本發(fā)明涉及藥物合成領(lǐng)域，具體而言，涉及一種地加瑞克的制備方法。

背景技術(shù)：

地加瑞克(degarelix)由ferringpharmaceuticals公司開發(fā)，經(jīng)美國fda批準，于2008年12月24日在美國上市，用于治療晚期前列腺癌。

地加瑞克是一種促性腺激素釋放激素(gnrh)受體抑制劑類藥物，可逆性地抑制垂體gnrh受體來減少促性腺激素釋放繼而抑制睪酮的釋放。地加瑞克通過抑制對前列腺癌持續(xù)生長至關(guān)重要的睪酮來延緩前列腺癌的生長和惡化。以激素方法治療前列腺癌來降低睪酮濃度在初期時卻造成睪酮濃度激增，此初始刺激該激素受體可暫時性地促進而非抑制腫瘤生長，而地加瑞克則不會有這種現(xiàn)象。ⅲ期臨床研究顯示，地加瑞克降低睪酮濃度的效果至少可與亮丙瑞林儲庫型控釋注射劑相媲美，而且降低睪酮濃度顯效快。在治療的第三日，地加瑞克組96％達到去生殖腺的睪酮濃度，亮丙瑞林組效果為0％。第十四日，地加瑞克組99％達到去生殖腺的睪酮濃度，亮丙瑞林組為18％。在臨床研究中，前列腺特異抗原(psa)濃度可作為監(jiān)測的第2個療效判斷終點。使用地加瑞克兩周后，降低psa64％，一個月后降低psa85％，三個月后降低psa95％，并在治療的一整年中始終抑制psa。地加瑞克在臨床研究中報道的最常見的不良反應(yīng)是：注射部位反應(yīng)(疼痛，紅腫和腫脹)，熱潮紅，體重增加，乏力和某些肝酶濃度升高。

作為一個人工合成的十肽，地加瑞克存在以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：

該化學(xué)結(jié)構(gòu)中c端第五個氨基酸aph(l-hor)上的六元環(huán)l-hor在堿性條件下容易發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，生成乙內(nèi)酰脲-5-乙酸，機理如下：

上述反應(yīng)會導(dǎo)致產(chǎn)品中存在一個和目標產(chǎn)物性質(zhì)相近的雜質(zhì)ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser-aph(z)-d-4aph(cbm)-leu-ilys-pro-d-ala-nh2，其中z代表乙內(nèi)酰脲-5-乙?；?，這增大了純化難度，并降低了產(chǎn)品收率。

為了防止aph(l-hor)上的六元環(huán)l-hor在堿性條件下發(fā)生異構(gòu)反應(yīng)，多數(shù)文獻中選擇使用aph(x)替代aph(l-hor)，其中x代表l-hor的替代性保護基。然后采用fmoc固相合成策略依次將fmoc-pro-oh、fmoc-ilys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-4aph(cbm)-oh、fmoc-4aph(x)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh以及fmoc-d-2nal-oh按地加瑞克的氨基酸排列順序進行連接；去除n端fmoc，用乙酸酐和吡啶進行乙酰化；去除c端第6個氨基酸殘基-4aph(x)上的保護基x，將l-4,5-dihydrooroticacid連接到c端第6個氨基酸殘基-4aph的側(cè)鏈氨基上。

上述技術(shù)方案帶來的弊端為：

使用mmt或dmt代替5位苯丙氨酸苯環(huán)4位氨基相連的乳清酸時，需要使用tfa/dcm脫除z后偶聯(lián)l-hor，脂上使用tfa除去mmt或dmt基團。這會影響酸敏感的boc等基團，并導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量和收率不高。而且該方法采用的生產(chǎn)原料較貴，直接導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高，且片段合成操作復(fù)雜，不利于規(guī)?；a(chǎn)。

使用teoc代替5位苯丙氨酸苯環(huán)4位氨基相連的乳清酸時，所使用的原料合成困難，且成本較高。

使用ivdde代替5位苯丙氨酸苯環(huán)4位氨基相連的乳清酸時，反應(yīng)中需要采用fmoc-aph(ivdde)-oh作為原料。但此原料合成困難，且工藝復(fù)雜，不適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

使用trt代替5位苯丙氨酸苯環(huán)4位氨基相連的乳清酸時，該方法中需要在樹脂上使用tfa除去三苯甲基。這會影響酸敏感的boc等基團，從而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)和收率不高，而且合成原料較貴，直接導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種地加瑞克的制備方法，以解決現(xiàn)有地加瑞克的制備方法中，使用的原料需要采用保護基團進行保護，這會造成原料合成困難及合成路線工藝成本高的問題。

為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種地加瑞克的制備方法，制備方法包括：采用固相合成法將fmoc-d-ala-樹脂、fmoc-pro-oh、fmoc-ilys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-4aph(cbm)-oh、fmoc-4nph-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh以及ac-d-2nal-oh依次按地加瑞克的氨基酸順序進行第一縮合反應(yīng)，得到第一中間產(chǎn)物；將第一中間產(chǎn)物中的氨基酸殘基4nph還原為4aph，得到第二中間產(chǎn)物；使4aph的側(cè)鏈氨基與l-4,5-二氫乳清酸進行第二縮合反應(yīng)，得到第三中間產(chǎn)物；及采用裂解劑對第三中間產(chǎn)物進行裂解，得到地加瑞克。

進一步地，還原過程包括：采用還原劑將第一中間產(chǎn)物的中4nph殘基還原為4aph，其中還原劑為crcl2。

進一步地，制備方法還包括將fmoc-d-丙氨酸與樹脂進行第三縮合反應(yīng)制得fmoc-d-丙氨酸-樹脂的步驟；優(yōu)選地，還原劑的用量為樹脂的替代度的2.5～5.0倍。

進一步地，樹脂選自rinkamide樹脂，rinkamideam樹脂，rinkamidembha樹脂或sieber酰胺樹脂，優(yōu)選樹脂的替代度為0.3～0.8mmol/g。

進一步地，還原過程的反應(yīng)溫度為65～75℃，時間為1.5～2h。

進一步地，裂解過程中，裂解劑與第三中間產(chǎn)物的體積比為10～15:1。

進一步地，裂解劑選自三氟乙酸和/或水；優(yōu)選為95vol％三氟乙酸水溶液。

進一步地，裂解過程中，反應(yīng)溫度為15～40℃，反應(yīng)時間為2～3h。

進一步地，裂解過程中使用的沉淀劑選自甲基叔丁醚和/或乙醚。

進一步地，第一縮合反應(yīng)、第二縮合反應(yīng)和第三縮合反應(yīng)中，使用的縮合劑分別獨立地選自n，n-二異丙基碳亞胺與y的混合物，其中且y選自1-羥基苯并唑和/或1-羥基-7-疊氮苯并三唑；或者偶聯(lián)劑為n-乙基二異丙胺與2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯的混合液。

應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，采用特有的原料fmoc-4nph-oh與fmoc-d-ala-樹脂、fmoc-pro-oh、fmoc-ilys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-4aph(cbm)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh以及ac-d-2nal-oh進行固相合成反應(yīng)，制備地加瑞克產(chǎn)品。上述特有原料fmoc-4nph-oh在堿性環(huán)境下較為穩(wěn)定，因而采用上述原料不需要引入保護基團，這有效地避免了因保護基團的引入而產(chǎn)生副反應(yīng)，從而能夠提高地加瑞克產(chǎn)品的純度。此外，上述固相合成反應(yīng)的操作簡單、反應(yīng)速率快，且原料廉價易得，因而采用上述方法制備地加瑞克還有利于大幅降低工藝成本和合成難度。綜上所述，采用上述制備方法制備地加瑞克，不僅有利于提高產(chǎn)物的純度，還有利于降低合成難度和工藝成本。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1示出了地加瑞克標樣的主體結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜圖；

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例1中的方法制得的地加瑞克的主體結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜圖；

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例1中的方法制得的地加瑞克的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。

正如現(xiàn)有技術(shù)所描述的，解決現(xiàn)有地加瑞克的制備方法中，使用的原料需要采用保護基團進行保護，這會造成原料合成困難及合成路線工藝成本高的問題。為了解決上述技術(shù)問題，本申請?zhí)峁┝艘环N地加瑞克的制備方法，該制備方法包括：采用固相合成法將fmoc-d-ala-樹脂、fmoc-pro-oh、fmoc-ilys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-4aph(cbm)-oh、fmoc-4nph-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh以及ac-d-2nal-oh依次按地加瑞克的氨基酸順序進行第一縮合反應(yīng)，得到第一中間產(chǎn)物；將第一中間產(chǎn)物中的氨基酸殘基4nph還原為4aph，得到第二中間產(chǎn)物；使上述4aph的側(cè)鏈氨基與l-4,5-二氫乳清酸進行第二縮合反應(yīng)，得到第三中間產(chǎn)物；及采用裂解劑對第三中間產(chǎn)物進行裂解，得到所需的地加瑞克。

本申請上述制備方法中，采用特有的原料fmoc-4nph-oh(fmoc-對硝基-l-苯丙氨酸)與fmoc-d-ala-樹脂(n-(9-芴甲氧羰基)-d-丙氨酸樹脂)、fmoc-pro-oh(n-(9-芴甲氧羰基)-l-脯氨酸)、fmoc-ilys(boc)-oh(n-芴甲氧羰基-n'-叔丁氧羰基-n'-異丙基-l-賴氨酸)、fmoc-leu-oh(芴甲氧羰基-l-亮氨酸)、fmoc-d-4aph(cbm)-oh(4-[(氨基羰基)氨基]-n-[芴甲氧羰基]-d-苯丙氨酸)、fmoc-ser(tbu)-oh(n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-o-叔丁基-l-絲氨酸)、fmoc-d-3pal-oh(芴甲氧羰基-3-(3-吡啶基)-d-丙氨酸)、fmoc-d-phe(4cl)-oh(n-(9-芴甲氧羰?；?-d-4-氯苯丙氨酸)以及ac-d-2nal-oh(r-2-乙酰胺基-β-萘基苯丙氨酸)進行固相合成反應(yīng)，得到第一中間產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式i)。然后將第一中間產(chǎn)物中的氨基酸殘基4nph還原為4aph，得到第二中間產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式ⅱ)。最后將上述4aph的側(cè)鏈氨基與l-4,5-二氫乳清酸進行第二縮合反應(yīng)，得到第三中間產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式ⅲ)。由于上述第三中間產(chǎn)物通常含有多個肽鏈結(jié)構(gòu)，因而需要進行切割得到單一的肽鏈結(jié)構(gòu)。第三產(chǎn)物經(jīng)裂解劑裂解后，得到所需的地加瑞克產(chǎn)品。

上述特有原料fmoc-4nph-oh在堿性環(huán)境下較為穩(wěn)定，因而采用上述原料不需要引入保護基團，這有效地避免了因保護基團的引入而產(chǎn)生副反應(yīng)，從而能夠提高地加瑞克產(chǎn)品的純度。此外，在進行上述固相合成反應(yīng)的反應(yīng)操作簡單、反應(yīng)速率快，且原料廉價易得，因而采用上述原料制備地加瑞克還有利于大幅降低工藝成本和合成難度。綜上所述，采用上述制備方法制備地加瑞克，不僅有利于提高產(chǎn)物的純度，還有利于降低合成難度和工藝成本。

本申請中提到的術(shù)語“固相合成法”為本領(lǐng)域所熟知的多肽合成技術(shù)。具體地，上述制備方法中的第一縮合反應(yīng)包括：去保護劑的存在下，脫掉氨基的保護基團fmoc，然后將fmoc-d-ala-樹脂固定在固相載體上。然后將第二個氨基酸fmoc-pro-oh中的羧基活化后，在偶聯(lián)劑的作用下將活化好的fmoc-pro-oh鍵合到fmoc-d-ala-樹脂上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物1。然后以同樣的原理，通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-ilys(boc)-oh鍵合到上述中間產(chǎn)物1上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物2。通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-leu-oh鍵合到上述中間產(chǎn)物2上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物3。通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-d-4aph(cbm)-oh鍵合到上述中間產(chǎn)物3上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物4。通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-4nph-oh鍵合到上述中間產(chǎn)物4上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物5。通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-ser(tbu)-oh鍵合到上述中間產(chǎn)物5上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物6。通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-d-3pal-oh鍵合到上述中間產(chǎn)物6上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物7。通過偶聯(lián)反應(yīng)將fmoc-d-phe(4cl)-oh鍵合到上述中間上形成肽鍵，得到中間產(chǎn)物8。通過偶聯(lián)反應(yīng)將ac-d-2nal-oh鍵合到上述中間上形成肽鍵，得到第一中間產(chǎn)物。通過上述過程實現(xiàn)了肽鏈的增長，最終得到所需的第一中間產(chǎn)物。

如果將fmoc-d-ala-樹脂、fmoc-pro-oh、fmoc-ilys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-4aph(cbm)-oh、fmoc-4nph-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh以及ac-d-2nal-oh依次記為氨基酸1、2……、n(n為1～9)，將第一縮合反應(yīng)中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物依次記為中間產(chǎn)物1、2……、n(n為1～8)。優(yōu)選地，第一縮合反應(yīng)中，氨基酸2與氨基酸1的摩爾之比為2～3:1，中間產(chǎn)物n與氨基酸n+1的摩爾之比為2～3:1。

在上述肽鏈的增長過程中，可以通過茚三酮檢測偶聯(lián)反應(yīng)是否反應(yīng)完全。

上述“將氨基酸殘基4nph還原為4aph”是指將還原為

在一種優(yōu)選的實施方式中，還原過程包括：采用還原劑將第一中間產(chǎn)物中的氨基酸殘基4nph還原為4aph，其中還原劑為crcl2。上述還原反應(yīng)中，還原劑包括但不限于crcl2，而選用其作為還原劑有利于提高還原反應(yīng)的還原率。

在一種優(yōu)選的實施方式中，上述制備方法還包括：將fmoc-d-丙氨酸與樹脂進行第三縮合反應(yīng)制得fmoc-d-丙氨酸-樹脂的步驟，優(yōu)選，還原劑的用量為樹脂的替代度的2.5～5.0.倍。還原劑的用量包括但不限于上述范圍，而將還原劑的用量限定為上述范圍有利于提高還原反應(yīng)中fmoc-d-丙氨酸-樹脂的產(chǎn)率。

本申請中“樹脂替代度”是指每克樹脂中含有多少毫摩爾量(mmol)的反應(yīng)位點。

在一種優(yōu)選的實施方式中，樹脂包括但不限于rinkamide樹脂，rinkamideam樹脂，rinkamidembha樹脂或sieber酰胺樹脂，優(yōu)選樹脂的替代度為0.3～0.8mmol/g。

在一種優(yōu)選的實施方式中，還原過程的反應(yīng)溫度為65～70℃，時間為1.5～2h。上述制備方法中，還原過程的反應(yīng)溫度和時間包括但不限于上述范圍，而將其限定在上述范圍內(nèi)，有利于進一步提高還原反應(yīng)的反應(yīng)速率。

上述制備方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇裂解劑的用量。在一種優(yōu)選的實施方式中，裂解過程中，裂解劑與第三中間產(chǎn)物的體積比為10～15：1。裂解劑與第三中間產(chǎn)物的體積比包括但不限于上述范圍，而將其限定在上述范圍內(nèi)有利于提高肽鏈的裂解效果。

在一種優(yōu)選的實施方式中，裂解劑包括但不限于三氟乙酸(tfa)和/或水；優(yōu)選為95vol％三氟乙酸水溶液。裂解劑的作用是將肽鏈進行切割，上述幾種裂解劑的酸性較強，選用上述裂解劑有利于提高裂解過程的肽鏈的切割效果。

上述制備方法中，裂解反應(yīng)的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間可以選擇本領(lǐng)域常用的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。在一種優(yōu)選的實施方式中，裂解過程中，反應(yīng)溫度為15～40℃，反應(yīng)時間為2～3h。將裂解反應(yīng)的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間限定在上述范圍內(nèi)，有利于提高裂解過程中的切割。

在一種優(yōu)選的實施方式中，裂解過程中使用的沉淀劑包括但不限于甲基叔丁醚和/或乙醚。沉淀劑可以能夠破壞肽鏈表面的水膜，進而使得肽鏈的溶解平衡被打破，進而有利于提高肽鏈的沉淀效果。而上述幾種沉淀劑具有較大的體積，且易帶有電荷，因而將上述幾種物質(zhì)作為沉淀劑，有利于進一步提高肽鏈的沉淀速率。

此外，為了進一步提高產(chǎn)物的純度，還可以對產(chǎn)品進行進一步的純化。優(yōu)選地，純化步驟包括：(1)將產(chǎn)物溶解有機溶劑中，得到混合液，然后采用濾膜對上述混合液進行過濾，得到濾液。(2)采用液相色譜對上述濾液進行多次純化，其中純化過程中的檢測波長為280mm。(3)將上述濾液進行脫鹽、濃縮、凍干，得到純度較高的地加瑞克產(chǎn)品。

上述制備方法中，在一種優(yōu)選的實施方式中，第一縮合反應(yīng)、第二縮合反應(yīng)和第三縮合反應(yīng)中，使用的偶聯(lián)劑分別獨立地選自n，n-二異丙基碳亞胺(dic)與y的混合物，或者n-乙基二異丙胺(dipea)與2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)的混合液；其中且y選自1-羥基苯并唑(hobt)和/或1-羥基-7-疊氮苯并三唑(hoat)。選dic和(dipea為堿性物質(zhì)，氨基酸中的羧基在上述堿性物質(zhì)的作用下被活化，然后在dipea、hatu或hoat的作用下，氨基酸進行偶聯(lián)反應(yīng)形成肽鍵。同時選用上述幾種偶聯(lián)劑還有利于提高偶聯(lián)效果。

本申請中所涉及到的物質(zhì)的名稱及結(jié)構(gòu)見表1。

表1

以下結(jié)合具體實施例對本申請作進一步詳細描述，這些實施例不能理解為限制本申請所要求保護的范圍。

實施例1

1、fmoc-d-ala-rink樹脂的合成

將rinkamidam樹脂(10mmol，替代度0.65mmol/g)裝入固相反應(yīng)柱中，用dmf對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，然后向上述固相反應(yīng)柱中加入500mldmf，以通過浸泡使上述樹脂溶脹，浸泡時間為30min。采用500ml20％dblk對上述固相反應(yīng)柱中加入進行沖洗，以使部分fmoc脫除，反應(yīng)時間為10min。然后向上述固相反應(yīng)柱中再次加入500ml20％dblk，以使剩余的fmoc脫除，反應(yīng)時間為10min，然后采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

將9.34gfmoc-d-ala-oh和8.84ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-d-ala-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行第三縮合反應(yīng)，并不斷進行攪拌，第三縮合反應(yīng)的時間為2h，得到第三縮合反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述第三縮合反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將第三縮合反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗6次，采用dcm對上述濾餅沖洗3次，采用meoh對上述濾餅進行收縮三次(時間依次為5min，5min和10min)，洗滌完畢后，將上述濾餅進行干燥，得到fmoc-d-ala-rink樹脂，經(jīng)檢測替代度為0.62mmol/g。

2、第一中間產(chǎn)物的合成

步驟一：將fmoc-d-ala-rink樹脂(10mmol)裝入固相反應(yīng)柱中，用dmf對上述固相反應(yīng)住沖洗2次，然后向上述固相色譜柱中加入100mldmf，以通過浸泡使上述樹脂溶脹，浸泡時間為30min。使20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

將6.74gfmoc-pro-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-pro-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟二：將10.28gfmoc-ilys(boc)-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-ilys(boc)-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟三：將7.10gfmoc-leu-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-leu-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟四：將8.97gfmoc-d-4aph(cbm)-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-d-4aph(cbm)-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟五：將8.68gfmoc-4nph-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-4nph-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟六：將7.69gfmoc-ser(tbu)-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-ser(tbu)-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟七：將7.86gfmoc-d-3pal-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-d-3pal-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟八：將8.48gfmoc-d-phe(4-cl)-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-d-phe(4-cl)-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

步驟九：將5.41gac-d-2nal-oh和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，以使fmoc-pro-oh進行預(yù)活化，預(yù)活化的時間為2～5min。將活化好的混合液加入到固相反應(yīng)柱中，進行偶聯(lián)反應(yīng)，并不斷進行攪拌，偶聯(lián)反應(yīng)的時間為2h，得到偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物。采用茚三酮對上述偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。最后將偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾，得到濾餅。然后采用dmf對上述濾餅沖洗4次，采用20％dblk對上述固相反應(yīng)柱沖洗兩次，以使脫除fmoc(沖洗時間均為10min)，最后在采用dmf對上述固相反應(yīng)柱洗滌6次。

2、還原反應(yīng)

將上述肽樹脂(第一中間產(chǎn)物)導(dǎo)入250ml四口瓶中，并向上述四口瓶中加入3.07gcrcl2(相當于樹脂替代度的2.5倍)以及60mldmf，得到混合液。在70℃下，將上述混合液進行還原反應(yīng)，反應(yīng)時間為3小時，得到還原反應(yīng)的產(chǎn)物。反應(yīng)完畢后將第二中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至多肽固相反應(yīng)柱中，使用dmf洗滌六次，dcm洗滌兩次，得到第二中間產(chǎn)物。

3、第二縮合反應(yīng)

將3.27gl-4,5-二氫乳清酸和4.26ghobt溶解在60mldmf中，得到混合液，并將上述混合液在冰浴中冷卻10min。然后向上述混合液中加入5.05gdic，使l-4,5-二氫乳清酸進行活化，活化時間為2～5min。

將活化好的上述混合液加入多肽固相反應(yīng)柱中，使l-4,5-二氫乳清酸與第二中間產(chǎn)物發(fā)生第二縮合反應(yīng)，并不斷攪拌，反應(yīng)時間為2h。用茚三酮對第二縮合反應(yīng)的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈陰性。將第二縮合反應(yīng)的產(chǎn)物進行抽濾得到濾餅，然后將上述濾餅采用dmf洗滌四次，dcm洗滌兩次，甲醇三次，并收縮樹脂，最后轉(zhuǎn)移至真空干燥箱干燥，得肽樹脂ac-d-2nal-d-phe(cl)-d-pal-ser-4nph-d-aph(cbm)-leu-ilys(boc)-pro-d-ala-rink，即第三中間產(chǎn)物，28.17g。

4、第三中間產(chǎn)物的裂解

將上述第三中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，并將360ml冰凍(-5℃)好的裂解液(三氟乙酸：h2o的體積比為95:5)加入該圓底燒瓶中，并在室溫(25℃)的條件下攪拌反應(yīng)2h，過濾，得到濾液。然后將上述濾液中與3.6l冰凍甲基叔丁基醚進行肽鏈沉淀，得到沉淀產(chǎn)物。然后將上述沉淀產(chǎn)物進行過濾干燥后，得到16.8g粗肽(地加瑞克粗產(chǎn)品)(收率:99.6wt％，純度：91.8wt％)。

5、粗產(chǎn)品的純化

(1)溶解

將粗肽(地加瑞克粗產(chǎn)品)稱重，碾碎放至燒杯中，以30g/l的用量加入溶劑，其中溶劑為乙腈水溶液，乙腈和水的體積比為40：60％。然后采用超聲波對上述混合液進行超聲，以使地加瑞克粗產(chǎn)品完全溶解，得到混合液。使用0.45μm尼龍66微孔濾膜對上述混合液進行過濾。

(2)純化

a)第一次純化：

將色譜柱用50wt％乙腈水溶液沖洗干凈后，用5wt％乙腈水溶液平衡系統(tǒng)5min后，以16～23g/次的上樣量進行hplc純化，檢測波長為280nm。根據(jù)色譜峰分段收集餾分，并將收集的餾分用分析液相色譜儀進行檢測，純度≥99.0wt％且單雜≤0.2wt％餾分即為第一步合格餾分。其余為不合格餾分，不合格餾分中純度大于80wt％部分再進行回收純化，純度小于80wt％作廢液處理。

b)第二次純化：

將色譜柱用50wt％乙腈水溶液沖洗干凈后，用5wt％乙腈水溶液平衡系統(tǒng)5min后，以14～20g/次的上樣量進行hplc純化，檢測波長為280nm波長處監(jiān)測。根據(jù)色譜峰分段收集餾分，并將收集的餾分用分析液相色譜儀進行檢測，純度≥99.8wt％且單雜≤0.1wt％餾分即為第二步合格餾分。其余為不合格餾分，不合格餾分中純度大于80wt％部分再進行回收純化，純度小于80wt％作廢液處理。

c)脫鹽、轉(zhuǎn)鹽

采用醋酸銨對b)得到的第一洗脫產(chǎn)物進行沖洗，得到中間產(chǎn)物；再通過醋酸鹽對中間產(chǎn)物進行沖洗，能夠?qū)⒌谝划a(chǎn)物中的部分三氟乙酸根轉(zhuǎn)化為醋酸根，進而將第一洗脫產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為醋酸鹽。

d)濃縮及凍干：

濃縮至20mg/ml左右，凍干后得到6.8g精肽(地加瑞克產(chǎn)品)(收率40wt％，純度：99.8wt％)。采用質(zhì)譜分析儀對上述產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行測試。圖1示出了地加瑞克標樣的主體結(jié)構(gòu)質(zhì)譜圖，圖2是實施例1中得到的地加瑞克產(chǎn)品的主體結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜圖，圖3示出了對地加瑞克進行質(zhì)譜測試時的質(zhì)譜圖。通過比對，可以確認實施例1制得的產(chǎn)品為地加瑞克。

實施例2

與實施例1的區(qū)別是：還原劑的用量為樹脂替代度的3.0倍。

實施例3

與實施例1的區(qū)別是：還原劑的用量為樹脂替代度的1.5倍。

實施例4

與實施例1的區(qū)別是：還原反應(yīng)的溫度為65℃，反應(yīng)時間為3h。

實施例5

與實施例1的區(qū)別是：還原反應(yīng)的溫度為75℃，反應(yīng)時間為3h。

實施例6

與實施例1的區(qū)別是：還原反應(yīng)的溫度為40℃。

實施例7

與實施例1的區(qū)別是：樹脂為rinkamidembha樹脂。

實施例8

與實施例1的區(qū)別是：樹脂為sieber酰胺樹脂。

實施例9

與實施例1的區(qū)別是：裂解劑與第三中間產(chǎn)物的體積比為10：1。

實施例10

與實施例1的區(qū)別是：裂解劑與第三中間產(chǎn)物的體積比為15：1。

實施例11

與實施例1的區(qū)別是：裂解劑為tfa。

實施例12

與實施例1的區(qū)別是：裂解反應(yīng)的反應(yīng)溫度為5℃。

實施例13

與實施例1的區(qū)別是：沉淀劑為乙醚。

實施例14

與實施例1的區(qū)別是：偶聯(lián)劑均為dic和hoat。

實施例15

與實施例1的區(qū)別是：偶聯(lián)劑均為dipea和hatu。

實施例16

與實施例1的區(qū)別是：偶聯(lián)劑為hobt和dic。

實施例1至16中的產(chǎn)品的純度及收率，見表1。

表1

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。