本發(fā)明涉及生物制品純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒(PCV)是目前已知的最小的病毒之一，CAP蛋白是PCV2的主要抗原，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。目前，流行病學(xué)調(diào)查顯示，PCV2已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛分布，規(guī)?；B(yǎng)殖場幾乎沒有血清陰性的豬。自PMWS首次在加拿大爆發(fā)至今，全世界五大洲均診斷出PMWS的感染，對大多數(shù)養(yǎng)豬國造成了極大的威脅。

由于防治PCV2的重要性，有關(guān)PCV2疫苗的制備成為生物制品研發(fā)的熱點之一。PCV2亞單位基因工程疫苗通過原核或真核表達系統(tǒng)表達PCV2的結(jié)構(gòu)蛋白CAP，再以此來制備PCV2的病毒樣顆粒(Virus like particles,VLP)。該VLP不含有病毒核酸，卻具有與病毒相似的衣殼結(jié)構(gòu)，能夠作為抗原誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，進而產(chǎn)生抗體。目前，對于病毒樣顆粒的純化方案通常是沉淀法、離心法和透析法等，但是存在步驟復(fù)雜繁瑣，成本較高，純化效率低等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中針對病毒樣顆粒的純化方法效率較低的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中針對病毒樣顆粒的純化方法在達到所需的純度水平時步驟較為繁瑣。

本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中針對病毒樣顆粒的純化方法對特定結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒藝針對性不強、純化效果不佳、

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮8～12倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過程中，先通過蠕動泵以1.56πr²ml/min的流速利用0.9～1.1mol/L PBS溶液進行柱平衡至紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用0.9～1.1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

作為優(yōu)選，步驟4)純化之前先用無菌的0.5mol/L的NaOH溶液對Sepharose4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗20～30min，再用無菌1mol/L PBS對其進行循環(huán)沖洗，至PH為6.8～7.2。

作為優(yōu)選，步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

作為優(yōu)選，步驟1)所述的固液分離均是在4℃條件下以9500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。

作為優(yōu)選，步驟1)中所述加入細(xì)胞裂解液裂解是：加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰浴20min。

作為優(yōu)選，步驟1)所述超聲處理是以振幅為25％的超聲波每次處理10s，每兩次處理之間的時間間隔30s，超聲處理的總時間為30min。

作為優(yōu)選，步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.5～0.8μm的濾板實現(xiàn)的。

作為優(yōu)選，步驟2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡濾板5min，而后用1mol/L無菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再澄清處理步驟1)所得的細(xì)胞裂解液。

作為優(yōu)選，步驟3)中對病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實現(xiàn)的。

作為優(yōu)選，步驟3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纖維濾膜20～30min，而后用1mol/L無菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再濃縮處理步驟2)所得的病毒澄清液。

作為優(yōu)選，以上技術(shù)方案中所述PCV2病毒培養(yǎng)液是通過中國專利文獻CN105087606A所披露的方法制備的。

本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，該方法圍繞PCV2病毒樣顆粒的自身特性和其表達系統(tǒng)的特點通過實驗手段開發(fā)了全新的純化方法，該方法先綜合利用凍融和超聲處理手段實現(xiàn)細(xì)胞的裂解，而后利用濾板模塊去除大量細(xì)胞碎片和大分子雜質(zhì)，獲得無菌澄清液，再利用100kD的中空纖維膜系統(tǒng)將澄清液濃縮，獲得濃縮的病毒抗原溶液，最后利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)以優(yōu)化的操作條件層析純化。本發(fā)明方法密切針對豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的特征設(shè)計，尤其適用于重組桿狀病毒PCV2病毒樣顆粒的純化。本發(fā)明可以更高效的去除雜質(zhì)，分離獲得目的蛋白，實現(xiàn)目標(biāo)抗原的有效回收。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達基因與修飾后的基因核苷酸序列對照圖；圖中，Optimized字樣代表修飾后的基因序列，Original字樣代表豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達基因序列，二者序列存在差異的部分通過陰影表示。

圖2是本發(fā)明實施例中重組桿狀病毒pOET3-CAP的PCR結(jié)果；圖中，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCV2全基因擴增產(chǎn)物，2為重組桿狀病毒pOET3-CAP上清擴增產(chǎn)物，3為重組桿狀病毒pOET3-CAP沉淀擴增產(chǎn)物，4為sf9細(xì)胞擴增產(chǎn)物，5為ddH₂O擴增產(chǎn)物。

圖3是本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果；圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為重組桿狀病毒上清，2為重組桿狀病毒沉淀。

圖4是本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的Western-Blot鑒定結(jié)果；圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為重組桿狀病毒上清，2為重組桿狀病毒沉淀。

圖5本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定圖；圖中，A為重組桿狀病毒pOET3-CAP感染sf9細(xì)胞48h(200×)，B為正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)120h(200×)。

圖6為本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的Capto Core 700層析色譜圖：圖中峰一為目的峰，峰二為雜質(zhì)峰。

圖7為本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的各純化樣品SDS-PAGE鑒定結(jié)果：圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCV2-CAP-P2桿毒(陽性對照)，2為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過濾液，3為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過濾濾膜沖洗液，4為PCV2-CAP-P3桿毒5KD濃縮液，5為PCV2-CAP-P3桿毒5KD過膜包的穿透液。

圖8為本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的各純化樣品Western-Blot鑒定結(jié)果：圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCV2-CAP-P2桿毒(陽性對照)，2為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過濾液，3為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過濾濾膜沖洗液，4為PCV2-CAP-P3桿毒5KD濃縮液，5為PCV2-CAP-P3桿毒5KD過膜包的穿透液。

圖9為本發(fā)明實施例中表達產(chǎn)物的Sepharose 4FF分子篩層析色譜圖：圖中峰一為目的峰，峰二為雜質(zhì)峰。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細(xì)描述。

以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。

除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

實施例1人工修飾PCV2CAP基因的重組桿狀病毒的獲得

在保持氨基酸不變的前提下，將密碼子改造為桿狀病毒偏嗜密碼子，提高表達量。進行密碼子優(yōu)化時，優(yōu)先選擇昆蟲細(xì)胞使用頻率最高的密碼子。以PCV2b分離株CAP基因序列(GenBank No.EU257511.1)為原始模板，根據(jù)密碼子的偏愛性人工合成PCV2CAP基因的序列，修飾后的基因序列如SEQ ID NO2所示，修飾前后的基因序列對比情況如附圖1所示。以上修飾前后基因所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。

人工修飾后的PCV2CAP基因片段克隆至pUC57載體，通過BamHI及XhoI雙酶切，回收大量目的基因，再克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pOET3中，構(gòu)建載體pOET3-PCV2-CAP。將該重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得大量pOET3-PCV2-CAP質(zhì)粒。

按照flashBAC系統(tǒng)操作說明書，在sf9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pOET3-PCV2-CAP質(zhì)粒，獲得重組桿狀病毒pOET3-PCV2-CAP。

實施例2重組桿狀病毒PCV2的鑒定

1PCR鑒定

提取P1代桿狀病毒DNA(提取步驟按照天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行)，用引物PCV2-CAP-S/A經(jīng)PCR擴增CAP基因，以鑒定外源基因是否整合入重組桿狀病毒基因組中。

2SDS-PAGE檢測Cap蛋白的表達

準(zhǔn)備100～200mL的處于對數(shù)期的細(xì)胞活性良好的sf9細(xì)胞，細(xì)胞密度2×106cells/mL。無菌接種最多0.5mL的桿狀病毒到細(xì)胞中，擴增一般需要4～5天。收獲病毒，3000rmp4℃離心15min，無菌收獲桿毒避光保存于4℃。將收獲的重組桿狀病毒離心，分離上清及沉淀，沉淀用適量體積的PBS重懸，分別上樣。以正常細(xì)胞作為空白對照。根據(jù)目的蛋白的分子量(目的蛋白大小：27.8KD)，配制12％分離膠，進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后考馬斯亮藍染色2h～3h，取出，浸入脫色液中脫色至條帶清晰無雜帶。掃圖后分析。

3Western-blot檢測Cap蛋白的表達

將收獲的重組桿狀病毒離心，分離上清及沉淀，沉淀用適量體積的PBS重懸，分別上樣。以正常細(xì)胞作為空白對照，然后電泳并轉(zhuǎn)印。將轉(zhuǎn)印的硝酸纖維素膜完全浸沒封閉液(5％的脫脂乳)中室溫封閉2h～3h。一抗4℃孵育過夜，PBS洗膜3次。用山羊抗小鼠IgG(H+L)為二抗室溫孵育≤1h。PBST洗膜3次。BSA加到膜上后反應(yīng)顯影，顯色后觀察結(jié)果。

4IFA鑒定

在感染當(dāng)天，準(zhǔn)備細(xì)胞密度為5×105cells/ml的細(xì)胞懸液，將1mL細(xì)胞懸液加入到6孔板中，室溫孵育1h，顯微鏡觀察細(xì)胞，sf9細(xì)胞應(yīng)該覆蓋約50％面積。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，將合適稀釋度的病毒液加入6孔板中，孵育1h(或孵育過夜)，培養(yǎng)基孵育作為陰性對照。棄去病毒液，每孔中加入2mL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后48h(檢測蛋白表達的最佳時段)，進行間接免疫熒光。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入0.5mL冰甲醇(-20℃)固定10min。棄去固定液，自然干燥10min，PBS洗三遍，每遍5min。0.1％的Triton室溫孵育10min，PBS洗三遍，每遍5min。5％BSA 37℃封閉30min。棄上清。加入1:1000稀釋的一抗，37℃孵育45min(或4℃孵育過夜)，PBS洗三遍，每遍5min。加入1:1000稀釋的二抗(FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG)，37℃孵育≤1h。PBS洗三遍，每遍5min。每孔加入0.5mL PBS，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，可以檢測到陽性信號，空白細(xì)胞則為陰性。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，感染細(xì)胞可觀察到強烈的熒光，而正常sf9細(xì)胞沒有熒光信號，表明重組桿狀病毒能表達Cap蛋白且具有很好的免疫活性。

實施例3重組桿狀病毒PCV2的純化

一初純

將重組桿狀病毒PCV2毒液9500rpm 4℃離心30min，分離上清，用PBS重懸沉淀，將沉淀反復(fù)凍融3次后用均質(zhì)機破碎細(xì)胞，9500rpm 4℃離心30min，收集上清。調(diào)整樣品的PH至7.5，將上清過0.45μm的濾器，濾液用作過柱樣品。

二精細(xì)純化

1裝柱：按照說明書推薦比例，在柱高10cm的柱子內(nèi)裝填10ml Capto Core700填料，約為柱體積一半。

2水洗：用一個柱子體積(1CV)的蒸餾水清洗柱子。流速約為1.6ml/min

3平衡：用至少5CV的緩沖液平衡柱子或等到UV基線、PH和導(dǎo)電性都穩(wěn)定。

4上樣：裝填不到200ml的樣品過柱。收集每一個流穿峰。

5洗脫：用5到20CV的緩沖液洗柱子。

6清洗：用含有1M NaOH的30％異丙醇或27％丙醇反向清洗柱子。

平衡：用5到20CV的緩沖液平衡柱子或等到UV基線、PH和導(dǎo)電性都達到需要值。

實施例4重組桿狀病毒PCV2的純化

一裂解

將重組桿狀病毒PCV2毒液反復(fù)凍融3次，置于離心管中，9500rpm 4℃離心20min，PBS洗滌3次，棄去上清。在沉淀的細(xì)胞泥中加入適量4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰上作用20min。4℃9500r/min離心20min，棄去上清。加入適量4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，然后超聲(振幅25％)處理，每次10s間隔30s，超聲30min。

二澄清

將濾板模塊CH ST110(P)(0.5-0.8μm)裝入簡易裝置中，組裝完畢后用無菌0.5mol/L NaOH溶液對系統(tǒng)進行浸泡處理5min。用無菌1mol/L PBS溶液對系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗，洗去殘余的溶液，直至PH為7.0左右。將重組桿狀病毒PCV2CAP毒液通過上述濾板，去除大量細(xì)胞碎片和大分子雜質(zhì)，獲得無菌澄清液。

三濃縮

用無菌0.5mol/L NaOH溶液對100kD中空纖維膜系統(tǒng)進行浸泡處理至少20min。用無菌1mol/L PBS對系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗，洗去殘余的溶液，直至PH為7.0左右。取濾板過濾液通過100kD中空纖維膜進行純化處理，將毒液濃縮10倍，分別留存濃縮液及透過液，準(zhǔn)備檢測。

四層析純化

用無菌0.5mol/L NaOH溶液對Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗20～30min。用無菌1mol/L PBS對系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗，洗去殘余的溶液，直至PH為7.0左右。

將層析柱進液管連接至蠕動泵，出液管連接至紫外蛋白檢測儀(可連接電腦采集數(shù)據(jù)或記錄儀進行記錄)。開啟蠕動泵設(shè)置流速v＝1.56πr2ml/min(r表示層析柱半徑)，用1mol/L PBS進行柱平衡直至紫外檢測OD280基線平穩(wěn)，暫停蠕動泵。將蠕動泵進液管插入抗原濃縮液中啟動蠕動泵開始上樣。上樣結(jié)束后暫停蠕動泵，將其進液管移入無菌1mol/L PBS中啟動蠕動泵進行洗脫。紫外檢測OD280值增加時開始收集第一洗脫峰，OD280值降至最低時停止收集。繼續(xù)洗脫層析柱至抗原液全部流出柱體，進行下一次上樣。

五純化樣品的測定

對各階段純化樣品進行SDS-PAGE、Western-blot檢測。實驗結(jié)果可以看出，實施例4的純化工藝經(jīng)過裂解、澄清、濃縮和層析純化的工藝流程，可以更高效的去除雜質(zhì)，分離出目的蛋白，達到有效回收目的抗原地目的，提供了一種針對重組桿狀病毒PCV2的純化方法。

實施例5

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮8倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過程中，先通過蠕動泵以1.56πr²ml/min的流速利用0.9mol/L PBS溶液進行柱平衡至紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用0.9mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

步驟4)純化之前先用無菌的0.5mol/L的NaOH溶液對Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗20min，再用無菌1mol/L PBS對其進行循環(huán)沖洗，至PH為6.8。

步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

步驟1)所述的固液分離均是在4℃條件下以9500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。

步驟1)中所述加入細(xì)胞裂解液裂解是：加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰浴20min。

步驟1)所述超聲處理是以振幅為25％的超聲波每次處理10s，每兩次處理之間的時間間隔30s，超聲處理的總時間為30min。

步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.5μm的濾板實現(xiàn)的。

步驟2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡濾板5min，而后用1mol/L無菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再澄清處理步驟1)所得的細(xì)胞裂解液。

步驟3)中對病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實現(xiàn)的。

步驟3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纖維濾膜20min，而后用1mol/L無菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再濃縮處理步驟2)所得的病毒澄清液。

實施例6

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮12倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過程中，先通過蠕動泵以1.56πr²ml/min的流速利用1.1mol/L PBS溶液進行柱平衡至紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用1.1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

步驟4)純化之前先用無菌的0.5mol/L的NaOH溶液對Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗30min，再用無菌1mol/L PBS對其進行循環(huán)沖洗，至PH為7.2。

步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

步驟1)所述的固液分離均是在4℃條件下以9500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。

步驟1)中所述加入細(xì)胞裂解液裂解是：加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰浴20min。

步驟1)所述超聲處理是以振幅為25％的超聲波每次處理10s，每兩次處理之間的時間間隔30s，超聲處理的總時間為30min。

步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.8μm的濾板實現(xiàn)的。

步驟2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡濾板5min，而后用1mol/L無菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再澄清處理步驟1)所得的細(xì)胞裂解液。

步驟3)中對病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實現(xiàn)的。

步驟3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纖維濾膜30min，而后用1mol/L無菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再濃縮處理步驟2)所得的病毒澄清液。

實施例7

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮10倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過程中，先通過蠕動泵以1.56πr²ml/min的流速利用1mol/L PBS溶液進行柱平衡至紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

步驟4)純化之前先用無菌的0.5mol/L的NaOH溶液對Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進行循環(huán)沖洗25min，再用無菌1mol/L PBS對其進行循環(huán)沖洗，至PH為7。

步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.6μm的濾板實現(xiàn)的。

步驟3)中對病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實現(xiàn)的。

實施例8

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮10倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過程中，先通過蠕動泵以1.56πr²ml/min的流速利用1mol/L PBS溶液進行柱平衡至紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司

<120> 一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法

<160> 2

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 天然序列（豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達基因）

<400> 1

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACCGGAGA AGAAGACACC 40

GCCCCCGCAG CCATCTTGGC CAGATCCTCC GCCGCCGCCC 80

CTGGCTCGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG 160

GATATACTAT CAAGCGAACC ACAGTCAAAA CGCCCTCCTG 200

GGCGGTGGAC ATGATGAGAT TCAATATTAA TGACTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCGCTCT GTGCCCTTTG 280

AATACTACAG AATAAGAAAG GTTAAGGTTG AATTCTGGCC 320

CTGCTCCCCG ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

AGTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA 400

CAGCCCTCAC CTATGACCCC TATGTAAACT ACTCCTCCCG 440

CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGCTAC 480

TTTACCCCCA AACCTGTCCT AGATTCCACT ATTGATTACT 520

TCCAACCAAA CAACAAAAGA AATCAGCTGT GGCTGAGACT 560

ACAAACTGCT GGAAATGTGG ACCACGTAGG CCTCGGCATT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAA TACAATATCC 640

GTGTAACAAT GTATGTACAA TTCAGAGAAT TTAATTTAAA 680

GACCCCCCAC TTAACCCTTA ATGAATAA 708

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列（修飾后的豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達基因）

<400> 2

ATGACATACC CAAGAAGAAG ATACAGACGC AGAAGACACA 40

GACCCCGTTC GCACCTCGGA CAAATCCTGA GAAGAAGACC 80

GTGGCTCGTG CACCCAAGGC ATAGATACCG CTGGCGCCGT 120

AAGAACGGCA TCTTCAACAC GAGATTGTCT CGCACGTTCG 160

GATACACCAT TAAGCGTACC ACTGTGAAAA CCCCGTCATG 200

GGCTGTCGAC ATGATGAGGT TCAACATCAA CGATTTCCTG 240

CCTCCCGGTG GCGGTTCCAA CCCAAGAAGC GTCCCGTTCG 280

AGTACTACCG TATCAGGAAG GTGAAAGTCG AATTCTGGCC 320

TTGCTCCCCC ATTACTCAGG GTGACCGTGG TGTCGGCTCC 360

AGCGCCGTTA TCCTGGACGA TAACTTCGTT ACCAAGGCTA 400

CTGCCCTCAC ATACGACCCT TACGTGAACT ACTCTTCAAG 440

ACACACAATT ACGCAGCCCT TCAGTTACCA TTCGCGCTAC 480

TTCACTCCAA AGCCGGTCCT CGACAGTACA ATCGATTACT 520

TCCAACCTAA CAACAAACGT AACCAGCTGT GGCTCAGGTT 560

GCAAACTGCA GGCAACGTTG ACCACGTGGG ACTGGGTATC 600

GCGTTCGAGA ACAGCATTTA CGATCAAGAA TACAACATCC 640

GCGTTACAAT GTACGTCCAG TTCAGAGAGT TCAACCTCAA 680

AACCCCCCAC CTCACCCTCA ACGAGTAA 708