本發(fā)明屬于病毒核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種5種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒，可在同一個反應(yīng)管內(nèi)同時檢測豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tgev)、豬輪狀病毒a型(porcinegrouparotaviruses，gar)、豬輪狀病毒c型(porcinegroupcrotaviruses，gcr)、豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirus2，pcv2)五種豬腹瀉病毒，適用于臨床及科研中對五種豬腹瀉病毒的快速定量檢測。
背景技術(shù)：
：近年來全球豬腹瀉病頻發(fā)，發(fā)病規(guī)模大，導(dǎo)致的經(jīng)濟損失慘重(chaeetal，2000，sunetal，2012)。2010來我國各地發(fā)生流行性腹瀉，以爆發(fā)式的發(fā)展席卷我國10多個南方省份，100％的出生不久仔豬感染率直接導(dǎo)致100多萬的仔豬死亡。病毒感染是豬腹瀉主要病因。pedv、tgev、gar、gcr和pcv2被認(rèn)為是豬病毒性腹瀉的幾個主要病原體。豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起豬的一種以嘔吐、腹瀉和脫水為主要特征的腸道傳染病。該病以7日齡以內(nèi)仔豬發(fā)病為主，病程短、傳播迅速、仔豬死亡率極高，可達100％。1978年，比利時和英國首次報道pedv疫情，1984年，我國證實該病的存在。在2010-2012年中國不同地區(qū)均有pedv大暴發(fā)的報道，造成哺乳仔豬大量死亡，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)屬冠狀病毒科、冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈不分節(jié)段的rna，全長28.5kb。對小腸造成損傷，產(chǎn)生消化和吸收不良，最終導(dǎo)致腹瀉和脫水，引起哺乳仔豬死亡。該病毒感染率高，造成的仔豬死亡率高。輪狀病毒(rv)屬于呼腸病毒科家族，無包膜，基因組是一條的11分段的雙鏈rna(estesandcohen,1989)。rv是引起包括人類以及其他動物腹瀉的重要因素，目前輪狀病毒以vp6基因分成6型，a、b、c、e和h組(gar、gbr、gcr、ger和ghr)都已經(jīng)在豬上檢測出。gar在1975年首次報道，一直被認(rèn)為是豬腹瀉的一個主要病原。gcr在1979年首次被檢測出，很難進行細胞培養(yǎng)。gcr能引起嚴(yán)重胃腸感染且易造成散發(fā)性傳播或大爆發(fā)。一般gar被認(rèn)為是引起豬腹瀉的首因，而gbr、gcr的作用沒那么大。douglasmarthaler等應(yīng)用rt-pcr檢測7508份豬腹瀉樣品的研究發(fā)現(xiàn)gar的陽性率為62％，gcr感染率也很高(53％)，gcr主要感染1-20天仔豬，gar主要感染21天以上仔豬。認(rèn)為應(yīng)該同時檢測gar和gcr。豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，近年新報道豬病毒，是能在哺乳動物細胞自主復(fù)制最小單鏈環(huán)狀dna病毒，包含4個開放閱讀框(orf)：orf1-4(murphy,1995)。豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(pcvad)癥狀之一是引發(fā)腸炎。pcv2可以由單獨感染或者混合感染引發(fā)腸炎。pcv2對豬有很強感染力，各年齡都可感染，而且侵害豬的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抑制和其它病原微生物繼發(fā)感染。目前，傳統(tǒng)診斷方法難以檢測不同病毒感染，單一的病毒診斷費時費力，特別是當(dāng)前豬腹瀉混合感染的現(xiàn)象嚴(yán)重，這些都使得檢測更需要一個準(zhǔn)確有效的方法來區(qū)分不同病毒。豬病毒分子診斷已經(jīng)有很多的報道，包括多重普通pcr方法，但未見針對這5種主要豬腹瀉病毒的多重診斷技術(shù)方法。而且現(xiàn)有的多重普通pcr靈敏度都在104-103copies左右。這種靈敏度不能滿足低拷貝病毒量的早期檢測。普通pcr檢測以其簡單高效等優(yōu)點被廣泛使用，多重pcr在減少工作量的基礎(chǔ)上，一次加樣檢測多種病毒也能大大減小實驗加樣帶來的污染。本實驗在保證實驗特異性和重復(fù)性的基礎(chǔ)上探索建立一套針對這五種病毒的多重普通pcr檢測方法，提高豬腹瀉病毒檢測靈敏度。常規(guī)的病原學(xué)和血清學(xué)檢測很難將這些疾病同時加以區(qū)別鑒定，同時又存在操作繁瑣、費時費力、敏感度低等缺陷，尤其是多種病原感染時，難以有效進行早期檢測，容易產(chǎn)生誤判錯判。而多重實時熒光定量pcr技術(shù)可以一次同時檢測多種病原體，并具有高特異性和敏感性、檢測時間短、檢測成本低等優(yōu)點，是一種較為理想的檢測方法。因此，開發(fā)出一種同時特異檢測多種豬腹瀉病毒感染的多重實時熒光定量rt-pcr快速診斷試劑盒，有助于提升病毒檢測水平，在腹瀉疾病診斷和防治及食品安全等方面具有重要的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒及其應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種五種豬病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒，包括如下5對病毒特異性引物：pedv-f：ggcggatactggaatgagcaa，pedv-r：ggtcggcgtgaggtcctgtt；tgev-f：atggtgttaggtgattattttcc，tgev-r：aatacaatgctttaagattttcca；gar-f：tgaagtgaggaccaggctaa，gar-r：acgaaatcacacccttacttg；gcr-f：tgttgcatccgtgaagagaatggt，gcr-r：gcattagcccctacgcaagc；pcv2-f:atccgaaggtgcgggaga；pcv2-r:tgacgtatccaaggaggcg。作為本發(fā)明的五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒的改進：所述試劑盒包括：a)、熒光定量pcr反應(yīng)液，b)、陽性對照品，c)、陰性對照品，d)、引物(5對病毒特異性引物)，e)、定量pcr標(biāo)準(zhǔn)品。作為本發(fā)明的五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒的進一步改進：所述定量pcr標(biāo)準(zhǔn)品由以下5種標(biāo)準(zhǔn)品組成：pedv標(biāo)準(zhǔn)品、tgev標(biāo)準(zhǔn)品、gar標(biāo)準(zhǔn)品、gcr標(biāo)準(zhǔn)品、pcv2標(biāo)準(zhǔn)品。上述五種病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：所述pedv標(biāo)準(zhǔn)品序列為(103bp)：ggatactggaatgagcaaattcgctggcgcatgcgccgtggtgagcgaattgaacaaccttccaattggcatttctactacctcggaacaggacctcacgccgacc。tgev標(biāo)準(zhǔn)品序列為(105bp)：tggtgttaggtgattattttcctactgtacaaccttggtttaattgcattcgcaatgatagtaatgacctttatgttacactggaaaatcttaaagcattgtatt。gar標(biāo)準(zhǔn)品序列為(97bp)：ttaagtgaggactaggctaactacctggtatccgatcttaaccaacatgtagctatgtcaagtcaatcagactctacaagtaagggtatgat-ttcat。gcr標(biāo)準(zhǔn)品序列為(121bp)：cgtccgtgaagagaatggtgatgtagataagctagagatctaatcaatctctatgcggactgcacatcatgtagcatgattcacgaatgggtttagtccatgcttgcgtaggggtaaatgc。pcv2標(biāo)準(zhǔn)品序列為(162bp)：atccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccagcggtaacggtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggatacgtca。作為本發(fā)明的五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒的進一步改進：所述熒光定量pcr反應(yīng)液包含mastermix、熒光染料(20×evagreen)。作為本發(fā)明的五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒的進一步改進：所述陽性對照品含tgev、gar、gcr、pedv和pcv2五種病毒的陽性質(zhì)?；旌掀?每種病毒濃度約為300ng/μl)；所述陰性對照品為：滅菌后焦碳酸二乙酯處理水(depc-h2o)。作為本發(fā)明的五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒的進一步改進：每種病毒特異性引物的上下游引物同管包裝。作為本發(fā)明的五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒的進一步改進：所述試劑盒避光保存于-20℃，應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明還同時提供了上述任一所述的試劑盒在多重實時熒光定量檢測五種豬腹瀉病毒感染中的用途。作為本發(fā)明的用途的改進：五種豬腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒(pedv)、豬傳染性胃腸炎病毒(tgev)、豬輪狀病毒a型(gar)、豬輪狀病毒c型(gcr)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)。作為本發(fā)明的用途的進一步改進，tm值范圍為：tgev為74.4～75℃、gar為76.6～77.2℃、gcr為79～79.7℃、pedv為82.9～83.5℃、和pcv2為86.9～87.7℃。本發(fā)明的診斷試劑盒，能用于檢測檢測。表1、本發(fā)明所設(shè)計的多重實時熒光定量pcr引物引物名稱序列(5′→3′)pedv-fggcggatactggaatgagcaapedv-rggtcggcgtgaggtcctgtttgev-fatggtgttaggtgattattttcctgev-raatacaatgctttaagattttccagar-ftgaagtgaggaccaggctaagar-racgaaatcacacccttacttggcr-ftgttgcatccgtgaagagaatggtgcr-rgcattagcccctacgcaagcpcv2-fatccgaaggtgcgggagapcv2-rtgacgtatccaaggaggcg本發(fā)明試劑盒的使用方法具體可如下：每次檢測根據(jù)具體使用情況設(shè)立陰性對照和陽性對照；標(biāo)準(zhǔn)品用無菌雙蒸水稀釋為5.0×102～5.0×108copies/μl。rna/dna病毒樣品提?。焊鶕?jù)產(chǎn)品使用說明書，用病毒rna/dna抽提試劑盒minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0(takara)從細胞株、新鮮或冷凍的樣本提取病毒核酸。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在無rnase的0.2mlpcr管中依次加入上一步驟制備的總rna/dna模板1μl，使用takararnapcrkit(amv)ver.3.0進行rt-pcr反應(yīng)，其中10×rtpcrbuffer1μl，25mmmgcl22μl，10mmdntpmixture1μl，40u/μlrnaseinhibitor0.25μl，5u/μlamvrtasexl0.5μl，random9mers0.5μl，rnasefreedh2o至總體積為10μl，待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cdna/dna模板。核酸的檢測：取1μl已抽提的待測樣品核酸cdna/dna為模板進行多重?zé)晒鈖cr反應(yīng)，15μl的mastermix，20×evagreen1μl，10μmtgev、gar、gcr、pedv和pcv2上下游引物分別為0.5μl、0.5μl、0.15μl、0.15μl、0.4μl，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為20μl；熒光pcr擴增程序為：95℃變性5min，接下來40個循環(huán)程序為95℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，溶解曲線程序為：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃開始收集熒光信號。程序成功運行完后從結(jié)果中得到溶解曲線及對應(yīng)的tm值。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取tgev、gar、gcr、pedv和pcv2重組質(zhì)粒系列標(biāo)準(zhǔn)品5×102～5×107copies/μl進行實時定量熒光pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系：1μl標(biāo)準(zhǔn)品模板，15μl的mastermix，20×evagreen1μl，10μmtgev、gar、gcr、pedv和pcv2上下游引物分別為0.5μl、0.5μl、0.15μl、0.15μl、0.4μl，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為20μl。反應(yīng)參數(shù)為：95℃5min；95℃變性20s，55℃退火30min，72℃延伸30s，40個循環(huán)。擴增完成后，以ct值為縱坐標(biāo)，log10x(x為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度)為橫坐標(biāo)，ct值與log10x呈線性關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量結(jié)果報告：1)、通過tgev、gar、gcr、pedv和pcv2的擴增產(chǎn)物在熔解曲線中對應(yīng)的峰值高低及有無來判定檢測樣品。如果其中tgev、gar、gcr、pedv和pcv2相應(yīng)擴增產(chǎn)物產(chǎn)生特異熔解峰，即出現(xiàn)對應(yīng)的tm值(通過多次試驗統(tǒng)計學(xué)方法所得tgev為74.4～75℃、gar為76.6～77.2℃、gcr為79～79.7℃、pedv為82.9～83.5℃和pcv2為86.9～87.7℃)，則檢測結(jié)果對應(yīng)于該種病毒為陽性，即待測樣品攜帶相應(yīng)病毒，反之，則陰性沒有攜帶相應(yīng)病毒。2)、如果檢測結(jié)果為陽性，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品ct值，計算待測標(biāo)本病毒(copies/μl)。本發(fā)明的優(yōu)點：運用實時熒光定量pcr技術(shù)，采用tgev、gar、gcr、pedv和pcv2五種腹瀉病毒的特異性引物，開發(fā)研制一種基于溶解曲線分析的多重實時熒光定量pcr快速診斷五種豬腹瀉病毒試劑盒。該發(fā)明通過一個pcr反應(yīng)可以從樣本中同時檢測tgev、gar、gcr、pedv和pcv2單個或混合感染，比傳統(tǒng)的普通pcr方法靈敏、更簡便、省時和快捷，并且能夠?qū)Υ龣z測的病毒進行實時準(zhǔn)確定量，且比單重?zé)晒舛縫cr方法更省時，節(jié)約成本。本發(fā)明提供的試劑盒可靈敏區(qū)分不同腹瀉病毒感染，為腹瀉病毒感染的檢測提供快速簡便的工具，從而為實現(xiàn)腹瀉臨床早期診斷和及時制定治療方案、減少死亡率及后遺癥成為可能。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1為五種腹瀉病毒特異性熔解峰圖(dissociationcurve)；圖1中，從左至右依次為：tgev、gar、gcr、pedv和pcv2。圖2為檢測靈敏度的熔解曲線圖(dissociationcurve)；圖2中，每種熔解曲線中從上到下依次為5×108～5×100copies/μl重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；陰性對照如圖2中的標(biāo)注所述。圖3為含五種豬病毒(tgev、gar、gcr、pedv和pcv2)陽性樣品混合進行五重實時熒光定量pcr檢測實例圖；從左到右熔解峰依次為tgev、gar、gcr、pedv和pcv2。圖4為tgev、pedv和pcv2陽性樣本的檢測結(jié)果圖。圖5為tgev和pcv2陽性樣本的檢測結(jié)果圖。圖6為gar和gcr陽性樣本的檢測結(jié)果圖。圖7為pedv標(biāo)準(zhǔn)曲線(standardcurve)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。實施例1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備第一步：引物合成將本發(fā)明所設(shè)計的5種病毒引物序列(見表1)在中國上海生工生物公司技術(shù)服務(wù)公司合成引物，合成量為每引物3od。第二步：病毒總dna/rna提取將含有tgev、gar、gcr、pedv和pcv2的陽性樣品各100ul置于1.5ml離心管中，根據(jù)產(chǎn)品使用說明書，用病毒rna/dna抽提試劑盒minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0(takara)提取，得到病毒rna/dna。第三步：反轉(zhuǎn)錄合成cdna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在無rnase的0.2mlpcr管中依次加入上一步驟制備的總rna/dna模板2μl，根據(jù)takaraonesteprnapcrkit(amv)(codeno.rr024a)的操作說明書，進行rt-pcr反應(yīng)，待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cdna/dna模板。第四步：普通pcr擴增pcr反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積25ul)：10×pcrbuffer2.5μl，25mmmgcl22μl，2.5mμdntp1μl，taqdnapolymerase1u，以第三步中合成cdna/dna為模板(1μl)，第一步中合成的五種病毒引物中的一種(濃度10μm，0.5μl)，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為25μl；分別進行pcr擴增。反應(yīng)在bio-rads1000pcr擴增儀進行，反應(yīng)參數(shù)為：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，72℃5min。第五步：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備將第四步獲得的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，按照dnagelextractionkit操作方法回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到pmd18-t載體上，通過大腸桿菌dh5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化，挑取其中白色單菌落進行鑒定，重組質(zhì)粒序列委托上海生工生物公司進行序列測定。利用plasmidminiprepkit提取測序正確的重組質(zhì)粒dna，利用nanodrop2000定量重組質(zhì)粒為4.8×1011copies/ul、2.6×1011copies/ul、1.8×1012copies/ul、6.7×1012copies/ul和3.2×1012copies/ul分別對應(yīng)于tgev、gar、gcr、pedv和pcv2，以無菌雙蒸水將重組質(zhì)粒按照5.0×107～5.0×100copies/ul10倍梯度稀釋制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。實施例2、本發(fā)明檢測五種病毒特異性實驗第一步：引物合成將本發(fā)明所設(shè)計的5種病毒引物序列(見表1)在中國上海生工生物公司技術(shù)服務(wù)公司合成引物，合成量為每引物3od。第二步：單個病毒在多重體系中的特異性檢測按照evagreen多重實時熒光定量pcr反應(yīng)體系配制5份相同的反應(yīng)液(即，15μl的mastermix，20×evagreen1μl，10μmtgev、gar、gcr、pedv和pcv2上下游引物分別為0.5μl、0.5μl、0.15μl、0.15μl、0.4μl)，分別單獨加入1μl的1.0×106copies/μl的tgev、gar、gcr、pedv和pcv2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為20μl；反應(yīng)在abi7300熒光定量儀上進行，反應(yīng)參數(shù)為：95℃5min；95℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。熔解曲線程序為95℃15s，60℃1min，95℃15s；同時進行pbov、ppv、prrsv、csfv、pedv和prv每種病毒的多重實時熒光定量pcr特異性檢測試驗。60℃開始收集熒光信號。特異性試驗結(jié)果顯示：在多重反應(yīng)體系下分別單獨加入tgev、gar、gcr、pedv和pcv2的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行實時熒光定量pcr反應(yīng)，每種病毒的擴增片段在其相應(yīng)目的片段tm值位置都有特異的目的熔解峰產(chǎn)生(參見圖1)，可見本發(fā)明中構(gòu)建的evagreen多重實時熒光定量pcr反應(yīng)體系特異性較好。tgev、gar、gcr、pedv和pcv2的tm范圍是通過檢測50份陽性樣品確定的tm值，再用統(tǒng)計學(xué)方法計算出平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差，所得tm值范圍tgev為74.4～75℃、gar為76.6～77.2℃、gcr為79～79.7℃、pedv為82.9～83.5℃、和pcv2為86.9～87.7℃。實施例3、本發(fā)明檢測五種病毒穩(wěn)定性實驗第一步：引物合成同實施例1中第一步。將tgev、gar、gcr、pedv和pcv2，分別進行如下操作：每種病毒取6份1.0×106copies/μl的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和2份陰性對照品(depc-h20)，分別進行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗。批內(nèi)重復(fù)試驗是將3份樣品在同一次實時熒光中重復(fù)3次；批間重復(fù)試驗是在3次不同時間的試驗中(間隔3天)進行實時熒光定量pcr試驗。所述實時熒光定量pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上述實施例2的步驟第二步所示。5種病毒的批間、批內(nèi)重復(fù)試驗的變異系數(shù)cv值均小于4％，本發(fā)明檢測過程中具有良好的穩(wěn)定性。實施例4、本發(fā)明檢測五種病毒敏感性實驗第一步：引物合成同實施例1中第一步。第二步：敏感性檢測以10倍系列稀釋的tgev、gar、gcr、pedv和pcv2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(5.0×108～5.0×100copies/μl)做為模板，每個稀釋度設(shè)立3個重復(fù)，分別進行實時熒光定量pcr和普通pcr檢測敏感度，比較敏感性。所述實時熒光定量pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上述實施例2的步驟第二步所示；普通pcr反應(yīng)體系為：10×pcrbuffer2.5μl，25mmmgcl22μl，2.5mμdntp1μl，taqdnapolymerase1u，加水至25μl，反應(yīng)程序為：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，72℃5min，取5μl擴增產(chǎn)物進行1.5％的瓊脂糖電泳檢測。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明可檢測出5～50copies/μl的病毒量(圖2)，具體為：gcr的最低檢出量為5copies，gar為50copies，tgev為5copies，pedv為5copies，pcv2為5copies。而常規(guī)pcr只能檢測到5.0×102～5.0×103copies/μl的病毒量，具體為：gcr的最低檢出量為5×103copies，gar為5×103copies，tgev為5×103copies，pedv為5×103copies，pcv2為5×102copies。由此可見本發(fā)明檢測病毒的敏感性高于常規(guī)pcr約100-1000倍。實施例5、本發(fā)明對五種豬病毒多重實時熒光pcr檢測實例第一步：引物合成同實施例1中第一步。第二步：病毒總dna/rna提取將含有tgev、gar、gcr、pedv、pcv2的5種已知陽性樣品(豬糞)各取100μl混合置于1.5ml離心管中，根據(jù)產(chǎn)品使用說明書，用病毒rna/dna抽提試劑盒minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0(takara)提取，得到各病毒總rna/dna。第三步：反轉(zhuǎn)錄合成cdna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在無rnase的0.2mlpcr管中加入上一步驟制備的總rna/dna模板2μl，進行rt-pcr反應(yīng)，其中10×rtpcrbuffer1μl，25mmmgcl22μl，10mmdntpmixture1μl，40u/μlrnaseinhibitor0.25μl，5u/μlamvrtasexl0.5μl，random9mers0.5μl，rnasefreedh2o至總體積為10μl，待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cdna/dna模板。第四步：多重?zé)晒舛縫cr擴增多重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系：15μl的mastermix，20×evagreen1μl，10μmtgev、gar、gcr、pedv和pcv2上下游引物分別為0.5μl、0.5μl、0.15μl、0.15μl、0.4μl，上述步驟所得的模板1μl，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為20μl；同時設(shè)一陽性對照和一陰性對照(depc-h2o)。反應(yīng)在abi7300熒光定量儀上進行，反應(yīng)參數(shù)為：95℃5min；95℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。熔解曲線程序為95℃15s，60℃1min，95℃15s。60℃開始收集熒光信號。第五步：檢測結(jié)果判定根據(jù)abi7300熒光定量pcr儀所自動生成的熔解曲線圖，來分析擴增結(jié)果。備注說明：各病毒擴增產(chǎn)物tm值范圍tgev為74.4～75℃、gar為76.6～77.2℃、gcr為79～79.7℃、pedv為82.9～83.5℃、和pcv2為86.9～87.7℃。結(jié)果顯示：本發(fā)明能很好地同時通過pcr擴增出對應(yīng)五種病毒擴增產(chǎn)物，并通過熔解曲線峰不同，將五種產(chǎn)物明顯區(qū)分開來，陰性對照只有一個較小非特異熔解峰，不影響結(jié)果判斷。本實施例的試驗結(jié)果見圖3。圖3中：左到右依次為tgev、gar、gcr、pedv和pcv2。根據(jù)圖3，我們可得以下結(jié)論：五種病毒可同時通過一次多重實時熒光pcr反應(yīng)，擴增出各自相應(yīng)目的產(chǎn)物，并能在熔解曲線上，通過溶解峰tm的不同，將各種病毒有效區(qū)分開來，試驗結(jié)果與陽性對照品產(chǎn)生的熔解曲線很吻合，而陰性對照熔解曲線上沒有熔解峰，可以很直觀通過熔解曲線來判定試驗結(jié)果，證明所檢測五種病毒正是tgev、gar、gcr、pedv和pcv2。實施例6、本發(fā)明檢測臨床樣品五種豬腹瀉病毒試驗及對臨床檢測陽性樣品中病毒進行準(zhǔn)確定量第一步：引物合成同實施例1中第一步。第二步：樣本采集臨床樣本共計75份，其中在浙江地區(qū)采集糞便59份，組織病料16份。第三步：總dna/rna小量抽提根據(jù)產(chǎn)品使用說明書，用病毒rna/dna抽提試劑盒minibestviralrna/dnaextractionkitver.4.0(takara)從新鮮或冷凍的第二步中采集的樣本中提取病毒核酸。第四步：反轉(zhuǎn)錄合成cdna/dna：同實施例5中第三步。第五步：普通pcr檢測和多重?zé)晒舛縫cr1、普通pcr檢測：pcr反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，25mmmgcl22μl，2.5mμdntp1μl，taqdna聚合酶1u，以第四步中合成cdna/dna(約100ng)為模板，0.5μl第一步中合成的病毒引物(濃度10μm)，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為25μl。反應(yīng)在bio-rads1000pcr擴增儀進行，反應(yīng)參數(shù)為：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，72℃5min。2、多重?zé)晒舛縫cr過程同實施例5中第四步；第六步：結(jié)果檢測普通pcr結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；多重?zé)晒舛縫cr結(jié)果檢測同實施例5中第五步。普通pcr法檢測與本發(fā)明檢測結(jié)果如下：普通pcr檢測出pedv27份，本發(fā)明檢測出39份；普通pcr檢測出pcv224份，本發(fā)明檢測出32份陽性；普通pcr檢測出rvc10份，本發(fā)明檢測出17份陽性；普通pcr檢測出rva1份，本發(fā)明檢測出3份陽性；普通pcr檢測出tgev5份，本發(fā)明檢測出8份陽性；其中，本發(fā)明檢測出pcv2、tgev和pedv混合感染1份，普通pcr檢測出pcv2、tgev和pedv混合感染0份；本發(fā)明檢測出pcv2和pedv混合感染11份，普通pcr檢測出pcv2和pedv混合感染7份；本發(fā)明檢測出tgev和pcv2混合感染2份，普通pcr檢測出tgev和pcv2混合感染0份；本發(fā)明檢測出rva與rvc混合感染1份，普通pcr檢測出rva與rvc混合感染0份。部分檢測結(jié)果如圖4-6。驗證實驗：按照本行業(yè)所公認(rèn)的檢測精度最好的單重實時熒光定量pcr法對上述75份樣品進行復(fù)查，所得結(jié)果完全同本發(fā)明。本發(fā)明檢測效果明顯好于普通pcr檢測效果，可以減少假陰性的發(fā)生，同時一次實驗可以檢測出病毒混合感染，減少二次pcr驗證及不需要pcr擴增后續(xù)處理，大大節(jié)約時間，提高工作效率。第七步：對陽性檢測結(jié)果進行準(zhǔn)確定量分別取tgev、gar、gcr、pedv和pcv2重組質(zhì)粒系列標(biāo)準(zhǔn)品(5×102～5×107copies/μl)以及待測樣品cdna/dna進行實時定量熒光pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系：1μl標(biāo)準(zhǔn)品模板或待測樣品cdna/dna，10×pcrbuffer5μl，25mmmgcl25μl，2.5mμdntp4μl，20×evagreen2.5μl，taqdna聚合酶2.5u，tgev、gar、gcr、pedv和pcv2上下游引物終濃度在反應(yīng)體系中各為0.26、0.12、0.14、0.13、0.05及0.13μm，加ddh2o至反應(yīng)體系總體積為50μl。反應(yīng)參數(shù)為：95℃5min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)，擴增完成后，以ct值為縱坐標(biāo)，logco為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為pedv定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品ct值，計算待測標(biāo)本病毒copies/μl。通過結(jié)果分析得出所采集樣本中tgev、gar、gcr、pedv和pcv2五種病毒的總dna/cdna的大都在101～104copies/μl之間，而在普通pcr檢測呈陰性通過本發(fā)明檢測結(jié)果為陽性的樣本，其對應(yīng)拷貝數(shù)值在102copies/μl以下。對比例1、將gar對應(yīng)的引物改成如下引物對：上游引物gar-f:actaggctaactacctggtat，下游引物gar-r:tacccttacttgtagagtctg。其余等同于實施例4。試驗結(jié)果為，對tgev、gar、gcr、pedv和pcv2五種病毒的最低檢出量分別為50、50、50、5和5copies。對比例2、將pedv對應(yīng)的引物改成如下引物對：上游引物pedv-f:gatactggaatgagcaaattc，下游引物pedv-r:tcggcgtgaggtcctgttcc。其余等同于實施例4。試驗結(jié)果為，對tgev、gar、gcr、pedv和pcv2五種病毒的最低檢出量分別為5、50、50、50和50copies。對比例3、將tgev對應(yīng)的引物改成如下引物對：上游引物tgev-f:tgttaggtgattattttcctact，下游引物tgev-r:aatgctttaagattttccagtgtaa。其余等同于實施例4。試驗結(jié)果為，對tgev、gar、gcr、pedv和pcv2五種病毒的最低檢出量分別為500、500、50、50和50copies。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。<110>浙江理工大學(xué)<120>五種豬腹瀉病毒多重實時熒光定量pcr快速診斷試劑盒及應(yīng)用<160>10<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物pedv-f<400>1ggcggatactggaatgagcaa21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物pedv-r<400>2ggtcggcgtgaggtcctgtt20<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物tgev-f<400>3atggtgttaggtgattattttcc23<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物tgev-r<400>4aatacaatgctttaagattttcca24<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物gar-f<400>5tgaagtgaggaccaggctaa20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物gar-r<400>6acgaaatcacacccttacttg21<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物gcr-f<400>7tgttgcatccgtgaagagaatggt24<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物gcr-r<400>8gcattagcccctacgcaagc20<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物pcv2-f<400>9atccgaaggtgcgggaga18<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物pcv2-r<400>10tgacgtatccaaggaggcg19當(dāng)前第1頁12