對基因組或cDNA文庫進行篩選獲得來自其他A/E病原體的基因。在一些實施方案中，可使用此述的氨基酸序列產(chǎn)生抗體或其他制劑，其可用于從與這些抗體結合的A/E病原體中篩選多肽。在一些實施方案中，可通過用抗原決定簇序列(例如，F(xiàn)LAG或2HA)標記本發(fā)明的(例如，那些與SEQIDNO22-43、59或73-84基本上相同的)多肽，并通過用含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的適當載體進行轉染，或通過內(nèi)源性細菌III型傳遞，將其導入宿主細胞，然后通過對所結合伴侶進行免疫沉淀和鑒定，對所述結合伴侶進行鑒定。可以用表達FLAG或2HA融合蛋白的菌株感染HeLa細胞，然后裂解，并用抗FLAG或抗2HA抗體進行免疫沉淀?？赏ㄟ^質譜對結合伴侶進行鑒定。如果不能產(chǎn)生足量的本發(fā)明所述多肽，這樣的方法就不能傳遞足量的標記蛋白從而鑒定其伴侶。作為互補方法的一部分，可將本發(fā)明的每種多肽克隆至融合于例如2HA、GFP和/或FLAG的哺乳動物轉染載體中。轉染之后，可將HeLa細胞裂解并將所述標記的多肽免疫沉淀。可通過SDSPAGE然后進行質譜對所述結合伴侶進行鑒定。在一些實施方案中，可對本發(fā)明的多肽進行標記，過量產(chǎn)生，并用于親和柱，從而鑒定和/或確認所鑒定的靶化合物。FLAG，HA和/或His標記的蛋白可被用于這些親和柱，從而從細胞提取物中提取宿主細胞因子，并可通過標準結合分析，飽和曲線和其它此述或本領域公知的方法對任意采樣進行確證。在一些實施方案中，可采用細菌雙雜交系統(tǒng)來研究蛋白-蛋白互作。可將此述的核酸序列或與其基本上相同的序列克隆至所述雙雜交系統(tǒng)的pBT餌質粒，并將商業(yè)可獲得的5×106獨立克隆的鼠脾文庫用作所述餌的靶文庫?？赏ㄟ^回收所述質粒進一步表征潛在的命中目標，并再次轉化以降低來自克隆餌變異體和文庫靶克隆的假陽性，所述克隆餌變異體和文庫靶克隆能激活獨立于所述克隆餌的報道基因。如本文所述，可采用此述的方法對可再生的命中目標進行深入研究。在一些實施方案中，將表達GrlA的A/E病原體菌株，例如，表達克隆的GrlA的EHECO157菌株用于A/EIII型分泌蛋白質組的蛋白組學分析，例如可使用對上清液的2D凝膠分析。此外，可將全部的A/E病原體(例如EHEC陣列)用來確定哪些基因是由GrlA調(diào)節(jié)的?？刹捎么耸龌虮绢I域公知的方法對毒力進行分析。一旦鑒定了編碼序列，就可以使用標準的克隆方法將其分離出來，并插入了任意適合的載體或復制子中，進行例如，多肽的生產(chǎn)。這樣的載體和復制子包括但不限于，噬菌體X(E.coli)、pBR322(E.coli)、pACYC177(E.coli)、pKT230(革蘭氏陰性菌)、pGV1106(革蘭氏陰性菌)、pLAFR1(革蘭氏陰性菌)、pME290(非E.coli革蘭氏陰性菌)、pHV14(E.coli和枯草芽孢桿菌)、pBD9(芽孢桿菌)、pIJ61(鏈霉菌)、pUC6(鏈霉菌)、Yip5(酵母)、YCp19(酵母)或牛乳頭瘤病毒(哺乳動物細胞)。一般地，可在用適當載體轉化或轉染的任意適合的宿主細胞中生產(chǎn)本發(fā)明的所述多肽(69)。轉化或轉染的方法以及表達載體的選擇都依賴于所選定的宿主系統(tǒng)?？刹捎枚喾N表達系統(tǒng)，所采用的精確的宿主細胞對本發(fā)明并不重要。例如，可在原核宿主(例如，E.coli)或真核宿主(例如，啤酒酵母，昆蟲細胞，例如，Sf21細胞，或哺乳動物細胞，例如，NIH3T3，HeLa或COS細胞)中生產(chǎn)本發(fā)明所述的多肽。這樣的細胞可來自多種途徑(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassus，美國)。適合多肽生產(chǎn)的細菌表達系統(tǒng)包括E.colipET表達系統(tǒng)(Novagen，Inc.，麥迪遜，維斯康星州)，以及pGEX表達系統(tǒng)(Pharmacia)。分析可采用此述或本領域公知的多種技術對包括多肽，核酸分子和小分子的候選化合物進行篩選和測定。能夠降低本發(fā)明所述任一多肽或核酸分子的表達水平的化合物可作為有效的、例如A/E致病性感染的治療劑。可以通過標準Northern雜交分析，使用基于本發(fā)明的任意適合的核酸片段作為雜交探針，測定基因表達進行篩選分析，其中將存在所述候選化合物時的基因表達水平與不存在所述候選化合物時的基因表達水平進行比較?？蛇x擇地，或另外地，可以使用例如免疫沉淀或Western雜交的方法在所述多肽表達或分泌的水平上測定候選化合物的效果。還可以進行如下的其他分析III型分泌的確認以及易位入宿主細胞為了測定哪一種候選化合物需要TTSS分泌，可將每一種基因或其部分融合于FLAG在其C末端，并從WT和TTSS突變體，例如，此述或本領域公知的WTEHEC和同源的escNIII型突變體收集上清液。其他測定分泌的方法包括測定在所述突變菌株上清液中分泌產(chǎn)物的損失，或對于所述蛋白所產(chǎn)生的抗體，以及對WT和III型上清液采用Western分析。為了確定沒有任何感興趣的蛋白是TTSS成分，需要對生長在III型誘導條件下的每種候選化合物上清液進行III型分泌的測定。LEETTSS分泌兩組蛋白集中于細菌細胞表面的易位子(EspA、B和D)，以及被直接易位入宿主細胞的效應物。可以對候選化合物進行檢測從而測定其是效應物或易位子。例如，在EHEC中FLAG標記的推測的效應物或其他A/E病原體可被用來感染培養(yǎng)的HeLa上皮細胞，或在用抗-FLAG抗體染色之后通過免疫熒光顯微鏡進行測定。這樣的可視效果通常都能證明細菌傳遞到了所述宿主細胞，并通常說明哪一個細胞器是所述效應物的靶位(例如，Tir到膜，NleA到高爾基體)。針對多種細胞分隔的抗體可被用來確認所述定位。為了與所述可視效果互補，可使用公知的分離方法(30)將感染的HeLa細胞分成細胞溶質，不可溶和膜組分，并使用抗-FLAG抗體進行Western分析從而測定所述效應物靶相于那種細胞組分。作為對照，可使用在TTSS缺陷性菌株中表達的具有標記的效應物感染細胞。如果靶向于所述膜組分，則可使用高鹽或堿性pH處理來測定是否其是完全的膜蛋白。如果所述候選化合物以低水平表達，那么通過免疫熒光測定易位是相當困難的，而對于腺苷酸環(huán)化酶可進行遺傳融合，該酶需要哺乳動物細胞質輔因子(鈣調(diào)蛋白)得以具有活性(87)。支架形成和攝取的效果假設肌動蛋白凝聚和基架形成是A/E病原體的主要標志，那么可以在例如培養(yǎng)的HeLa上皮細胞中針對蛋白凝聚和基架形成來篩選候選化合物。EPEC和EHEC侵入是另一種容易測定的細胞培養(yǎng)表現(xiàn)型，且可給出培養(yǎng)的上皮細胞的互作和改變宿主細胞骨架的指示(III型突變體不侵入，缺乏Tir和緊密粘附素的菌株也不侵入)?？梢允褂脩c大霉素保護分析，在wt和III型突變體A/E病原體之中，例如在HeLa細胞中的WT和TTSS突變體EHEC中，對各種候選化合物的侵入水平進行比較。此外，正如EPEC和EHEC在培養(yǎng)的巨噬細胞中通過以III型依賴性的方式抑制宿主PI-3激酶活性來抑制巨噬作用，可以測定所述候選化合物對所培養(yǎng)的巨噬細胞的吞噬作用的阻斷的能力(Celli，J.，M.Olivier和B.B.Finlay.2001通過對PI-3激酶依賴性途徑的抑制腸出血性大腸桿菌對抗吞噬作用的介導。EmboJ201245-58)。如果沒有任何一種候選化合物能夠抑制吞噬作用，則進行PI-3激酶抑制的后續(xù)分析。對極化上皮單層細胞的作用連接完整性在腹瀉中具有重要的作用。除了基架形成，A/E病原體還能引起其他對于極化上皮細胞的LEEIII型作用，包括微絨毛(微絨毛效應)的喪失和跨單層電阻、緊密連接尺寸的喪失。使用極化的人腸單層Caco-2細胞，可將高分辨率的掃描電子顯微鏡應用于感染了WTA/E病原體(例如，WTEHEC)，TTSS突變體A/E病原體，例如EHECescN，以及每種所述候選化合物?？衫脴藴始夹g對單層細胞進行多次感染、洗滌和處理用于SEM(66)，并在感染了極化的Caco-2細胞之后，篩查電阻的損失。對先天免疫和炎癥的影響在病原體中快速出現(xiàn)的主題是抑制先天免疫和炎癥反應的能力。已經(jīng)對諸如EHEC和EPEC的A/E病原體的這些影響進行了報道，且這些分析可被用來檢測在WT和TTSS突變體A/E病原體菌株中的候選化合物。例如，EHEC引起了對NF-κβ的抑制，導致了諸如HeLa細胞中的Il-8、Il-6和Il-1α幾種細胞因子的抑制(80)，該方法需要LEETTSS?？梢栽?，例如HeLa細胞感染之后，使用諸如RT-PCR(實時PCR)，也商業(yè)可獲得的ELISA分析的標準方法，對候選化合物對這些因子的抑制進行分析?；诙ㄎ恍畔⒌墓δ苄匝芯砍吮硇头治?，根據(jù)其對宿主細胞的定位也可對候選化合物進行分析。例如，如果某種候選化合物定位于高爾基體，則可對其進行分析從而測定是否其會影響高爾基體的功能，包括在表達所述候選化合物的酵母中進行生化研究測定糖基化和功能性高爾基體分析。如果所述候選化合物定位于線粒體，則可進行對調(diào)亡和其他線粒體功能的分析。如果所述候選化合物靶定于內(nèi)質網(wǎng)，則可設計蛋白合成和分泌的分析。如果發(fā)生了細胞核的靶向，則可實施轉錄研究。毒力的作用競爭性指數(shù)(CI)可用來廣泛地測定小型毒力因子的作用，以及是否兩種毒力因子歸屬于相同的毒力“途徑”(63)。簡言之，可將兩種具有不同抗生素抗性標記的菌株共感染動物，在適當?shù)姆跤龝r間之后，將所述細菌收獲并測定兩種菌株的比例。數(shù)值為1說明毒力相等。如果鑒定的化合物對毒力有影響，則可測定其與WT相比的CI。CI也可用來測定所述候選化合物歸屬與哪條毒力途徑。例如，除了將每一種毒力因子的突變體與WT進行比較，還可以通過對這兩種毒力因子的突變體進行比較測定CI。當對一種突變體以及雙突變體進行比較時，CI值為1說明他們歸屬于相同的一般性毒力途徑，而任意其他不是1的情況都說明它們處于不同的毒力“途徑”。顯微鏡研究可使用包括透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)的顯微鏡技術來對A/E病原體疾病進行表征，從而對來自REPEC感染兔子遠端回腸派伊爾(氏)淋巴集結中的淋巴濾泡(小結)進行測定，進而確認A/E損傷的形成(63)，使用共聚焦顯微技術來表明進入感染小鼠的鼠絨毛的傳遞和所述疾病過程的組織學分析。這些技術可用來在適當?shù)膭游锬Ｐ头治龊蜻x化合物，例如，用攜帶有所述候選序列上有突變的各種Citrobacter菌株感染的小鼠。對每一種候選化合物而言，都可在(或缺乏)該系統(tǒng)中，在所述疾病發(fā)展之后進行綜合研究。此外，還可以測定這些突變體在腸表面的集群水平?？梢栽趯δc組織進行收獲之后，用抗生素標記的菌株感染動物?？蓪⒔M織勻漿，并通過平板計數(shù)在選擇性平板上定量所述細菌。A/E病原體致病性感染，例如，Citrobacter感染的主要特征是廣泛性的炎癥?？梢赃M行共聚焦顯微分析來跟蹤在候選化合物中各種突變體的炎癥細胞事件。通過用抗體或凝集素對組織進行標記，然后采用共聚焦顯微技術，與父系菌株相比，可對由所述突變體導致的聚集于感染位點的炎癥細胞進行定義。對應于若干先天反應因子的抗體是可獲得的并用來對感染過程中的突變體表型進行分析，測定先天反應因子以及諸如巨噬細胞，中性粒細胞，iNOS產(chǎn)生細胞，樹突狀細胞等等的細胞。組織學研究可以對染色的組織進行組織學研究。例如，可對用REPEC和在候選化合物中有缺失的菌株感染的兔的蘇木精和曙紅染色的回腸切片進行研究，從而對炎癥和組織損傷進行比較，并對A/E病原體感染進行表征(58)。還可以用缺乏候選化合物的Citrobacter菌株在小鼠中進行類似的染色?？梢赃M一步定義與Citrobacter及其同源突變體相關炎癥的幾種其它組織學染色也是可獲得的，包括吉姆薩(Giemsa)和甲苯胺藍(ToluidineBlueO)(適用于普通形態(tài)學)，過碘酸-希夫氏染色反應(PeriodicAcid-Schiff)(對糖進行染色，允許對腸粘液層和杯狀細胞進行檢測)，革蘭氏染色，氯醋酸酯酶(炎癥細胞染色)和半胱天冬酶(caspase)分析(適用于調(diào)亡)。免疫組織化學允許旨在針對細菌和哺乳細胞抗原的抗體的應用。抗體使用標準技術制備方法(45)或本領域公知的方法，可將本發(fā)明的化合物用來制備針對本發(fā)明多肽的抗體。例如，可將本發(fā)明多肽的編碼序列純化至免疫兔子的必須程度。為了降低抗血清的低親和性或特異性的潛在問題，可對每種蛋白生成2或3種多肽構建體，并將每種構建體注射到至少2只兔子中。可通過一系列，優(yōu)選為包括至少三次加強注射的注射來產(chǎn)生抗血清?？刹捎酶ナ贤耆魟┻M行初次免疫，然后采用弗氏不完全佐劑進行后續(xù)免疫?？刹捎肳estern雜交和使用所述純化蛋白的免疫沉淀分析對抗體滴度進行監(jiān)測?？墒褂肅NBr-葡聚糖偶聯(lián)蛋白對免疫血清進行親和純化?？墒褂貌幌嚓P的蛋白板測定抗血清的特異性?？蛇x擇地，或除此之外，可以產(chǎn)生對應于本發(fā)明多肽相對唯一的免疫原性區(qū)域的多肽，并通過引入的C-末端賴氨酸與鑰孔戚血藍素(KLH)偶聯(lián)。對這些多肽中每一種的抗血清都可通過軛合于BSA的多肽進行親和純化，使用多肽軛合物在ELISA和Western雜交并通過Western雜交和免疫沉淀測定特異性。可選擇地，可根據(jù)標準雜交瘤方法制備與本發(fā)明任一多肽特異性結合的單克隆抗體(91，90，89，78)。一旦產(chǎn)生出來，可通過Western雜交或免疫沉淀對單克隆抗體的特異性識別進行測定?？烧J為那些與本發(fā)明所述多肽特異性結合的抗體是有用的；這樣的抗體可用作，例如，免疫分析。也可以使用上述的本發(fā)明所述多肽和噬菌體顯示文庫制備其他的單克隆抗體(112)。在一些實施方案中，可使用表現(xiàn)為具有免疫原性的多肽片段，制備抗體，該免疫原性是通過諸如具有較高頻率的帶電荷的殘基作為標準。例如，通過使用含有來自于一個種類的抗原結合區(qū)域和來自其他種類Fc部分的嵌合抗體，或通過使用來自適合類型雜交瘤制備的抗體，可對抗體進行定制來降低不利的宿主免疫反應。在一些實施方案中，可使用針對此述任一多肽的抗體來治療或預防由A/E病原體引起的感染。動物模型可在多種A/E病原體感染的動物模型中對化合物進行快速的篩選。Citrobacter鼠感染模型是天然發(fā)生的疾病模型，而成年牛EHEC擴散模型則是天然非疾病攜帶模型(牛并未生病，而EHEC也不是正常菌群的一部分)。對Citrobacter模型而言，可根據(jù)以上描述對小鼠中的毒力突變體進行篩選。可使用敲除(KO)/突變體小鼠來研究感染中候選序列的作用。已經(jīng)開發(fā)了幾種包括定義iNOS(20)、T和B細胞(106)、Tlr-4的功能并建立了一些列具有宿主易感性(54)以及Nck的KO小鼠品系。對于牛的模型，可在一歲內(nèi)的牛中篩選EHEC突變體(參見，例如，PCT申請國際公開第WO02/053181號)。簡言之，通過口-胃插管法，可將108CFU的突變體或WTO157傳遞入牛體內(nèi)。接種后14天，可通過選擇性涂板監(jiān)測糞便擴散，通過多重PCR，擴散水平，以及在EHEC集中的肛門區(qū)域的組織學和顯微鏡分析證明聚集情況(97)。其他的模型還有牛腸環(huán)模型，其中向腸環(huán)注射EHEC，并在各個時間進行組織學和顯微鏡學檢查，并通過涂布定量所吸附的細菌。可以按下方式制備RDEC-1感染的天然兔感染模型通過離心收集過夜細菌培養(yǎng)物，并重懸于1毫升磷酸緩沖鹽水中。將新西蘭白兔(重量為1.0-1.6kg)禁食過夜，然后使用口胃管將5毫升2.5％無菌的碳酸鈉和1毫升RDEC-1或候選序列突變菌株(2-5×1010)接種入胃中。在之后一天以相同劑量的細菌對每只兔子進行接種。每只兔子每天都稱重，通過直腸擦拭并從糞球中收集細菌的排泄物擴散。將直腸擦拭棉簽在含有萘啶酸的MacConkey平板的表面上旋轉半圈。從每只兔子收集5團糞便或相同數(shù)量的液體糞便，將其重懸于3毫升磷酸緩沖鹽水中，并將0.1毫升的每種糞便懸液涂布于含有萘啶酸的MacConkey平板上。將抗萘啶酸克隆的生長計分如下0，沒有生長；1，較大間隔的克隆；2，間隔較近的克隆；3，匯合生長的克隆。通過靜脈注射氯胺酮或過量給藥苯巴比妥鈉處死動物后立即將組織剪切下來。對在腸系統(tǒng)中細菌聚集數(shù)量的分析如下將腸部分(10厘米)，除了盲腸，在其近段和遠端雙重結扎，并在所述雙重結扎部分之間切斷，然后用10毫升并冷卻的磷酸緩沖鹽水進行沖洗。向來自所述盲腸的1克粘性成分中加入9毫升磷酸緩沖鹽水。將所得的磷酸緩沖鹽水懸液稀釋，并涂布于含有萘啶酸的MacConkey平板上。使用9mm直徑的木塞打孔器對組織樣本進行剪切，用磷酸緩沖鹽水洗滌三次，加入2毫升冰預冷的磷酸緩沖鹽水，用勻漿器勻漿，然后將系列稀釋的樣本涂布于MacConkey平板?？梢酝ㄟ^下式計算出每平方厘米上附著的細菌數(shù)CFU/cm2＝細菌數(shù)/平板×稀釋因子×2ml/-0.452。治療和診斷本發(fā)明所述的多肽和核酸分子可用作治療劑，例如，制備疫苗或治療組合物、或弱化毒力的A/E病原體構建體?？赏ㄟ^例如在基于本發(fā)明所述核酸序列的基礎上設計引物，和使用基于sacB序列的等位基因交換的在本文中所述的技術，構建這樣的A/E病原體構建體(29)。所述多肽和核酸分子可以單獨使用或相互或與其它適合的分子，例如EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀氏毒素1、志賀氏毒素2或緊密粘附素組合使用。在一些實施方案中，可將本發(fā)明所述的核酸分子用于反義技術中。參考于核酸在此使用的“反義”一詞，是指互補于核酸分子編碼鏈，例如，諸如nleA、nleB、nleC、nleD、nleE或nleF基因的基因，或互補于與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的任一序列基本上相同的核酸序列的核酸序列。在一些實施方案中，反義核酸分子是當與其互補基因都在細胞中表達時，能夠降低其互補基因編碼多肽水平的核酸分子。在一些實施方案中，與在僅表達所述基因而不是所述互補反義核酸分子的細胞中的多肽水平相比，所述多肽水平下降了至少10％-至少25％中的任一整數(shù)，或至少25％-至少50％中的任一整數(shù)，或至少50％-至少75％中的任一整數(shù)，或至少75％-至少100％中的任一整數(shù)。在一些實施方案中，可采用RNA干涉(RNAi)技術，一種轉錄后基因沉默類型的技術，對基因或編碼或非編碼感興趣區(qū)域的表達進行抑制或阻礙。RNAi可用來創(chuàng)建功能性的“敲除”，即，降低基因或編碼或非編碼感興趣區(qū)域的表達能夠被誘導的系統(tǒng)，從而得到所述編碼產(chǎn)物的總體水平的降低。因此，可對感興趣的核酸或其片段或變異體進行RNAi靶向操作，從而降低其編碼產(chǎn)物的表達水平和活性。這樣的系統(tǒng)可用來對所述產(chǎn)物進行功能性研究，并治療由A/E病原體引起的感染。RNAi在例如美國專利申請第20020173478號(Gewirtz；公開于2002年11月21號)和第20020132788號(Lewis等人；公開于2002年11月7號)中已被公開(79，67)。進行RNAi的試劑和試劑盒是可以從，例如，AmbionInc(奧斯定，德克薩斯州，美國)和NewEnglandBiolabInc.(貝弗利，馬薩諸塞州，美國)商業(yè)獲得的。在一些系統(tǒng)中，最初的RNAi試劑被認為是對應于靶核酸的dsRNA分子。隨后認為所述dsRNA分子可被切割成21-23核苷酸長度(19-21bp的雙鏈，每個具有2個核苷酸的3’突出端)的短的干涉RNA(siRNA)。影響這一最先剪切步驟的酶被稱為“剪切酶(Dicer)”，并被分為dsRNA特異性核酸酶中的III類RNA酶?？蛇x擇地，可通過直接導入細胞，或通過向所述細胞導入這樣的siRNA或類siRNA分子的適合前體(例如，載體，等等)使得RNAi產(chǎn)生作用。siRNA可隨后與其他細胞內(nèi)組分結合從而形成RNA-誘導的沉默復合體(RISC)。由此形成的所述RISC可隨后通過其siRNA組分和靶轉錄本之間同源程度的堿基配對互作靶定感興趣的轉錄本，導致從所述siRNA的3’末端對所述靶轉錄本進行約12個核苷酸的剪切。因此，所述靶mRNA被剪切，且其編碼的蛋白產(chǎn)物的水平也被降低?？赏ㄟ^向細胞中引入適合的體外合成的siRNA或類siRNA分子來使得RNAi起作用?？墒褂美缁瘜W合成的RNA來進行RNAi(64)，其中可采用公知的方法化學合成適當?shù)腞NA分子?；蛘?，可使用適當?shù)谋磉_載體在體外或體內(nèi)轉錄這些RNA?？墒褂美鏣7RNA聚合酶對有義和反義鏈(由同一載體或分開的載體上的序列編碼的)進行體外轉錄，其中所述載體可包括可操作的連接于T7啟動子的適當編碼序列。在所述實施方案中，體外轉錄的RNA可被體外處理(例如，使用E.coliIII型RNA酶)成適于進行RNAi的長度?？蓪⒂辛x和反義轉錄物合并形成導入感興趣的靶細胞的RNA雙鏈。也可以使用表達能被處理成類siRNA分子的小發(fā)夾RNA(shRNA)的其他載體。多種基于載體的方法是本領域公知的(65，93，95，98，99，105，109)。將這些載體通過體外或體內(nèi)(例如，基因治療)引入細胞的多種方法也是本領域公知的。因此，在某個實施方案中，包括與SEQIDNO22-43的任一序列基本上相同的氨基酸序列的表達，可通過向細胞中引入或在細胞中產(chǎn)生對應于編碼所述多肽或其片段，或對應于其同源核酸的siRNA或類siRNA分子得到抑制。在多個實施方案中，這樣的方法使得需要直接給藥，或使用上述的基于載體的方法將siRNA或類siRNA分子導入細胞。在一個實施方案中，所述siRNA或類siRNA分子的大小小于約30個核苷酸。在其他實施方案中，所述siRNA或類siRNA分子的大小約為21-23個核苷酸。在一個實施方案中，siRNA或類siRNA分子包括19-21bp的雙連部分，每條鏈還含有2個核苷酸的3’突出端。在實施方案中，所述siRNA或類siRNA分子基本上與編碼所述多肽或其片段或變異體(或變異的片段)的核酸相同。這樣的變異體能夠編碼具有由SEQIDNO22-43編碼的多肽活性的蛋白。在實施方案中，所述siRNA或類siRNA分子的有義鏈基本上與SEQIDNO1-21或其片段(RNA用U替換了DNA序列上的T)相同。在一些實施方案中，所產(chǎn)生的針對本發(fā)明所述多肽的抗體可用來治療由A/E病原體引起的感染。在一些實施方案中，本發(fā)明所述的多肽和核酸分子可用來測定樣本中A/E病原體的存在。所述核酸分子可用來設計例如，能夠與樣本中A/E病原體的DNA雜交，或可用來使用例如聚合酶鏈反應技術在樣本中對A/E病原體的DNA進行擴增的探針或引物。所述多肽可用來，例如，產(chǎn)生與由A/E病原體表達的多肽特異性結合的抗體。這樣的探針或引物或抗體可進行可檢測的標記?！翱蓹z測的標記”是指對分子，例如寡核苷酸探針或引物，基因或其片段，或cDNA分子的存在進行標記和鑒定的任意方法?？蓹z測的標記分子的方法在本領域內(nèi)是公知的，包括但不限于，放射性標記(例如，使用諸如32P或35S的同位素)和非放射性標記，例如酶標記(例如，使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)，化學發(fā)光標記，熒光標記(例如，使用熒光素)，生物發(fā)光標記，或對附著于所述探針的配體的抗體檢測。這一定義還包括可通過用間接方法標記的，例如，結合于第一部分(例如生物素)，其又結合于可進行觀察或分析的第二部分(例如熒光素標記的抗生蛋白鏈菌素)的可檢測的分子。標記還包括地高辛，熒光素酶和水母素。制藥和獸藥組合物，劑量和給藥所述化合物包括此述的多肽和核酸分子以及使用本發(fā)明方法鑒定的化合物。在存在脂質體、佐劑或任一藥物可接受載體，以適于對哺乳動物，例如人、牛、綿羊等等給藥的適當形式條件下，可單獨提供本發(fā)明所述的化合物或與其他化合物(例如，核酸分子、小分子、多肽、肽或肽類似物)組合提供。如果需要的話，可用基于本發(fā)明的化合物與多種傳統(tǒng)和現(xiàn)存的治療劑聯(lián)合治療A/E病原體感染。可使用常規(guī)的制藥方法提供適合的制劑或組合物從而對A/E病原體感染的患者給藥所述化合物?？梢圆捎萌我膺m合的、例如非腸道的、靜脈的、皮下的、肌肉的、顱內(nèi)的、眶內(nèi)的、眼的、心室內(nèi)的、囊內(nèi)的、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、氣霧劑或口服給藥方法。配方可以是液體溶液或懸液；片劑或膠囊；粉末，滴鼻劑或氣霧劑形式。制備所述制劑的方法是本領域公知的(57)。適于非腸道給藥的配方可含有，例如，賦型劑，滅菌水，或鹽水，諸如聚乙二醇的聚亞烷基二醇，植物來源的油，或氫化的萘。也可以采用生物匹配的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯聚合物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物來控制所述化合物的釋放。其他潛在的用于調(diào)節(jié)性化合物非腸道傳遞的系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的灌注系統(tǒng)以及脂質體。適于吸入的配方可包括賦型劑，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂酸酯、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或可以是以滴鼻劑形式給藥的油狀溶液或作為凝膠。對治療性或預防性組合物而言，可以足以中止或延緩A/E病原體感染的量對個體給藥所述化合物?；诒景l(fā)明化合物的“有效量”包括治療有效量或預防有效量?！爸委熡行Я俊笔侵冈趧┝可系挠行Я?，并且在必需的時間階段內(nèi)，達到所需要的治療結果，例如A/E病原體的聚集或擴散的降低。根據(jù)諸如患者疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重的因素以及所述化合物在患者體內(nèi)引起所需要反應的能力不同，所述化合物的治療有效量也會發(fā)生變化?？蓪┝糠桨高M行調(diào)節(jié)從而提供最適的治療反應。治療有效量也可以是所述治療有效效果超過了所述化合物的任意毒性或有害效果的量。“預防有效量”是指在劑量上的有效量，并且在必需的時間階段內(nèi)，達到所需要的預防結果，例如預防由A/E病原體引起的聚集。通常，可在患病之前或疾病的早期對患者使用預防劑量，所以預防有效量可能低于治療有效量?；衔锏膬?yōu)選治療或預防有效量范圍可以是從0.1nM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM中的任意整數(shù)。需要注意的是所述劑量可隨擬被緩解的病癥的嚴重程度不同而變化。對任意特異的患者而言，可根據(jù)個體的需要對特異性的劑量配置，和給藥或監(jiān)督所述組合物給藥的人的職業(yè)判斷進行調(diào)節(jié)。在此設定的劑量范圍僅僅是示例性的，而并沒有對通過醫(yī)療人員選定的劑量范圍進行限制。根據(jù)諸如所述個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和重量的因素，在所述組合物中的活性化合物的量可以改變?？蓪┝糠绞竭M行調(diào)節(jié)從而提供最適的治療效果。例如，可給藥單粒大丸藥，可隨時間給藥分開的若干劑量，或可根據(jù)所述治療情況的緊急事件對所述劑量進行成比例的降低或升高。以劑量單位形式配置非腸道組合物對方便給藥和均一劑型相當有益的。在疫苗制劑的情況下，可單獨或與其他化合物，以及與一種或多種誘導免疫反應的免疫佐劑來提供本發(fā)明的有效量化合物?；诒景l(fā)明的佐劑包括乳化劑、胞壁酰二肽、阿夫立定、諸如氫氧化鋁的水性佐劑、基于幾丁質的佐劑、皂角苷、油、Amphigen、LPS、細菌細胞壁提取物、細菌DNA、細菌復合物、合成的寡核苷酸及其組合(100)。所述佐劑可包括草分支桿菌(M.phlei)細胞壁提取物(MCWE)(美國專利第4,744,984號)，草分支桿菌DNA(M-DNA)，或分支桿菌細胞壁復合物(MCC)。乳化劑包括天然或合成的乳化劑。合成的乳化劑包括陰離子試劑(例如，月桂酸和油酸的鉀鹽、鈉鹽和銨鹽、脂肪酸的鈣鹽、鎂鹽和鋁鹽、即金屬皂、以及諸如硫酸月桂酸鈉的有機磺酸鹽)，陽離子試劑(例如，溴化十六烷基三甲銨)，和非離子試劑(例如，諸如單硬脂酸甘油酯的甘油酯，聚乙二醇酯和醚，以及諸如脫水山梨聚醇單棕櫚酸酯的脫水山梨醇脂肪酸酯，及其聚氧乙烯衍生物，例如聚氧乙烯脫水山梨聚醇單棕櫚酸酯)。天然乳化劑包括阿拉伯樹膠，明膠卵磷脂和膽固醇。其他適合的佐劑包括油，例如單種油或混合油，水包油乳劑(例如，EMULSIGENTM，EMULSIGENPLUSTM，或VSA3)，或非水包油乳劑(例如，油性乳劑，油包水乳劑或水包油包水乳劑)。所述油可以是礦物油，植物油或動物油。適合的動物油包括例如，魚肝油，大比目魚油，鯡油，orangeroughy魚油或鯊魚肝油，所有這些油都是可商業(yè)獲得的。適合的植物油包括但不限于，菜籽油，杏仁油，棉籽油，玉米油，橄欖油，花生油，紅花油，芝麻油或大豆油。可選擇地，多種脂肪族含氮堿可用作所述疫苗制劑的佐劑。例如，公知的免疫佐劑包括胺，季銨化合物，胍，芐脒和硫脲陽離子(75)。特異性地佐劑化合物包括溴化二甲基雙十八烷銨(DDA)(美國專利第5,951,988號)(88，59，85，68，84，82，83)和N，N-雙十八烷基-N，N-二(2-羥乙基)丙烷二胺(“阿夫立定”)(美國專利第4,310,550號，美國專利第5,151,267號)(62)。基于本發(fā)明的佐劑還可包括例如礦物油和溴化二甲基雙十八烷銨?？墒拱ǖ幌抻诨旌?、超聲波和微流化的標準方法來制備疫苗組合物。所述佐劑可包括疫苗的約10-50％(體積/體積)，或約20％-40％(體積/體積)或約20％-30％或35(體積/體積)，或這些范圍中的任意值。所述化合物還可連接于載體分子，例如牛血清白蛋白或鑰孔戚血藍素從而提高免疫原性。一般地，可在不引起基本毒性的條件下使用本發(fā)明的化合物?？墒褂脴藴史椒ǎ?，通過檢測細胞培養(yǎng)物或實驗動物并測定所述治療系數(shù)，即LD50(所述種群的50％致死劑量)和LD100(所述種群的100％致死劑量)之間的比例，測定本發(fā)明所述化合物的毒性。然而，在某些情況下，例如嚴重的疾病狀態(tài)下，有必要給藥基本過量的所述組合物。下述實施例僅對本發(fā)明的實施方案進行示例性說明，而不應該理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例1突變體的產(chǎn)生所使用的細菌菌株如下EHECO157:H7菌株86//24(32)，EHECEDL933(野生型E.coliO127:H7分離物；3)；EHECescN-(47)，野生型EPECE2348/69(野生型E.coliO127:H6分離物；50)，C.rodentiumDBS100(ATCC51459；53)，REPEC0103K-H285/150(52)，E.coliHB101。所使用的質粒如下對PCR或反向PCR而言，可使用校對閱讀的ELONGASE擴增系統(tǒng)(GIBCOBRL/LifeTechnologies)來常規(guī)地降低PCR錯誤率。使用來自Invitrogen的pCR2，1-TOPO或pCRII-TOPO的TOPOTA克隆試劑盒對PCR產(chǎn)物進行克隆。使用TaqDye-terminator方法和自動373ADNA測序儀(AppliedBiosystems)測定DNA序列。對常規(guī)克隆，轉化和感染而言，細菌都生長于37℃的Luria-Bertani(LB)瓊脂或添加了適當抗生素的培養(yǎng)基中?？梢韵铝袧舛仁褂枚喾N抗生素，氨芐青霉素100μg/ml，羧芐青霉素100μg/ml，卡那霉素50μg/ml，和氯霉素30μg/ml。在Dullbecco′smodifiedEagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中的培養(yǎng)物可用于誘導LEE基因表達和III型蛋白分泌。可采用基于sacB基因的等位基因交換(14)和λ紅色重組酶系統(tǒng)(17)，來產(chǎn)生突變體。一般而言，可將每個基因的75％或更多內(nèi)部成分缺失來確保所述基因功能的破壞。通過λ紅色重組酶方法可對ler基因進行突變，而通過基于sacB基因的等位基因交換對ler，orf11/grlA和cesT基因進行了突變?？墒褂没趕acB基因的等位基因交換產(chǎn)生了ler/orf11雙突變體。在其他地方也描述了tir和escD突變體的產(chǎn)生(20，56)。所述突變體是在閱讀框內(nèi)缺失的突變體，同時在所缺失的位點上引入了限制酶(NheI，BamHI或SalI)位點，如下可通過多重PCR反應對這些突變體進行確證。可通過對各個基因提供質粒對Δtir，Δler和Δorf11突變體進行互補測驗。所有這些突變體都可以互補，從卻確認了通過等位基因交換方法生成的突變并未影響到下游基因的功能，而且因此是無極性的。為了制備EHEC-pNleA-HA，使用校正閱讀的ELONGASE擴增系統(tǒng)(Invitreogen)和以下引物Z6024F5′AGATCTGAAGGAGATATTATGAACATTCAACCGACCATAC(SEQIDNO44)；Z6024R5′CTCGAGGACTCTTGTTTCTTCGATTATATCAAAG(SEQIDNO45)對nleA的編碼部分進行擴增。使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitreogen)對PCR產(chǎn)物進行克隆，并使用TaqDye-terminator方法和自動373ADNA測序儀(AppliedBiosystems)對DNA序列進行確認。然后將所述產(chǎn)物亞克隆入pCRespG-2HA/BglII，該質粒是工程化后用于驅動C.rodentiumEspG啟動子的蛋白表達，并向所述表達的蛋白的C-末端加上兩個流感血凝素(HA)的源自pACYC的質粒。然后通過電穿孔向野生型EHEC和EHECescN-中導入所述質粒構建體。通過基于sacB基因的等位基因交換(29)構建了在抗萘啶酸的EHEC菌株中nleA的缺失突變體。使用EHEC染色體DNA作為模板，對nleA側翼的兩個DNA片段進行了PCR擴增。使用引物NT105′CCGGTACCTCTAACCATTGACGCACTCG(SEQIDNO46)和引物NT115′AACCTGCAGAACTAGGTATCTCTAATGCC(SEQIDNO47)對片段A進行PCR擴增從而產(chǎn)生了1.3kb的產(chǎn)物。使用引物NT125′AACCTGCAGCTGACTATCCTCGTATATGG(SEQIDNO48)和引物NT135′CCGAGCTCAGGTAATGAGACTGTCAGC(SEQIDNO49)對片段B進行PCR擴增從而產(chǎn)生了1.3kb的產(chǎn)物。然后用PstI對片段A和B消化1小時，然后將所述酶在65℃加熱失活20分鐘。在室溫將約50ng的每種消化片段與T4DNA連接酶連接1小時。將所述連接反應物稀釋成1/10，并將1μl加入到使用引物NT10和NT13的PCR中。將所得的2.3kbPCR產(chǎn)物隨后用SacI和KpnI消化，連接于pRE112的對應位點(14)，并轉化入DH5αλpir從而生產(chǎn)pNT225。將pNT225轉化入作為與野生型EHEC軛合的供體菌株的軛合SM10λpir菌株。在LB瓊脂上，可對抗萘啶酸和氯霉素的接合后體(exoconjugation)。然后將所述接合后體涂布于含有5％(重量/體積)蔗糖而沒有NaCl的LB瓊脂上。將所得的克隆隨后進行氯霉素敏感性的篩選，然后通過PCR來鑒定所述分離物具有nleA缺失和質粒序列的缺失。然后分離到nleA缺失突變體，并將其用于后續(xù)工作。使用PCR構建的C.rodentiumnleA突變體可在pRE118(14)中構建含有nleA內(nèi)部缺失的自殺性載體。使用了以下引物del1F5′GGTACCACCACACAGAATAATC(SEQIDNO50)；del1R5′CGCTAGCCTATATACTGCTGTTGGTT(SEQIDNO51)；del2F5′GCTAGCTGACAGGCAACTCTTGGACTGG(SEQIDNO52)；del2R5′GAGCTCAACATAATTTGATGGATTATGAT(SEQIDNO53)。通過電穿孔將所得質粒導入C.rodentium從而構建了具有抗生素抗性的局部二倍體菌株。如上所述，可對通過第二次重組事件缺失的質粒序列進行篩選。可使用在所述缺失區(qū)域側翼的引物，通過PCR對抗生素敏感、抗蔗糖克隆的適當重組事件進行確證?？刹捎枚嗫寺】?NleA抗血清，通過Western雜交對全細胞裂解液中NleA的缺乏進行確證。對總蛋白/蛋白質組和分泌蛋白/蛋白質組的分析如前所述制備了分泌蛋白(51)。在37℃，在4mlLuriabroth(LB)的燒瓶中將C.rodentium菌株過夜生長。將所述培養(yǎng)物以1∶50接種到在組織培養(yǎng)箱中預孵育(5％CO2)過夜的4mlDulbecco′smodifiedEagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中，在相同的培養(yǎng)箱中靜置生長6小時從而誘導LEE基因表達。將所述培養(yǎng)物在13,000rpm，離心10分鐘，重復兩次，從而去除細菌，并用10％三氯乙酸(TCA)沉淀上清液，從而將分泌入所述培養(yǎng)基中的蛋白濃縮。用2XSDS-PAGE緩沖液溶解所述細菌沉淀，并將其指定為總細菌蛋白。還可將從所述上清液中沉淀出的分泌蛋白溶解于2XSDS-PAGE緩沖液，并且用1μl飽和的Tris中和殘留的TCA。將用來重懸所述細菌沉淀和分泌蛋白的緩沖液體積標準化至所述培養(yǎng)物的OD600，從而確保所述樣本的上樣是相等的。在12％或17％SDS-PAGE，和用0.1％考馬斯亮藍G250染色對所分泌的蛋白進行分析。對Western雜交分析而言，可使用10％SDS-PAGE對所述總蛋白或分泌蛋白進行分離，并轉移至硝酸纖維素膜上(Bio-Rad)。所使用的抗體是針對所述His標記的CitrobacterTir的大鼠多克隆抗體，以及針對EPECEspB的小鼠單克隆抗體。按標準的ECLWestern雜交實驗指南(AmershamLifeScience)進行實驗。在LB培養(yǎng)基中對野生型EHEC和EHECCVD451進行過夜培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)物以1∶100稀釋入添加了44mMNaHCO3、8mMMgSO4、0.4％葡萄糖和0.1％酪蛋白氨基酸的M-9基本培養(yǎng)基中，并在37℃在5％CO2中靜置生長至OD600為0.6-0.8。通過在8000g離心30分鐘收集分泌蛋白，由此從所述沉淀中分離出所述上清液。將上清液通過0.45μm的濾器進行過濾，并通過BCA分析測定蛋白濃度(Sigma)?？赏ㄟ^用1/9體積的100％冷的TCA在冰上沉淀45-120分鐘，然后在17600g離心30分鐘制備用于電泳的蛋白。將所述沉淀在冷的100％丙酮中潤洗，并溶解于1Xlaemmli緩沖液(針對1維SDS-PAGE凝膠)或針對2D凝膠的2D樣本緩沖液(8M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，20mMTris，0.002％溴酚蘭)。對2D凝膠而言，在上樣之前將DTT加至6mg/ml，將IPG緩沖液(pH3-10AmershamBiosciences)加至0.5％。將18cm的Immobiline干條(pH3-10Amersham)在樣本中在20℃過夜再水化。然后在15℃在65,000Vh對樣本進行聚集。聚集之后，將所述條在EB+10mg/mlDTT中平衡15分鐘，然后在EB+25mg/ml碘乙酰胺中平衡15分鐘(EB是50mMTris，6M尿素，30％甘油，2％SDS，pH8.8)。使用0.5％瓊脂糖，在SDS-PAGE電泳緩沖液+0.002％溴酚蘭中，將平衡的條封入大塊SDS-PAGE凝膠(12％或14％丙烯酰胺)的頂部，并將所述凝膠電泳至所述染料前端跑出所述凝膠。按照制造商的指導(BioRad)，用SyproRuby對凝膠染色，在UV看片燈上進行觀察，或通過MS/配備有Nanoflow液相層析系統(tǒng)(LCPacking-Dionex)的LCQDeca離子捕獲質譜(ThermoFinnigan)的MS進行觀察。對在UV看片燈上對凝膠進行觀察，可對感興趣的點進行手工剪切。根據(jù)說明書(23)，在InvestigatorProGestRobot(GenomicSolution，安阿伯，密歇根州)上進行蛋白的凝膠內(nèi)消化。用配備有FAMOS自動采樣器(LCPackings-Dionex，圣弗朗西斯科，加利福尼亞州)的Nanoflow液相層析系統(tǒng)，和LCQDeca離子捕獲質譜(ThermoFinnigan，圣何塞，加利福尼亞州)(24)組成的LC-MS系統(tǒng)對高蛋白豐度的樣本進行分析。使用反相PicoFrit柱PFC7515-PP18-5(NewObjective，Woburn，馬薩諸塞州，美國)進行多肽分離，并將所述柱流出物直接噴射到質譜儀中。使用200nL/分鐘的流速，每個樣本的總收集時間都為45分鐘。用APIQSTARPulsar混合MS/配有Nanospray離子源(Proxeon，Odense，丹麥)的MS質譜儀(AppliedBiosystems/MDSSCIEX，Concord，加拿大)(12)對低蛋白豐度的樣本進行分析。在分析之前，在ZipTips(Millipore，Billerica，馬薩諸塞州)上對樣本進行純化和濃縮。APIQSTARPulsar還可用于從頭開始的多肽測序。使用Mascot(Matrixscience)或Sonar(ProteometricsCanadaLtd)搜索引擎將所得譜在NCBI(Nethesda，馬里蘭州)數(shù)據(jù)庫中進行搜索。cat轉錄融合的構建和CAT分析將帶有所述啟動子和所有Citrobacterler(LEE1)和tir(LEE5)上游調(diào)控元件的PCR片段用BamHI和HindIII消化，并克隆至含有無啟動子cat基因的質粒pKK232-8。通過所述克隆片段跨越的位置如上所述。可根據(jù)以上描述對不同Citrobacter菌株中的這些融合蛋白指導的CAT活性進行測定(21，22)。如上所述，在不同時間點從生長于DMEM中的細菌培養(yǎng)物中收集樣本。序列分析和生物信息學工具通過BLASTN，TBLASTN和BLASTP進行的DNA和蛋白序列分析與同源性搜索是使用來自NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nih.org/)獲得的程序完成的。所使用的數(shù)據(jù)庫包括NCBI網(wǎng)站，桑格基因組中心(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes)和SwissPort(http://www.expasy.org/sprot/)?？赏ㄟ^IslandPath程序(http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandpath/)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)獲得LEEPAI的位置和EHEC基因組中原噬菌體的位置(13)。Southern雜交分析使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen)制備用于Southern雜交分析的基因組DNA樣本。通過用SalI和BglII酶消化得到500bp的片段，并使用BrightStarPsoralen-生物素非同位素標記試劑盒(Ambion)對其進行標記及制備了探針。用25單位BamHI，EcoRI和PstI對5微克每個基因組DNA樣本完全消化。用1％瓊脂糖凝膠將所述樣本分離，并通過被動地、輕微的堿性向下洗脫將其過夜轉移至BrightStar-Plus尼龍膜上(Ambion)。通過暴露于UV光2分鐘，然后在80℃烘烤30分鐘，對所述DNA交聯(lián)于所述膜。通過在10mlULTRAhyb超敏感雜交緩沖液中(Ambion)在42℃洗滌30分鐘對所述膜進行預雜交。然后向緩沖液中的預雜交膜中加入10微升制備好的探針，將所述探針與所述膜在42℃雜交過夜。將所述膜在室溫在低嚴謹洗滌緩沖液中(Ambion)洗滌2次，每次5分鐘，然后在高嚴謹洗滌緩沖液中(Ambion)洗滌2次，每次15分鐘。使用BrightStarBioDetect非同位素檢測試劑盒(Ambion)，然后曝光于Kodak膠片對雜交探針進行測定?？?NleA抗血清的產(chǎn)生使用以下引物5′TTCCATATGAACATTCAACCGACC(SEQIDNO54)和5′GGAATTCAATAATAGCTGCCATCC(SEQIDNO55)將nleA的編碼部分從EHEC基因組DNA中擴增出來，并克隆至his標記的表達載體(pET28a，Novagen)上。將該質粒導入BL21(λDE3)，生長至光密度(A600)為0.8，并用0.5mMIPTG在20℃誘導16小時。按照制造商的指導(Qiagen)，將His標記的蛋白在Ni-NTA柱子中進行純化。將含有NleA的組分合并，并加入凝血酶(500∶1)，將所述蛋白在20mMtrispH8.2和50mMNaCl中透析過夜。次日，將所述蛋白上樣于monoQFPLC柱，并使用50-500mM線性梯度的NaCl對其進行發(fā)展。將含有NleA的組分合并。這一步驟完成之后所述蛋白的純度＞90％。使用氟氏完全佐劑(Sigma)，將純化的蛋白用來免疫兩只雄性SpragueDawley大鼠，300μg蛋白/只，按照制造商指南(BioRad)使用活化的免疫親和支持Affi-Gel15對所產(chǎn)生的抗血清進行親和純化。對免疫熒光試驗而言，可通過用由HeLa細胞和由EHEC.NleA制備的丙酮粉末進行吸收進一步純化所述抗血清，如參考文獻45所示。可通過對來自野生型EHEC和EHEC.NleA的細胞提取物進行Western雜交確定抗血清的特異性。免疫雜交分析將用于Western雜交分析的樣本通過SDS-PAGE(9％-12％丙烯酰胺)進行分離。將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，并用含5％無脂奶粉(NFDM)的pH7.2、含有0.1％Tween20的TBS(TBST)，在4℃對免疫雜交封閉過夜，然后用溶于1％NFDMTBST的第一抗體在室溫(RT)孵育1小時。將所述膜在TBST中洗滌6次，然后與1∶5000稀釋的辣根過氧化酶軛合的山羊抗小鼠(H+L)抗體(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.)在RT孵育1小時。使用化學發(fā)光檢測試劑盒(Amersham)，然后通過曝光于Kodak膠片(PerkinElmer)可看到抗原-抗體復合物。使用了以下的第一抗體抗-HA.11(Covance)，抗-DnaK(Stressgen)，抗-EHECTir，抗-NleA(本研究)，抗-鈣聯(lián)接蛋白(Stressgen)，抗-鈣網(wǎng)織蛋白(AffinityBioregeants)，抗-微管蛋白(Sigma)。免疫熒光將HeLa細胞生長于24孔組織培養(yǎng)版中的玻璃蓋玻片上，并用1μl(EHEC)OD約為0.4的靜置過夜培養(yǎng)物感染6小時。在感染后6小時，用含有Ca2+和Mg2+的PBS洗滌3次細胞，并在室溫用含有2.5％多聚甲醛的PBS固定15分鐘。用含有0.1％皂角苷的PBS對細胞進行通透處理，用含有5％山羊血清或5％BSA的PBS+0.1％皂角苷進行封閉，并在室溫與以下稀釋于封閉液中的第一抗體孵育1小時抗-EHECTir，1∶1000；抗-E.coliO157(Difco)，1∶200；親和純化的大鼠多克隆抗-NleA(本研究)，1∶100；抗-甘露糖苷酶II(由MarilynFarquhar博士惠贈，UCSD)，1∶1000。在PBS/皂角苷中洗滌3次之后，將細胞與第二抗體(Alexa-488或-568-軛合的抗小鼠、兔子、大鼠(MolecularProbes)1∶400)在室溫孵育30分鐘，用PBS/皂角苷中洗滌3次，用PBS洗1次，使用mowiol+DABCO將其加載在玻璃載玻片上。為了能夠看到聚合的肌動蛋白，Alexa-488軛合的鬼筆環(huán)肽(MolecularProbes)中包括了以1∶100稀釋的第二抗體。當需要時，將細胞與5μg/ml布雷菲德菌素A(BorhringerMannheim)在固定前孵育30分鐘。使用ZeissAxioskop顯微鏡對圖像進行檢測，使用EmpixDVC1300數(shù)碼相機進行拍攝，使用NorthernEclipase圖像軟件進行分析，或在BioRadRadiancePlus共聚焦顯微鏡上用Lasersharp軟件進行檢測。感染宿主細胞的組分分離對每個樣本而言，使用1∶10的初始MOI，用野生型EHEC-pNleA-HA或EHECescN-pNleA-HA感染兩個匯合的100mm培養(yǎng)皿HeLa細胞。在感染后6小時，用冰預冷的PBS將所述細胞洗滌三次，并使用之前所述的方法進行生物化學組分分離(30，49)。簡言之，用300μL添加了COPLETE蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的勻漿緩沖液(3mM咪唑，250mM蔗糖，0.5mMEDTA，pH7.4)重懸所述細胞，并機械性地通過22-G針頭進行破壞。在4℃以低速(3000g)對所述勻漿離心15分鐘沉淀未破損的細胞、細菌、細胞核和細胞骨架成分(低速沉淀)。將上清液在4℃在TLS55轉頭在TL100離心機(Beckman)中高速超速離心(41,000g)20分鐘，從而將宿主細胞膜(沉淀)和胞質(上清液)分離。將所述沉淀重懸于300μL1Xlaemmli緩沖液，使用5X儲存液將所述上清制備成1Xlaemmli緩沖液。將等體積的所有組分通過SDS-PAGE(9％丙烯酰胺)分離，并轉移至硝酸纖維素膜進行Western雜交。對與NleA結合的膜的提取研究而言，使用上述的分離條件將兩個100mm培養(yǎng)皿的感染的HeLa細胞進行各個提取條件的組分分離。將高速沉淀(宿主膜組分)重懸于300μL以下提取緩沖液中(i)10mMTris，5mMMgCl2，pH7.4；(ii)10mMTris，5mMMgCl2，1MNaCl，pH7.4；(iii)0.2MNaHCO3，5mMMgCl2，pH11.4；(iv)10mMTris，5mMMgCl2，1％TritonX-100pH7.4。在冰上，通過將所述樣本每5分鐘吸上落下一次進行30分鐘，并將所述樣本在100,000g重新離心30分鐘。將所述沉淀(不溶性組成)重懸于300μLlaemmli緩沖液，將上清液(可溶性組分)在冰上用10％三氯乙酸沉淀30分鐘，用100％丙酮洗滌，并重懸于300μLlaemmli緩沖液。將等體積的樣本通過SDS-PAGE(9％丙烯酰胺)分離，并轉移至硝酸纖維素膜進行Western雜交。小鼠中C.rodentium的感染分析按照由英屬哥倫比亞大學動物福利委員會和加拿大實驗動物使用委員會提出的指導準則，將5周齡的C3H/HeJ小鼠(JacksonLaboratory)和遠交的NIHSwiss小鼠(HarlanSprague-Dawley)飼養(yǎng)于英屬哥倫比亞大學的動物房內(nèi)。將過夜生長于200rpm搖床上的100μL的LB培養(yǎng)基中的野生型C.rodentium和nleA缺失突變體通過口胃管感染小鼠。通過連續(xù)稀釋和涂布滴定接種量，對每一組的計算量為4×108cfu/小鼠。對用C.rodentium感染的高易感性C3H/HeJ小鼠而言，在感染后的每天都要測定所述感染小鼠的存活情況。一旦任一小鼠表現(xiàn)出瀕死狀況，就將其立刻處死。使用NIHSwiss小鼠進行細菌毒力分析，將動物在感染后10天處死。為了對結腸增生進行評價，收集起始自肛外緣的頭4cm的遠端結腸，并在去除了所有糞便之后進行稱重。為了對細菌集群進行分析，使用Polytron組織勻漿器在PBS中將結腸組織和糞便進行勻漿，并在涂布于MacConkey瓊脂(DifcoLaboratories)之間進行連續(xù)稀釋。將結腸組織和糞便合并來確定在處死時所述小鼠結腸中的總細菌負載。MacConkey瓊脂對革蘭氏陰性細菌是具有選擇性的，在其上，C.rodentium形成了具有區(qū)別性的且與典型E.coli不同的可鑒定形態(tài)學的菌落(26)。為了進行組織學分析，將所感染小鼠的最后0.5cm結腸固定于10％的中性緩沖的福爾馬林中，進行處理，切成3μm切片，并用蘇木精和曙紅染色。組織學分析是在英屬哥倫比亞大學的病理學與實驗醫(yī)學系的形態(tài)學服務實驗室中完成的。實施例2對LEE基因表達調(diào)控的分析為了研究是LEE中的哪個基因對C.rodentium中的LEE表達進行調(diào)控，我們對表達EspB和Tir的LEE突變體進行了分析，所述突變體是分別由LEE4和LEE5(Tir)操縱子編碼的。使用抗-Tir和抗-EspB血清，對生長于DMEM中的細菌的總細胞裂解物進行了Western雜交分析。我們的結果證實了Ler在LEE表達中的關鍵作用，因為在Δler中不產(chǎn)生Tir和EspB。正如所期望的那樣，Δtir和ΔespB也并不產(chǎn)生Tir和EspB。在ΔcesT中未觀察到Tir，這與CesT作為Tir穩(wěn)定性和分泌的分子伴侶的作用一致(18，19)。令人驚奇的是，其他LEE編碼的蛋白，Orf11，也是Tir和EspB表達所必需的。Tir和EspB在Δorf11中的表達通過僅帶有Citrobacterorf11的質粒互補(圖8)。orf11基因在A/E病原體中是高度保守的，且EHEC和EPCEorf11都與CitrobacterΔorf11互補(圖8)，說明Orf11與A/E病原體中LEE基因表達的正調(diào)控是功能相當?shù)?。序列分析說明Orf11/GrlA與CaiF具有23％一致性，CaiF是腸桿菌科的cai和fix操縱子的轉錄激活子，并與由位于std傘毛操縱子下游的基因編碼的未表征沙門氏菌產(chǎn)物的推測的氨基酸序列具有37％一致性(16)(圖7)。這一沙門氏菌同源物在圖中用SGH(SalmonellaGrlAHomologue)表示。所有這三種蛋白都含有DNA結合蛋白的特征性的預測的螺旋-轉角-螺旋基序。為了研究Orf11和Ler在調(diào)節(jié)LEE基因表達中的層次，我們構建了C.rodentium的ler和orf11雙突變體。盡管可通過反式表達Ler部分的恢復ΔlerΔorf11中Tir和EspB的表達，而類似地表達Orf11則沒有這樣的效果(圖8)，說明Orf11在調(diào)控級聯(lián)中在Ler上游起作用。通過說明Citrobacterler啟動子類似于EPECler，且其表達在Δorf11中有所降低，引物擴增分析確證了這樣的調(diào)控層次。在生長于DMEM培養(yǎng)基中6小時的CitrobacterWT，Δler和Δorf11菌株中，通過監(jiān)測在LEE1(Ler)(pLEE1-CAT)或LEE5(Tir)(pLEE5-CAT)操縱子以及cat報告基因之間調(diào)控區(qū)域的轉錄融合的活性對Orf11在ler表達中的調(diào)控作用進行了進一步的證明。在Δorf11中LEE1-cat融合的活性有所降低，而在Δler和Δorf11中，LEE5-cat融合的活性則急劇降低。這些結果說明Orf11是Ler表達的新的陽性調(diào)節(jié)基因，其隨后協(xié)助了其他LEE操縱子的表達。因為Orf11在所述調(diào)控級聯(lián)中在Ler的上游發(fā)揮作用，所以將其命名為GrlA(對LEE-激活子的全部調(diào)節(jié)劑而言)。實施例3LEE編碼的TTSS分泌的效應物的鑒定A/E病原體向組織培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基中分泌了若干種蛋白，但所分泌的蛋白主要是易位子EspA、EspB和EspD。通過TCA對生長于DMEM中的細菌上清液進行沉淀，對分泌的蛋白進行了濃縮，并采用12％SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍染色進行分析。與WT菌株相比，含有orf11.grlA質粒的C.rodentium分泌了至少300％的EspA、EspB和EspD。為了對由CitrobacterLEE編碼的效應物進行定義，我們用雙血凝素(2HA)抗原決定簇在羧基末端對不涉及TTS和宿主細胞附著的多種LEE-編碼的蛋白進行了標記，并分析了其在WT和C.rodentium中的分泌情況。在C.rodentium中，只有Tir、EspG、EspF、EspH和Map是LEE-編碼的TTSS分泌的，說明LEE僅編碼5種效應物?？赏ㄟ^考馬斯染色在具有Tir分泌大幅提高的突變體中方便地測定出之前未識別的54kDa蛋白(p54)，說明其代表了在LEE之外編碼的的新的推測的效應物。為了鑒定p54和測定是否在C.rodentium的LEE之外還有其他編碼的效應物，我們利用GrlA能提高LEE基因表達和/或III型分泌的能力，將grlA質粒引入分泌效應物而不是易位子的突變體中。GrlA的過量表達極大地增強(超過400％)了Tir在這些突變體中的分泌，同時未分泌出易位子。觀察到了至少6種其他的分泌蛋白，說明LEE-編碼的TTSS可分泌若干其他非LEE-編碼的蛋白。為了鑒定這些蛋白，通過2-D凝膠對所述分泌蛋白進行分析。因為一些LEE-編碼的效應物(EspF，EspH和Map)具有預測的堿性pI值，且EspF具有11.00的極高pI值，所以這些分泌蛋白被首先聚集于具有酸性(pH3-10)和堿性(pH6-11)梯度的Immobiline干條上，然后分別用12％和14％的SDS-PAGE解析。用SyproRuby對凝膠進行染色，將所選定的蛋白點手工剪切，并通過質譜和從頭多肽測序進行分析。這樣的分析確證了LEE-編碼的Tir、EspF、EspG、EspH和Map都是III型分泌的(表2)。表2在C.rodentium中由LEE-編碼的TTSS分泌的效應物和推測的效應物除了所述五種LEE-編碼的效應物，我們還鑒定了7種非LEE-編碼的類似效應物的分泌蛋白。這些由LEE以外編碼的分析蛋白因此被指定為NleA(p54)、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF和NleG(QQENAPSS(I/L)QTR；SEQIDNO59)(對非LEE編碼的效應物而言)，從而將其與LEE編碼的分泌蛋白/效應物(Esp)區(qū)別開來(表2)。在這7種鑒定的蛋白中，只有NleG是C.rodentium唯一的，其他6種蛋白在EHECO157中都具有高度的保守同源物(表2)。所述EHEC的同源物是由基因組中集簇在3個不同區(qū)域的基因編碼的，每個區(qū)域編碼至少與C.rodentium分泌蛋白同源的兩種蛋白(表2)。編碼NleA和NleF同源物的基因Z6024和Z6020位于與原噬菌體CP-933P相連的EHEC的O-島71。類似地，編碼NleB和NleE同源物的基因Z4328和Z4329位于O-島122，而編碼NleC和NleD同源物(Z0986和Z0990)的基因則位于O-島36(表2，圖9)。此外，Z4328(O-島122)與Z0985具有極高的同源性，Z0985是O-島36中與Z0986相鄰的基因。所有6種新EHEC效應物基因的同源物在EPEC中都有出現(xiàn)并具有類似的組織方式，EPEC的基因組已被測序(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)。除了Z6024，其表現(xiàn)出與EPEC基因的89％核苷酸一致性，其他5種EHEC基因都表現(xiàn)出與其在EPEC中同源物至少95％的一致性。而且，這些效應物中的一些在其他致病性細菌中也是高度保守的。NleD/Z0990具有與P.syringaepv.番茄的III型效應物HopPtoH具有相似性(41，42)。NleE/Z4329與兔子EPEC(REPEC)的RorfD和S.flexneri的Orf212具有顯著的同源性(8，33)，而NleB/Z4328則與REPEC的RorfE和兩種推測的S.typhimurium蛋白具有顯著的同源性。Z4328和Z4329基因在EHEC中位置相連，類似于REPEC中rorfD和rorfE的基因排列(8)。然而，在REPEC中rorfD和rorfE緊鄰于LEE，而其在EHEC中的對應物則存在于遠離LEE的區(qū)域(O-島122)。攜帶有Z4328和Z4329的EHECO-島122還包含編碼兩種細胞毒素和PagC同源物的基因，一種S.enterica中重要的PhoP/PhoQ調(diào)控的毒力因子(3，43)。編碼這些新效應物的EHEC中的3個O-島具有二核苷酸傾向和較低的GC％含量，即PAI的標志(9)。此外，它們或者與原噬菌體相連，或者通過移動插入序列側翼于原噬菌體，且并不出現(xiàn)與非致病性E.coli的基因組中(3)，說明了這些基因的水平轉移。綜上，這說明了這些島和新鑒定的Citrobacter以及EHEC效應物在毒力中的重要性。還說明由于它們之間各有差異，相關的病原體保持了驚人的保守性PAI組合，盡管PAI的位置在細菌染色體中是變化的。實施例4NleA的鑒定盡管III型分泌一般認為是接觸依賴性的(46)，但確定的體外培養(yǎng)條件也可在液體培養(yǎng)生長的過程中誘導EHEC將III型效應物分泌至細胞外培養(yǎng)基中(28，51)。從野生型EHEC(wt)中制備了培養(yǎng)物上清液，并在III型分泌誘導條件下產(chǎn)生了III型分泌突變體(escN-)。通過SDS-PAGE對所述分泌蛋白的分析得到了與來自野生型和escN-樣本的分泌蛋白類似的一種豐富的高分子量蛋白，而只有野生型樣本存在的其它幾種豐富的蛋白(圖10A)。將所分泌的蛋白通過2維凝膠電泳分離，將足量的分離蛋白點從所述凝膠上剪切下來并通過質譜進行分析(圖10B，表I)。表I在野生型和escN-培養(yǎng)物上清液中出現(xiàn)的#1號點被鑒定為EspP，其是由不依賴于III型分泌的自動運輸機制分泌出的EHEC的質粒編碼蛋白(25)。四種主要的點(#2，3，4，5)是野生型上清液唯一存在的。其中的三個點被鑒定為公知的LEE中編碼的III型分泌蛋白Tir(#2號點)、EspB(#4號點)和EspA(#5號點)(圖10B，表I)。經(jīng)過鑒定，#3號點是由EHEC基因組內(nèi)LEE之外的開放閱讀框編碼的預測分子量為48kDa的蛋白(圖10C)。我們將該蛋白稱為NleA，即非LEE編碼的效應物A。實施例5含有nleA座位的表征nleA基因是在O-島內(nèi)編碼的，O-島是非致病性E.coli菌株K-12基因組中不存在的EHEC基因組部分(3)。在E.coliK-12骨架中保守的最后一個基因(YciE)和編碼噬菌體結構蛋白的基因之間的區(qū)域中包含有幾個推測性的轉座酶片段和一個推測性的位點特異性重組酶片段(圖11A)。使用Ispandpath，其為鑒定PAI而設計的程序對該區(qū)域進行分析(13)，說明在該區(qū)域內(nèi)的所有ORF都具有二核苷酸傾向和與EHEC基因組平均值不同的GC含量。該區(qū)域內(nèi)有10個ORF的GC含量比所述EHEC基因組的平均值低至少一個標準差，而6個ORF中的2個則具有比所述EHEC基因組的平均值高至少一個標準差的GC含量。綜上，這些結果說明nleA基因歸屬于含有PAI的水平轉移基因。該區(qū)域內(nèi)的幾個其他ORF都具有說明其在發(fā)揮毒力作用中的特征，包括推測性的分子伴侶(Z2565)和兩種與其他病原體的III型分泌蛋白類似的蛋白(Z6021，Z6020)。為了對nleA基因的本質和分布進行深入研究，制備了nleA探針并對來自其他A/E病原體和非致病性E.coli菌株的基因組DNA板進行了Southern雜交。如圖11B所示，nleA基因存在于所有檢測的A/E病原體中，但不存在于非致病性E.coli中。對進程中的EPEC基因組序列的分析表明，nleA存在于所述EPEC基因組中噬菌體插入位點的近端。nleA還存在于緊密粘附素陽性原噬菌體、非O157EHEC菌株、O84H4內(nèi)，而不存在于非致病性的E.coli菌株和不含有LEE的尿道致病E.coli中。nleA也不存在于其他含有TTSS的病原體中，例如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬中。因此，nleA是A/E病原體特異性獲得的或保留的。對來自C.rodentium，EPEC，EHEC和O84H4的nleA基因序列的多重序列比對說明了在這四種A/E病原體中較高程度的序列保守性(圖11C)。實施例6NleA是通過LEE編碼的III型分泌系統(tǒng)分泌的迄今為止描述的LEE編碼的TTSS的EHEC和EPEC效應物都是在靠近編碼分泌元件本身的基因近端、在LEE之內(nèi)編碼的。為了測定NleA的分泌是否依賴于LEE編碼的TTSS的，在野生型EHEC和缺乏III型分泌的escN-菌株的質粒中表達了抗原決定簇標記的NleA(47)。如圖12A所示，盡管在野生型和escN-EHEC中HA-標記的NleA的表達水平類似，但只有NleA-HA-轉化的野生型細菌的蛋白分泌到了細胞外培養(yǎng)基中?？墒褂梅欠置诘募毦鞍?，DnaK，作為在分泌蛋白樣本中缺乏非分泌蛋白的對照(圖12B)。未轉化的和NleA-HA-轉化的野生型菌株中分泌Tir，但escN-菌株不分泌(圖12C)，證實了所期望的TTSS表型。在野生型EHEC和幾種EPEC的III型分泌突變體中也觀察到了抗原決定簇標記的NleA表達的類似結果，說明NleA也可通過EPECTTSS分泌。實施例7NleA被易位入宿主細胞中當EHEC生長于III型分泌誘導條件下時，有兩種蛋白分泌到了細胞外培養(yǎng)基中。為了測定NleA是否是易位體或易位效應物，我們通過產(chǎn)生缺失突變菌株研究了在缺乏NleA條件下的III型分泌和易位。分析了來自野生型和ΔnleA突變體EHEC菌株的分泌蛋白譜。野生型樣本中含有ΔnleA分泌蛋白中沒有的約50kDa的豐富的蛋白(圖13A)。用針對NleA的抗血清進行Western雜交證明了野生型分泌蛋白樣本中存在有50kDa的NleA，而不存在于ΔnleA樣本(圖13B)。然而，無論存在或不存在NleA，野生型和ΔnleA菌株的分泌蛋白譜都是一致的(圖13A)。因此，并不需要NleA來分析其他III型分泌效應物。為了測定是否需要NleA來完成其他III型效應物進入宿主細胞的易位，使用野生型EHEC和EHECΔnleA感染了HeLa細胞，并通過對感染細胞進行免疫熒光染色監(jiān)測Tir的易位和功能。通過將感染的細胞進行抗-EHEC和抗-Tir抗體的免疫熒光，并用毒傘素使纖維狀肌動蛋白成為可見，對野生型EHEC和ΔnleA突變體的基架形成進行了測定。所述結果說明EHECΔnleA附著于HeLa細胞的水平與野生型EHEC相當。免疫熒光染色說明Tir易位進入了宿主細胞，并集中在感染的野生型和ΔnleAEHEC菌株的細菌下。為了確證功能性的Tir易位，用熒光毒傘素對感染的細胞進行染色，從而使得在附著細菌之下涉及基架形成中的聚合的肌動蛋白成為可見。在感染了野生型或ΔnleAEHEC的細胞中出現(xiàn)的肌動蛋白基架，說明了可在缺乏NleA的情況下實施其他III型效應物的易位和功能。這些結果也說明不需要NleA來完成基架形成。由于NleA并未表現(xiàn)出在其他效應物的分泌和易位中具有作用，我們需要研究是否NleA會自我易位。用野生型EHEC或表達HA-標記的NleA的escN-EHEC感染HeLa細胞6小時，將其用于亞細胞組分分離，并用抗-HA抗體進行Western雜交分析。如圖14A所示，NleA易位進入宿主細胞，在那里其與宿主細胞膜組分相結合。在使用表達HA-標記的NleA的III型分泌突變體感染細胞的過程中未觀察到NleA的易位，說明NleA易位與宿主膜結合是TTSS依賴的。使用與每種組分的特異性蛋白結合的抗體對所述組分進行的Western雜交確證了不存在所述組分的交叉污染。鈣聯(lián)接蛋白，一種宿主細胞整合的膜蛋白，并不存在于宿主細胞質組分中；微管蛋白，一種宿主細胞細胞質蛋白，也不存在于宿主膜組分中。DnaK，一種非分泌的細菌蛋白，僅存在于低速沉淀中，說明沒有宿主細胞膜和胞質組分的細菌污染。由于EHEC附著的III型依賴性，NleA和DnaK都不存在于III型突變體感染細胞的低速沉淀中。為了對因EHEC附著的III型依賴性而產(chǎn)生的III型突變體感染樣本中的NleA人工缺乏進行控制，我們還用野生型或III型突變體EPEC進行了類似實驗來表達和傳遞NleA-HA，因為EPEC對HeLa細胞的附著是不依賴于III型分泌的。NleA存在于用野生型感染，而不存在于用III型突變體EPEC菌株的細胞感染的膜組分中。NleA和DnaK存在于野生型和III型突變體EPEC感染細胞的低速沉淀中。為了研究NleA與宿主細胞膜結合的本質，在冰上，在若干條件下可對含有HA-標記的NleA的感染的宿主細胞膜組分進行提取，并離心從而獲得可溶性和不溶性的膜組分(圖14B)。將這些組分使用抗-HA抗體的Western雜交分析來測定HA-標記的NleA。用高鹽(1MNaCl)或堿性pH(0.2MNa2CO3，pH11.4)處理分別去除通過靜電或親水相互作用的與外周膜結合的蛋白。NleA與宿主細胞膜的結合可以抵抗這些處理的破壞(圖14B，頂部嵌圖)，鈣聯(lián)接蛋白，一種整合膜蛋白也如此(圖14B，中部嵌圖)。相反，可在高鹽和堿性處理中從所述膜組分中提取出大部分的鈣網(wǎng)織蛋白，其是一種外周膜蛋白(圖14B，底部嵌圖)。用溶解諸如鈣聯(lián)接蛋白的整合膜蛋白的非離子去污劑TritonX-100對膜組分進行處理(圖14B，中圖)，幾乎完全的溶解了NleA，導致了所述HA-標記的NleA蛋白從不溶組分遷移到了可溶組分(圖14B，頂部嵌圖)。這些結果說明NleA易位進入宿主細胞，在那里其可作為整合的膜蛋白。實際上，通過若干跨膜結構域預測程序對所述NleA蛋白序列的分析在該序列中預測出了一個或兩個推斷性的跨膜結構域(圖11C)。實施例8NleA定位于宿主的高爾基體隨后測定了宿主細胞內(nèi)NleA的亞細胞定位。用野生型EHEC或EHECΔnleA感染HeLa細胞，并用針對于NleA和甘露糖苷酶II的抗體進行免疫熒光。在固定前，可用布雷菲德菌素A對某些樣本處理30分鐘。采用NleA和甘露糖苷酶II染色的雙色覆蓋法。用編碼GFP-NleA融合蛋白的表達構建體轉染HeLa細胞，并使用針對甘露糖苷酶II的抗體進行免疫熒光。使用抗-NleA抗體，對野生型EHEC感染的HeLa細胞進行免疫熒光染色，得到了在用EHECΔnleA感染的細胞或未感染細胞中都沒有的核周染色圖譜。這樣的圖譜并不類似于用適于晚期內(nèi)涵體、溶酶體、內(nèi)質網(wǎng)、線粒體或細胞核的標記得到的染色。然而，當用抗-NleA和針對高爾基體，包括甘露糖苷酶II的標記的抗體對細胞進行共染色時，得到了非常類似的染色圖譜，其中所述兩種蛋白的共定位相當廣泛。為了確證NleA定位于高爾基體，在固定前，將感染的細胞與破壞高爾基體結構的真菌代謝物布雷菲德菌素A孵育(27)，并進行免疫熒光。正如對高爾基體定位的蛋白所期望的那樣，布雷菲德菌素A處理導致了甘露糖苷酶II和NleA染色的擴散。觀察到了NleA與幾種其它高爾基體標記的共定位，而在使用HA和FLAG抗原決定簇標記的抗-標記抗體，對測定抗原決定簇標記的NleA染色進行的實驗中也觀察到了高爾基體的定位。為了測定NleA定位于高爾基體是否還需要其它的細菌因子還是NleA的固有性質，用編碼GFP-NleA融合蛋白的表達構建體對細胞進行了轉染。轉染的NleAGFP同樣定位于高爾基體，其在那里與甘露糖苷酶II的染色重疊。因此，我們的結果說明NleA定位于高爾基體。所觀察到的轉化的GFP-NleA融合蛋白定位于高爾基體說明，NleA蛋白含有高爾基體靶位信息，而不需要其它細菌因子來達到這一目的地。細菌傳遞的NleA也是高爾基體定位的。實施例9NleA是毒力必需的在A/E病原體中NleA的高度序列保守性(圖11C)說明NleA在感染中具有類似作用。C.rodentium是小鼠的天然病原體(53)，并本用作研究A/E發(fā)病機理的模型系統(tǒng)。在易感菌株中，C.rodentium感染是致命的，并通常在感染的6-10天導致感染小鼠的死亡(54)。更具有抗性的小鼠品系并不會由于C.rodentium感染而死亡，但會變成寄居的并發(fā)展成腸炎癥和結腸增生(54)。為了測定NleA在毒力中的作用，我們構建了nleA-缺失的C.rodentium菌株，并通過用NleA抗血清對總細菌提取物進行Western雜交證明了不存在NleA(圖16A)。通過口胃管用等量的野生型或ΔnleA細菌感染小鼠。在C.rodentium-易感性C3H-HeJ小鼠中，NleA是毒力必需的。所有感染了野生型C.rodentium的C3H-HeJ小鼠(n＝9)在感染的6-10天后全部死亡，而所有ΔnleA-感染的小鼠(n＝13)則表現(xiàn)出一些較輕的疾病癥狀，例如軟便，但依然在增重，且在整個感染過程中都比較活躍，并具有無限定的成活率(圖16B)。而且，所述ΔnleA-感染的小鼠能夠抵抗隨后用野生型C.rodentium進行的刺激(n＝5，圖16B)。因此，盡管ΔnleA菌株在易感小鼠中是非致病性的，但其也足以與宿主相互作用從而刺激保護性免疫。與C3H-HeJ小鼠相反，C.rodentium感染對遠交的NIHSwiss小鼠并不是致命的。在這些小鼠中，在大腸的C.rodentium寄居導致了腸炎癥，結腸增生和輕微的腹瀉癥狀。用野生型C.rodentium或ΔnleA菌株感染NIHSwiss小鼠，并在感染后10天處死。在第10天，用ΔnleA菌株感染的小鼠，平均比用C.rodentium感染的小鼠在結腸中的滴度低20倍(圖16C)。通過用野生型C.rodentium或ΔnleA菌株感染，并在感染后10天處死動物，對感染的NIHSwiss小鼠的結腸進行了組織學分析。將所感染小鼠的最后0.5cm結腸固定于10％的中性緩沖的福爾馬林中，進行處理，切成3μm切片，并用蘇木精和曙紅染色。使用5X和63X物鏡對所有小鼠的組織切片進行觀察和照相。其結果說明，在來自感染小鼠肛外緣的的活組織切片檢查組織學分析中，在野生型感染的組織中可見無數(shù)的細菌，而在ΔnleA感染的樣本中細菌數(shù)要稀少的多。所有感染了野生型C.rodentium的動物都表現(xiàn)出結腸增生的病理信號，而所有ΔnleA感染的小鼠都沒有增生的信號。所述野生型感染的樣本表現(xiàn)出了嚴重的炎癥和增生，其程度達到了腸腔不再明顯，且外肌肉層可見擴張，從而容納體積增大的上皮細胞。相反，ΔnleA感染的樣本卻表現(xiàn)出相對正常的組織學。在兩組小鼠中，還觀察到了在處死時的結腸重量的不同，以及腸炎癥和增生的相對程度的不同(圖16D)。正如脾重量所反映出的，野生型感染的小鼠具有比ΔnleA感染的小鼠增大的脾(圖16D)。因此，我們證明了NleA在小鼠疾病模型中對毒力的重要影響。在易感小鼠中，在C.rodentium中功能性NleA的存在可在10天之內(nèi)導致致命感染。感染了缺乏NleA菌株的小鼠幾乎沒有癥狀并在感染后具有無限定的存活。在更有抗性的小鼠品系中，C.rodentium感染是不致命的，NleA是結腸增生的發(fā)展所必需的，且在感染第10天時，在宿主腸道中出現(xiàn)了較少的nleA突變體細菌。這些研究說明了NleA在C.rodentium的毒力中具有明顯的作用。我們來自HeLa細胞EHEC感染的結果證明，在體外，NleA并不影響細菌對宿主細胞的附著或者是其他效應物的易位，這說明NleA可在抵抗宿主清除的水平上具有作用，而不是提高細菌的附著。此外，ΔnleA感染的小鼠對隨后用野生型C.rodentium刺激的抵抗也證明，nle突變體菌株寄居于宿主和與宿主的相互作用足以刺激宿主的免疫。這與C.rodentium的III型突變體相反，其并不寄居于宿主，也并會為隨后的刺激提供保護。因此，ΔnleA突變體菌株可用作弱化的疫苗菌株。參考文獻將以下出版物全文包括作用參考。1.Nataro，J.P.，和Kaper，J.B.(1998)DiarrheagenicEscherichiacoli(腹瀉性大腸桿菌).ClinMicrobiolRev11142-201。2.Frankel，G.，Phillips，A.D.，Rosenshine，I，Dougan，G.，Kaper，J.B.，和Knutt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ieser等人，MolMicrobiol.38，760(2000).34.Galan，J.E.(2001)SalmonellainteractionswithhostcellstypeIIIsecretionatwork(沙門氏菌與宿主細胞的相互作用工作時的III型分泌).AnnuRevCellDevBiol1753-86.35.Kenny，B.，DeVinney，R.，Stein，M.，Reinscheid，D.J.，F(xiàn)rey，E.A.，和Finlay，B.B.(1997)EnteropathogenicE.coli(EPEC)transfersitsreceptorforintimateadherenceintomammaliancells(致腸病大腸桿菌(EPEC)將其用于緊密附著的受體轉移至哺乳動物細胞中).Cell91511-520.36.Elliott，S.J.，Krejany，E.O.，Mellies，J.L.，Robins-Browne，R.M.，Sasakawa，C.，和Kaper，J.B.(2001)EspG，ahoveltypeIIIsystem-secretedproteinfromenteropathogenicEscherichiacoliwithsimilaritiestoVirAofShigellaflexneri(EspG，與弗氏志賀菌的VirA具有相似性的來自致腸病大腸桿菌的新的III型系統(tǒng)分泌蛋白).InfectImmun694027-4033.37.Kenny，B.，和Jepson，M.(2000)TargetingofanenteropathogenicEscherichiacoli(EPEC)effectorproteintohostmitochondria(致腸病大腸桿菌(EPEC)效應物蛋白對宿主線粒體的靶向).CellMicrobiol2579-59038.McNamara，B.P.，Koutsouris，A.，O’Connell，C.B.，Nougayrede，J.P.，Donnenberg，M.S.，和Hecht，G.(2001)TranslocatedEspFproteinfromenteropathogenicEscherichiacolidisruptshostintestinalbarrierfunction(來自致腸病大腸桿菌的易位EspF蛋白破壞了宿主的腸屏障功能).JClinInvest107621-629.39.O.Marches等人，Infect.Immun68，2171(2000).40.Tu，X.，Nisan，I.，Yona，C.，Hanski，E.，和Rosenshine，I.(2003)EspH，anewcytoskeleton-modulatingeffectorofenterohaemorrhagicandenteropathogenicEscherichiacoli(EspH，腸出血性和致腸病大腸桿菌的新的細胞骨架調(diào)控效應物).MolMicrobiol47595-606.41.D.S.Guttman等人，Science295，1722(2002).42.T.Petnicki-Ocwjeja等人，J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，7652(2002).43.S.Miller，A.M.Kukral，J.J.Mekalanos，J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，5054(1989).44.Gruenheid，S.，DeVinney，R.，Bladt，F(xiàn).，Goosney，D.，Gelkop，S.，Gish，G.D.，Pawson，T.，和Finlay，B.B.(2001)EnteropathogenicE.coliTirbindsNcktoinitiateactinpedestalformationinhostcells(致腸病大腸桿菌的Tir結合于Nck從而啟動了宿主細胞中的肌動蛋白基架形成).NatCellBiol3856-859.45.Harlow，E.，和Lane，D.(1988)Antibodiesalaboratorymanual(抗體實驗室手冊).ColdSpringHarbor，NYColdSpringHarborLaboratory.46.Hueck，C.J.(1998)TypeIIIproteinsecretionsystemsinbacterialpathogensofanimalsandplants(動物和植物細菌病原體中的III型蛋白分泌系統(tǒng)).MicrobiolMolBiolRev62379-433.47.Jarvis，K.G.，和Kaper，J.B.(1996)SecretionofextracellularproteinsbyenterohemorrhagicEscherichiacoliviaaputativetypeIIIsecretionsystem(通過推測型III型分泌系統(tǒng)的腸出血性大腸桿菌的細胞外蛋白的分泌).InfectImmun644826-4829.48.Kenny，B.，Ellis，S.，Leard，A.D.，Warawa，J.，Mellor，H.，和Jepson，M.A.(2002)Co-ordinateregulationofdistincthostcellsignallingpathwaysbymultifunctionalenteropathogenicEscherichiacolieffectormolecules(通過多功能致腸病大腸桿菌效應物分子對不同宿主細胞信號途徑的共協(xié)調(diào)調(diào)控).MolMicrobiol441095-1107.49.Knodler，L.A.，Vallance，B.A.，Hensel，M.，Jackel，D.，F(xiàn)inlay，B.和Steele-Mortimer，O.(2003)SalmonellatypeIIIeffectorsPipBandPipB2aretargetedtodetergent-resistantmicrodomainsoninternalhostcellmembranes(沙門氏菌III型效應物PipB和PipB2被靶定于宿主內(nèi)細胞膜上的抗去污劑的微區(qū)域).MolMicrobiol49685-704.50.Levine，M.M.，Bergquist，E.J.，Nalin，D.R.，Waterman，D.R.B.，HornickR.B.，Young，C.R.，和Sotman，S.(1978)Escherichiacolistrainsthatcausediarrhoeabutdonotproduceheat-labileorheat-stableenterotoxinsandarenon-invasive(引起腹瀉但不產(chǎn)生不耐熱熱或耐熱腸毒素的大腸桿菌菌株是非侵入性的).Lancet11119-1122.51.Li，Y.，F(xiàn)rey，E.，Mackenzie，A.M.，和Finlay，B.B.(2000)HumanresponsetoEscherichiacoliO157H7infectionantibodiestosecretedvirulencefactors(人對大腸桿菌O157:H7感染的反應對分泌毒力因子的抗體).InfectImmun685090-5095.52.Peeters，J.E.，Geeroms，R.，和Orskov，F(xiàn).(1988)Biotype，serotype，andpathogenicityofattachingandeffacingenteropathogenicEscherichiacolistrainsisolatedfromdiarrheiccommercialrabbits(從腹瀉的商業(yè)兔子中分離的附著和消除致腸病大腸桿菌菌株的生物型、血清型和致病性).InfectImmun561442-1448.53.Schauer，D.B.，和Falkow，S.(1993)TheeaegeneofCitrobacterfruendiibiotype4280isnecessaryforcolonizationintransmissiblemurinecolonichyperplasia(Citrobacterfruendii生物型4280的eae基因是轉移行鼠結腸增生的寄居所必需的).InfectImmun614654-4661.54.Vallance，B.A.，Deng，W.，Jacobson，K.，和Finlay，B.B.(2003)HostsusceptibilitytotheattachingandeffacingbacterialpathogenCitrobacterrodentium(對附著和消除細菌病原體Citrobacterrodentium的宿主易感性).InfectImmun713443-3453.55.Yoshida，S.，Katayama，E.，Kuwae，A.，Mimuro，H.，Suzuki，T.，和Sasakawa，C.(2002)Shigelladeliveraneffectorproteintotriggerhostmicrotubuledestabilization，whichpromotesRaclactivtyandefficientbacterialinternalization(志賀氏菌將效應物傳遞引發(fā)宿主微管蛋白不穩(wěn)定的效應物蛋白，其增強了Rac1的活性和有效的細菌內(nèi)在化).EmboJ212923-2935.56.Deng，W.，Vallance，B.A.，Li，Y.，Puente，J.L.，和Finlay，B.B.(2003)Citrobacterrodentiumtranslocatedintiminreceptor(Tir)isanessentialvirulencefactorneededforactincondensation，intestinalcolonizationandcolonichyperplasiainmicE(Citrobacterrodentium易位的緊密粘附素受體(Tir)是小鼠中肌動蛋白濃縮、腸聚集和結腸增生必需的主要毒力因子).MolMicrobiol4895-115.57.″Remington′sPharmaceuticalSciences″(19thedition)，ed.A.Gennaro，1995，MackPublishingCompany，Easton，Pa..58.Abe，A.，U.Heczko，R.Hegele，和B.Finlay.1998.TwoenteropathogenicEscherichiacolitypeIIIsecretedproteins，EspAandEspB，arevirulencefactors(兩種腸致病性大腸桿菌III型分泌蛋白EspA和EspB都是毒力因子).JournalofExperimentalMedicine1881907-1916.59.Adv.DrugDeliv.Rev.5(3)163-187(1990).60.Altschul，S.F.1991.Aminoacidsubstitutionmatricesfromaninformationtheoreticperspective(來自信息理論看法的氨基酸替換矩陣).JournalofMolecularBiology，219555-665.61.Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學技術)，JohnWiley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samestrain(口服灌注用腸毒性大腸桿菌菌株免疫的母雞的蛋黃免疫球蛋白能夠預防用相同菌株感染兔子引起的腹瀉).InfectImmun.1992，七月；60(7)2593-7.116.RomitoM，ViljoenGJ，DuPlessisDH.Elicitingantigen-specificegg-yolkIgYwithnakedDNA(用裸DNA誘發(fā)抗原特異性的蛋黃IgY).Biotechniques.2001，九月；31(3)670，672，674-5.117.YokoyamaH，UmedaK，PeraltaRC，HashiT，IcatloFCJr，KurokiM，IkemoriY，KodamaY.OralpassiveimmunizationagainstexperimentalsalmonellosisinmiceusingchickeneggyolkantibodiesspecificforSalmonellaenteritidisandS.typhimurium(使用腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌特異的雞蛋黃抗體在小鼠中進行針對實驗性沙門氏菌感染的口服被動免疫).Vaccine.1998，二月；16(4)388-93.其他實施方案盡管在此已公開了本發(fā)明的多種實施方案，但本領域所屬技術人員仍可根據(jù)常用一般知識在本發(fā)明范圍內(nèi)進行多種改變和修改。這些修改包括用基本上相同的方法為達到本發(fā)明相同結果的本發(fā)明任意方面的公知等價替換。正如在此使用的登錄號，涉及多種數(shù)據(jù)庫的登錄號，包括GenBank、歐洲分子生物學實驗室(EMBL)、日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)、或核苷酸序列的基因組序列數(shù)據(jù)中心(GSDB)，還包括蛋白信息資源(PIR)、SWISSPROT、蛋白研究基金會(PRF)、蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)(來自解析結構的序列)，以及針對多肽序列，來自于GenBank、EMBL、DDBJ或RefSeq核苷酸序列編碼區(qū)注釋的翻譯物。所使用的數(shù)字范圍包括了定義該范圍的數(shù)字。在本說明書中，“包括”一詞是開放性的術語，基本相當于短語“包括但不限于”，“包含”一詞也具有對應的詞義。在此引用的參考文獻也并不應該理解為本發(fā)明的現(xiàn)有技術。所有在此引用的出版物就如每一種單獨出版物都被特異性和單獨地指明被作為參考在此引入一樣，且就如本文全部給出那樣。本發(fā)明包括了所有實施方案及其如前所描述的變化，以及對實施例和附圖的參考。序列表<110>不列顛哥倫比亞大學等<120>細菌毒力因子及其用途<130>80021-735<140>未轉讓<141>2004-10-29<150>US60/515,703<151>2003-10-31<160>84<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1293<212>DNA<213>Citrobacterrodentium<400>1atgaacattcaaccgaacatacattccggaatcaccacacagaataatcaacaacatcat60cacgcagaacaagtgcctgtctctagctcaataccgcgatcagatttacctccaaattgc120gaagctggatttgttgtgcatattccagaggatatacagcaacatgtaccggaatgtggt180gaaacaacggctctattaagcttgataaaagatgaaggcctgctctcaggactagataaa240tatcttgctcctcaccttgaagaaggctcccttgggaaaaaagcattggatacgtttggt300ttattcaatgttactcaaatggcattagagatacccagttccgttccaggcatatctggt360aaatatggtgttcagatgaacattgtaaaaccagacatacatccaacaaccgggaactat420tttttacagctatttcctctgcatgacgaaataggttttaacttcaaagatcttcctggc480ccattaaaaaatgcattaaccaacagcagtatatcggctactgcatcgactgtagccccc540acaccaaacgacccaatgccatggtttggattaactgctcaagtggttcgtaatcatggt600gtagaacttcctatagtcaaaaccgaaaatggatggaagcttgtaggggaaacacctctt660actccagatggccccaaagccaattatacggaagaatgggttatcaggccgggagaagca720gattttaaatatggaacatcgccattacaggcaactcttggactggagtttggtgcgcat780tttaagtgggatttagataatcctaataccaaatatgccatccttaccaatgctgccgca840aatgctattggtgctgctggagggtttgcggtatccaaagtccccggcatagatccaatg900ctgtcccctcatgtcggtgcaatgcttgggcaagcagcggggcatgccgtacaatgtaat960acccccggattaaagccagacactattttatggtgggcaggcgcgacatttggagctgct1020gatttaaataaagccgaatttgataaagtgcggttcactgactaccctcgtatatggttc1080catgcacgggaaggagctttattcccaaataagcaagacattgcccgtgtaacaggcgca1140gacataaaagctatggaagaaggcgtacccgttggacatcaacatccaaaaccggaggat1200gtggtcatcgatatcgaaggtggcaattcaccacatcataatccatcaaattatgttgac1260acctttgaaataatccaagaaacaagggtctaa1293<210>2<211>1323<212>DNA<213>EnteropathogenicE.coli<400>2atgaacattcaaccgatcgtaacatccggaatcaccacacaaaacaatcgacatcatcac60gcagaacaaacgtcccctacacaaataccgcaatccgaattacctaatggatgcgaaacg120ggatttgttgttcatatcccagaggatatgcagcgacatgcaccggaatgcggtgaaaca180acagctctactgagcttgataaaagatgaaggtctgctctctgggctggataaatatctt240gcacctcatcttgaagaaggctctgcaggaaaaaaagcattggatatgtttggtttattc300aatgtctctcagatggcattagaaatacccagcaccgttccgggtatctctggtaaatat360ggtgtccagctaaacattgtaaaaccagatattcatcctacatcaggtaattatttttta420cagatattccctttgcatgatgaaataggtattaattttaaagaccttcctggtccatta480aaaaatgcattaagcaacagcaatataccaaccactgtatcgactgctgcatccactatt540gcatcagccactacttcgacggtaaccaccgcgtcaaaagacccaataccatggtttgga600ttaacagctcaagtagttcgtaatcatggtgtggaacttcctatagtcaaaactgaaaat660ggatggaagcttgttggagaaactcctcttactcctgatggccccaaagcaaattatact720gaagagtgggtgatcagaccgggagaagcagattttaaatatggtgcatctccactacag780gcaactctagggctggagtttggcgcacatttcaagtgggatttagataaccctaatact840aaatatgccgttcttaccaatgctgccgcaaatgcgcttggtgctgtagggggatttgca900gtatccagatttactggtacagatccaatgttaagtcctcatatcggtgcaatggttggg960caagcagcggggcatgccatacagtataatacccccggattaaagccagacactatttta1020tggtgggcaggtactactcttggactggctgatttaaacaaggccgagtttggagaggcc1080agattcactgactatcctcgtatatggtggcatgcaagagaaggtgccattttcccaaat1140aaagcagatattgaacatgccacaggggctgatatacgcgcaatggaagaaggtgtatct1200gttggacaacggcatccaaatccagaggatgtggtcatcaatatcgaaagcaataactca1260ccacatcataacccatcaaattatgttgataccgttgatataatccaagaaacaagagtc1320taa1323<210>3<211>1326<212>DNA<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>3atgaacattcaaccgaccatacaatctggaatcacctcacaaaacaatcaacatcatcaa60acagaacaaataccctctacacaaataccgcaatccgaattacctctaggatgccaagct120ggatttgttgttaatattccagatgatatacagcaacatgcaccggaatgcggtgaaaca180acagctctactgagcttgataaaagataaaggtctgctctcagggctagacgaatatata240gctcctcaccttgaagaaggatccataggaaaaaaaacattggatatgtttggtttattc300aatgttacccaaatggcattagagatacctagttccgtttcaggcatctctggtaaatat360ggtgtccagctaaacattgtaaaaccagatattcatcctacatcaggtaattatttttta420cagatattccctctgcatgatgaaataggttttaattttaaagaccttcctggcccgtta480aaaaatgcattaagcaacagtaatatatcaaccactgcagtgtcgactattgcatcgact540ggaacatcagccactacttcgacggtaaccaccgagccaaaagacccaataccatggttt600ggattaacagctcaagtggttcgtaatcatggtgtagaacttcctatagtcaaaactgaa660aatggatggaagcttgttggagaaacaccacttactcctgatgggccgaaagcaaattac720acggaggagtgggttatcagaccgggagaagcagattttaaatatggtgcatctccatta780caggcaactct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spAsnLysPheCysValThrArg505560GluSerHisSerGlyCysPheThrAsnLeuLeuHisArgLeuGlyTrp65707580ProLysGlyGluIleSerArgLysIleGluAlaMetLeuAsnThrSer859095ProValSerThrThrIleGluArgGlySerValHisSerAsnArgPro100105110AspLeuProProValAspTyrAlaGlnProGluLeuProProAlaAsp115120125TyrThrGlnSerGluLeuProArgValSerAsnAsnLysSerProVal130135140ProGlyAsnValIleGlyLysGlyGlyAsnAlaValValTyrGluAsp145150155160MetGluAspThrThrLysValLeuLysMetPheThrIleSerGlnSer165170175HisGluGluValThrSerGluValArgCysPheAsnGlnTyrTyrGly180185190SerGlySerAlaGluLysIleTyrAsnAspAsnGlyAsnValIleGly195200205IleArgMetAsnLysIleAsnGlyGluSerLeuLeuAspIleProSer210215220LeuProAlaGlnAlaGluGlnAlaIleTyrAspMetPheAspArgLeu225230235240GluLysLysGlyIleLeuPheValAspThrThrGluThrAsnValLeu245250255TyrAspArgMetArgAsnGluPheAsnProIleAspIleSerSerTyr260265270AsnValSerAspIleSerTrpSerGluHisGlnValMetGlnSerTyr275280285HisGlyGlyLysLeuAspLeuIleSerValValLeuSerLysIle290295300<210>75<211>293<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>75MetLeuSerProTyrSerValAsnLeuGlyCysSerTrpAsnSerLeu151015ThrArgAsnLeuThrSerProAspAsnArgValLeuSerSerValArg202530AspAlaAlaValHisSerAspAsnGlyAlaGlnValLysValGlyAsn354045ArgThrTyrArgValValAlaThrAspAsnLysPheCysValThrArg505560GluSerHisSerGlyCysPheThrAsnLeuLeuHisArgLeuGlyTrp65707580ProLysGlyGluIleSerArgLysIleGluValMetLeuAsnAlaSer859095ProValSerAlaAlaMetGluArgGlyIleValHisSerAsnArgPro100105110AspLeuProProValAspTyrAlaProProGluLeuProSerValAsp115120125TyrAsnArgLeuSerValProGlyAsnValIleGlyLysGlyGlyAsn130135140AlaValValTyrGluAspAlaGluAspAlaThrLysValLeuLysMet145150155160PheThrThrSerGlnSerAsnGluGluValThrSerGluValArgCys165170175PheAsnGlnTyrTyrGlyAlaGlySerAlaGluLysIleTyrGlyAsn180185190AsnGlyAspIleIleGlyIleArgMetAspLysIleAsnGlyGluSer195200205LeuLeuAsnIleSerSerLeuProAlaGlnAlaGluHisAlaIleTyr210215220AspMetPheAspArgLeuGluGlnLysGlyIleLeuPheValAspThr225230235240ThrGluThrAsnValLeuTyrAspArgAlaLysAsnGluPheAsnPro245250255IleAspIleSerSerTyrAsnValSerAspArgSerTrpSerGluSer260265270GlnIleMetGlnSerTyrHisGlyGlyLysGlnAspLeuIleSerVal275280285ValLeuSerLysIle290<210>76<211>50<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>76MetValMetProGlyLeuValSerTyrIleSerSerThrSerPheAla151015AsnGluMetAlaGluMetArgGlnGlnValMetGluGlyGlnIleGly202530GlyPheLeuLeuGlyGlyGluArgValArgValSerTyrLeuPheGln354045LeuHis50<210>77<211>191<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>77MetProLeuThrSerAspIleArgSerHisSerPheAsnLeuGlyVal151015GluValValArgAlaArgIleValAlaAsnGlyArgGlyAspIleThr202530ValGlyGlyGluThrValSerIleValTyrAspSerThrAsnGlyArg354045PheSerSerSerGlyGlyAsnGlyGlyLeuLeuSerGluLeuLeuLeu505560LeuGlyPheAsnSerGlyProArgAlaLeuGlyGluArgMetLeuSer65707580MetLeuSerAspSerGlyGluAlaGlnSerGlnGluSerIleGlnAsn859095LysIleSerGlnCysLysPheSerValCysProGluArgLeuGlnCys100105110ProLeuGluAlaIleGlnCysProIleThrLeuGluGlnProGluLys115120125GlyIlePheValLysAsnSerAspGlySerAspValCysThrLeuPhe130135140AspAlaAlaAlaPheSerArgLeuValGlyGluGlyLeuProHisPro145150155160LeuThrArgGluProIleThrAlaSerIleIleValLysHisGluGlu165170175CysIleTyrAspAspThrArgGlyAsnPheIleIleLysGlyAsn180185190<210>78<211>209<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<220><221>MISC_FEATURE<222>(147)..(147)<223>Xaa＝anyaminoacid<400>78MetProValThrThrLeuSerIleProSerIleSerGlnLeuSerPro151015AlaArgValGlnSerLeuGlnAspAlaAlaArgLeuGluSerGlyIle202530ArgIleSerIleGlySerGlyGlnTyrSerValHisTyrValGlnLeu354045LeuAspGlyPheSerValGluProValArgGlyGlyLeuLeuAspArg505560LeuLeuGlyArgGluHisArgMetAspArgArgAlaValAlaLeuGlu65707580ArgGlnLeuAsnGlyGlyValAspPheLeuSerSerValAsnAsnTyr859095PheGlnSerValMetAlaGluHisArgGluAsnLysThrGlyAsnLys100105110IleLeuMetGluLysIleAsnSerCysValPheGlyThrAspSerAsn115120125HisPheSerCysProGluSerPheLeuThrCysProIleThrLeuAsp130135140ThrProXaaThrGlyValPheMetArgAsnSerArgGlyAlaGluIle145150155160CysSerLeuTyrAspLysAspAlaLeuValGlnLeuValGluThrGly165170175GlyThrHisProLeuSerArgGluProIleThrGluSerMetIleMet180185190ArgLysAspGluCysHisPheAspAlaLysArgGluAlaPheCysCys195200205Lys<210>79<211>213<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>79MetProValAspLeuThrProTyrIleLeuProGlyValSerPheLeu151015SerAspIleProGlnGluThrLeuSerGluIleArgAsnGlnThrIle202530ArgGlyGluAlaGlnValArgLeuGlyGluLeuMetValSerIleArg354045ProMetGlnValAsnGlyTyrPheMetGlySerLeuAsnGlnAspGly505560LeuSerAsnAspAsnIleGlnIleGlyLeuGlnTyrIleGluHisIle65707580GluArgThrLeuAsnHisGlySerLeuThrSerArgGluValThrVal859095LeuArgGluIleGluMetLeuGluAsnMetGluLeuLeuSerAsnTyr100105110GlnLeuGluGluLeuLeuAspLysIleGluValCysAlaPheAsnVal115120125GluHisAlaGlnLeuGlnValProGluSerLeuArgThrCysProVal130135140ThrLeuCysGluProGluAspGlyValPheMetArgAsnSerMetAsn145150155160SerAsnValCysMetLeuTyrAspLysMetSerLeuIleTyrLeuVal165170175LysThrArgAlaAlaHisProLeuSerArgGluSerIleAlaValSer180185190MetIleValGlyArgAspAsnCysAlaPheAspSerAspArgGlyAsn195200205PheValLeuLysAsn210<210>80<211>213<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>80MetProValAspLeuThrProTyrIleLeuProGlyValSerPheLeu151015SerAspIleProGlnGluThrLeuSerGluIleArgAsnGlnThrIle202530ArgGlyGluAlaGlnIleArgLeuGlyGluLeuMetValSerIleArg354045ProMetGlnValAsnGlyTyrPheMetGlySerLeuAsnGlnAspGly505560LeuSerAsnAspAsnIleGlnIleGlyLeuGlnTyrIleGluHisIle65707580GluArgThrLeuAsnHisGlySerLeuThrSerArgGluValThrVal859095LeuArgGluIleGluMetLeuGluAsnMetAspLeuLeuSerAsnTyr100105110GlnLeuGluGluLeuLeuAspLysIleGluValCysAlaPheAsnVal115120125GluHisAlaGlnLeuGlnValProGluSerLeuArgThrCysProVal130135140ThrLeuCysGluProGluAspGlyValPheMetArgAsnSerMetAsn145150155160SerAsnValCysMetLeuTyrAspLysMetAlaLeuIleHisLeuVal165170175LysThrArgAlaAlaHisProLeuSerArgGluSerIleAlaValSer180185190MetIleValGlyArgAspAsnCysAlaPheAspProAspArgGlyAsn195200205PheValLeuLysAsn210<210>81<211>209<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>81MetProValThrThrLeuSerIleProSerIleSerGlnLeuSerPro151015AlaGlyValGlnSerLeuGlnAspAlaAlaArgLeuGluSerGlyIle202530ArgIleSerIleGlySerGlyGlnTyrSerValHisTyrValGlnLeu354045LeuAspGlyPheSerValGluProValArgGlyGlyLeuLeuAspArg505560LeuLeuGlyArgGluHisArgMetGluArgArgAlaValAlaLeuGlu65707580ArgGlnLeuAsnGlyGlyValAspPheLeuSerSerValAsnAsnTyr859095PheGlnSerValMetAlaGluHisArgGluAsnLysThrSerAsnLys100105110IleLeuMetGluLysIleAsnSerCysLeuPheArgProAspSerAsn115120125HisPheSerCysProGluSerPheLeuThrCysProIleThrLeuAsp130135140ThrProGluThrGlyValPheMetArgAsnSerArgGlyAlaGluIle145150155160CysSerLeuTyrAspLysAspAlaLeuValGlnLeuValGluThrGly165170175GlyAlaHisProLeuSerArgGluProIleThrGluSerMetIleMet180185190ArgLysAspGluCysHisPheAspThrLysArgGluAlaPheCysCys195200205Lys<210>82<211>191<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>82MetProLeuThrSerAspIleArgSerHisSerPheAsnLeuGlyVal151015GluValValArgAlaArgIleValAlaAsnGlyArgGlyAspIleThr202530ValGlyGlyGluThrValSerIleValTyrAspSerThrAsnGlyArg354045PheSerSerSerGlyGlyAsnGlyGlyLeuLeuSerGluLeuLeuLeu505560LeuGlyPheAsnSerGlyProArgAlaLeuGlyGluArgMetLeuSer65707580MetLeuSerAspSerGlyGluAlaGlnSerGlnGluSerIleGlnAsn859095LysIleSerGlnCysLysPheSerValCysProGluArgLeuGlnCys100105110ProLeuGluAlaIleGlnCysProIleThrLeuGluGlnProGluLys115120125GlyIlePheValLysAsnSerAspGlySerAspValCysThrLeuPhe130135140AspAlaAlaAlaPheSerArgLeuValGlyGluGlyLeuProHisPro145150155160LeuThrArgGluProIleThrAlaSerIleIleValLysHisGluGlu165170175CysIleTyrAspAspThrArgGlyAsnPheValIleLysGlyAsn180185190<210>83<211>169<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>83MetAspAlaPheIleValAspProValGlnGlyGluLeuTyrSerGly151015LeuSerHisThrGluLeuAlaAspIleIleArgLeuAlaAspSerVal202530GluAsnGlnLeuAsnGlyGlyAsnSerPheLeuAspValPheSerThr354045TyrMetGlyGlnValIleSerGluPheMetHisSerAsnAspAsnArg505560IleGluLeuLeuGlnArgArgLeuHisSerCysSerPheLeuValAsn65707580IleGluGluMetSerTyrIleAspGluAlaLeuGlnCysProIleThr859095LeuAlaIleProGlnArgGlyValPheLeuArgAsnAlaGluGlySer100105110ArgValCysSerLeuTyrAspGluMetAlaLeuSerArgIleIleAsn115120125AspGlyMetHisHisProLeuSerArgGluProIleThrLeuSerMet130135140LeuValAlaArgGluGlnCysGluPheAspCysSerIleGlyHisPhe145150155160ThrValArgSsrAspCysTyrSerVal165<210>84<211>76<212>PRT<213>EnterohemorrhagicE.coli<400>84MetAlaAspArgLysGlnHisArgAlaIleAlaGluArgArgHisIle151015GlnThrGluIleAsnArgArgLeuSerArgAlaSerArgValAlaGln202530IleMetHisIleAsnMetLeuHisGluArgSerHisAlaLeuSerAsn354045IleTyrSerAlaSerValPheSerTyrLeuAlaAspAspLeuHisGlu505560PheGlnGlnLeuIleGlnGlnGlnAsnLysLeuHis65707權利要求1.包括多肽與生理可接受的載體的組合物，所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的氨基酸序列。2.包括核酸分子與生理可接受的載體的組合物，所述核酸分子編碼包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。3.包括核酸分子與生理可接受的載體的組合物，所述核酸分子包括與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的序列基本上相同的核酸序列。4.包括細胞培養(yǎng)上清液和生理可接受的載體的組合物，所述細胞培養(yǎng)上清液包括多肽，所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的氨基酸序列。5.如權利要求4所述的組合物，其中所述多肽包括20％存在于所述組合物中的細胞蛋白。6.如權利要求1-5中任一權利要求所述的組合物，還包括EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀氏毒素1、志賀氏毒素2或緊密粘附素多肽。7.如權利要求1-6中任一權利要求所述的組合物，還包括佐劑。8.細菌或其制劑，其中所述細菌在其基因組上在與SEQIDNO1-21或60-72基本上相同的核酸序列上有突變。9.細菌或其制劑，其中所述細菌在與nleA、nleB、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG或nleH或其同源物基本相同的基因上有突變。10.如權利要求8或9所述的細菌，其中所述細菌是A/E病原體。11.如權利要求8-10中任一權利要求所述的細菌，其中所述細菌是腸出血性E.coli(EHEC)，致腸病性的E.coli(EPEC)或Citrobacterrodentium。12.如權利要求11所述的細菌，其中所述EHEC是EHECO157:H7或EHECO157:NM。13.如權利要求11所述的細菌，其中所述EPEC是EPECO127:H6。14.如權利要求8-13中任一權利要求所述的細菌，其中所述突變?nèi)趸硕玖Α?5.包括權利要求8-14中任一權利要求所述的細菌與生理可接受的載體的組合物。16.如權利要求15所述的組合物，其中所述細菌是活的。17.如權利要求16所述的組合物，其中將所述細菌口服給藥。18.如權利要求15所述的組合物，其中所述細菌是死的。19.如權利要求18所述的組合物，其中將所述細菌非腸道給藥。20.如權利要求15-19中任一權利要求所述的組合物，還包括佐劑。21.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑是水包油的乳劑或非水包油的乳劑。22.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括礦物油和溴化二甲基雙十八烷銨。23.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括選自乳化劑、胞壁酰二肽、水劑、基于幾丁質的制劑、皂角苷、油、脂多糖、細菌細胞壁提取物、細菌DNA、細菌復合物、合成的寡核苷酸和脂肪族含氮堿中的一種或多種制劑。24.如權利要求23所述的組合物，其中所述乳化劑選自天然乳化劑、合成乳化劑、陰離子乳化劑、陽離子乳化劑和非離子制劑中的一種或多種。25.如權利要求24所述的組合物，其中所述天然乳化劑選自阿拉伯樹膠、明膠、卵磷脂和膽固醇中的一種或多種。26.如權利要求24所述的組合物，其中所述陰離子乳化劑選自月桂酸鉀鹽、棕櫚酸鉀鹽、月桂酸鈉鹽、棕櫚酸鈉鹽、月桂酸銨鹽、棕櫚酸銨鹽、脂肪酸鈣鹽、脂肪酸鎂鹽、脂肪酸鋁鹽、金屬皂和有機磺酸鹽中的一種或多種。27.如權利要求26所述的組合物，其中所述有機磺酸鹽是硫酸月桂酸鈉。28.如權利要求24所述的組合物，其中所述陽離子乳化劑是溴化十六烷基三甲銨。29.如權利要求24所述的組合物，其中所述合成的乳化劑選自甘油酯、聚乙二醇酯、聚乙二醇醚和脫水山梨聚醇脂肪酸酯中的一種或多種。30.如權利要求28所述的組合物，其中所述甘油酯是單硬脂酸甘油酯。31.如權利要求28所述的組合物，其中所述脫水山梨聚醇脂肪酸酯選自脫水山梨聚醇單棕櫚酸酯及其聚氧乙烯衍生物中的一種或多種。32.如權利要求31所述的組合物，其中所述聚氧乙烯衍生物是聚氧乙烯脫水山梨聚醇單棕櫚酸酯。33.如權利要求23所述的組合物，其中所述水劑是氫氧化鋁。34.如權利要求23所述的組合物，其中所述油選自礦物油，植物油和動物油中的一種或多種。35.如權利要求34所述的組合物，其中所述植物油選自菜籽油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油和豆油中的一種或多種。36.如權利要求34所述的組合物，其中所述動物油選自魚肝油、大比目魚油、鯡油、orangeroughy魚油和鯊魚肝油中的一種或多種。37.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括油成分。38.如權利要求37所述的組合物，其中所述油成分選自單種油的一種或多種和混合油。39.如權利要求21所述的組合物，其中所述非水包油乳劑選自油性乳劑，油包水乳劑和水包油包水乳劑。40.如權利要求21所述的組合物，其中所述水包油乳劑是EMULSIGENTM或EMULSIGENPLUSTM。41.如權利要求23所述的組合物，其中所述所述油是Amphigen。42.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括分支桿菌細胞壁提取物。43.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括分支桿菌DNA。44.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括分支桿菌細胞壁復合物。45.如權利要求23所述的組合物，其中所述脂肪族含氮堿選自胺，季銨化合物，胍，芐脒和硫脲陽離子中的一種或多種。46.如權利要求23所述的組合物，其中脂肪族含氮堿是N，N-雙十八烷基-N，N-二(2-羥乙基)丙烷二胺。47.如權利要求7或20所述的組合物，其中所述佐劑包括溴化二甲基雙十八烷銨。48.如權利要求21-47中任一權利要求所述的組合物，其中所述佐劑在所述組合物中的濃度為20％-40％(體積/體積)。49.在樣本中測定存在有A/E病原體的方法，所述方法包括a)提供樣本；及b)測定核酸分子的存在，所述核酸分子包括與選自SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體中的一種或多種序列基本上相同的核酸序列，c)測定核酸分子的存在，所述核酸分子編碼與選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的氨基酸序列的多肽，或d)測定多肽的存在，所述多肽包括與選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的序列基本上相同的氨基酸序列，其中所述核酸分子或多肽的存在說明在所述樣本中存在有A/E病原體。50.如權利要求49所述的方法，其中所述樣本是糞便或血液。51.如權利要求49或50所述的方法，其中所述測定包括用與以下序列基本上相同的探針或引物接觸所述核酸序列a)選自SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的一種或多種核酸序列，或b)編碼與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的一種或多種基本上相同的多肽的核酸序列。52.如權利要求49或50所述的方法，其中所述測定包括用抗體接觸所述氨基酸序列，所述抗體特異性地結合于選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的一種或多種序列。53.在動物體內(nèi)引起針對A/E病原體或其成分的免疫反應的方法，所述方法包括向所述動物給藥有效量的權利要求1-7或15-48中任一權利要求的所述組合物，或所述方法包括向所述動物給藥有效量的權利要求8-14中任一權利要求的所述的細菌，由此引起所述動物體內(nèi)的免疫反應。54.在動物體內(nèi)降低A/E病原體集群的方法，所述方法包括向所述動物給藥有效量的權利要求1-7或15-48中任一權利要求的所述組合物，或所述方法包括向所述動物給藥有效量的權利要求8-14中任一權利要求的所述的細菌，由此降低所述動物體內(nèi)所述A/E病原體的集群。55.在動物體內(nèi)降低A/E病原體擴散的方法，所述方法包括向所述動物給藥有效量的權利要求1-7或15-48中任一權利要求的所述組合物，或所述方法包括向所述動物給藥有效量的權利要求8-14中任一權利要求的所述的細菌，由此降低所述動物體內(nèi)所述A/E病原體的擴散。56.如權利要求53-55中任一權利要求所述的方法，其中所述動物是反芻動物。57.如權利要求56所述的方法，其中所述反芻動物是?；蚓d羊。58.如權利要求53-55中任一權利要求所述的方法，其中所述動物是人。59.治療或預防由A/E病原體引起的感染的方法，所述方法包括a)鑒定動物感染了A/E病原體或具有A/E病原體感染的風險；且b)向所述動物給藥有效量的減弱A/E病原體毒力的化合物，其中所述化合物抑制了多肽的表達、分泌和生物活性，所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84中任一序列基本上相同的氨基酸序列。60.如權利要求59所述的方法，其中所述化合物是反義核酸分子，所述反義核酸分子與SEQIDNO1-21，59或73-84中任一序列基本上相同的核苷酸序列互補。61.如權利要求59所述的方法，其中所述化合物是siRNA。62.減弱A/E病原體毒力的方法，所述方法包括在所述A/E病原體中突變選自nleA、nleB、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG或nleH或其同源物中的一種或多種基因，或在所述A/E病原體基因組中突變一種或多種核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNO1-21或60-72，由此減弱毒力。63.篩選減弱A/E病原體毒力的化合物的方法，所述方法包括a)提供一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(i)核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體基本上相同的核酸序列；或(ii)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體基本上相同的氨基酸序列；或(iii)多肽，所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體基本上相同的氨基酸序列；或b)提供測試化合物；及c)測定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)所述多肽或核酸分子的表達、分泌或生物活性，其中所述多肽或核酸分子的表達、分泌或生物活性的改變說明所述化合物減弱了A/E病原體的毒力。64.如權利要求63所述的方法，其中所述系統(tǒng)是細胞。65.如權利要求63或64所述的方法，其中所述細胞是腸出血性E.coli(EHEC)，致腸病性E.coli(EPEC)或Citrobacterrodentium。66.如權利要求63所述的方法，其中所述系統(tǒng)是體外系統(tǒng)。67.產(chǎn)生A/E病原體多肽的方法，所述方法包括a)提供重組細胞，所述重組細胞包括(i)核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO1-21或60-72基本上相同的核酸序列；或(ii)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84基本上相同的氨基酸序列；及b)在允許所述多肽表達的條件下培養(yǎng)所述重組細胞。68.如權利要求67所述的方法，還包括在允許所述多肽分泌的條件下培養(yǎng)所述重組細胞。69.如權利要求67或68所述的方法，其中所述多肽是從所述細胞中分泌出來的。70.如權利要求67-69中任一權利要求所述的方法，還包括分離所述多肽。71.如權利要求49-70中任一權利要求所述的方法，其中所述A/E病原體是腸出血性E.coli(EHEC)，致腸病性E.coli(EPEC)或Citrobacterrodentium。72.如權利要求71所述的方法，其中所述EHEC是EHECO157:H7或EHECO157:NM。73.如權利要求71所述的方法，其中所述EPEC是EPECO127:H6。74.重組多肽，所述重組多肽包括與SEQIDNO22-43、59或73-84的序列基本上相同的氨基酸序列。75.分離的核酸分子，所述核酸分子包括與SEQIDNO1-21或60-72的序列基本上相同的核酸序列。76.包括如權利要求75所述的核酸序列的載體。77.如權利要求76所述的載體，其中所述載體能夠整合入A/E病原體的基因組中。78.如權利要求76所述的載體，其中所述載體不能整合入A/E病原體的基因組中。79.包括權利要求76-78中任一權利要求所述的載體的宿主細胞。80.如權利要求79所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是A/E病原體。81.如權利要求80所述的宿主細胞，其中A/E病原體是腸出血性E.coli(EHEC)，致腸病性E.coli(EPEC)或Citrobacterrodentium。82.如權利要求1-7或15-48中任一權利要求所述組合物、權利要求8-14中任一權利要求所述的細菌、權利要求74所述的多肽、或權利要求75所述的核酸分子的用途，所述用途是制備引起抗A/E病原體或其成分免疫反應、為了降低在動物中A/E病原體的擴散或集群、或為了治療或預防由A/E病原體引起的感染的藥物中的用途。83.試劑盒，所述試劑盒包括在樣本中測定A/E病原體的試劑以及教導在樣本中測定A/E病原體的包裝插入說明書。84.如權利要求83所述的試劑盒，其中所述試劑包括與以下核酸序列基本上相同的探針或引物探針或引物a)選自SEQIDNO1-21或60-72或其片段或變異體的一種或多種核酸序列，或b)編碼與SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的一種或多種基本上相同的多肽的核酸序列。85.如權利要求83所述的試劑盒，其中所述試劑包括抗體，所述抗體特異性地結合于選自SEQIDNO22-43、59或73-84，或其片段或變異體的一種或多種序列。全文摘要本發(fā)明部分地涉及細菌病原體的分泌蛋白及其使用方法。更特別地，本發(fā)明部分地提供了若干種新的針對A/E病原體的常見分泌蛋白。在本發(fā)明的某些實施方案中，這些多肽和編碼這些多肽或其部分的核酸分子可用作針對A/E病原性感染的有效疫苗、診斷學或藥物診斷工具或用作試劑。文檔編號C07K14/24GK1922324SQ200480039568公開日2007年2月28日申請日期2004年10月29日優(yōu)先權日2003年10月31日發(fā)明者布雷特·芬蕾,薩瑪莎·古恩海德,鄧萬銀,布魯斯·瓦蘭斯,何塞·L·普恩特申請人:不列顛哥倫比亞大學,墨西哥國家自治大學