本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種探針，尤其涉及一種用于人源性manf基因檢測的地高辛探針及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)細(xì)胞存活、生長、分化有重要作用，因而被用于神經(jīng)保護(hù)、再生及功能修復(fù)的研究。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalicastropcyte-derivedneurotrophicfactor，manf)是于2003年在體外傳代培養(yǎng)的大鼠中腦i型星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中首次分離到的，分子量為20kda，屬于保守性的manf蛋白家族。該蛋白是一種分泌性蛋白，主要在神經(jīng)元中表達(dá)，而膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少。研究表明腦缺血損傷和神經(jīng)細(xì)胞中多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可上調(diào)manf的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)manf能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖，并能對抗多種刺激引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示manf蛋白對6-ohda引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有預(yù)防和治療作用。由于manf蛋白對神經(jīng)元損傷具有保護(hù)和治療作用，許多研究將其應(yīng)用于治療神經(jīng)退行性疾病，以阻止病程的發(fā)展加快疾病的恢復(fù)。帕金森病(parkinsondisease,pd)是一種典型的神經(jīng)退行性疾病，其主要的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,da)能神經(jīng)元的變性死亡，目前已有不少研究者采用manf蛋白對pd動物模型進(jìn)行治療的研究。
manf用于臨床治療帕金森病的主要障礙之一是血腦屏障。研究證明，分子質(zhì)量小于500da的親脂性小分子才能順利通過血腦屏障，manf作為大分子蛋白，無法透過血腦屏障，立體定向腦內(nèi)注射又會導(dǎo)致手術(shù)相關(guān)損傷無法重復(fù)進(jìn)行，限制了其應(yīng)用于臨床的可能性。腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,aav)是微小病毒科(parvoviridae)家族的成員之一。作為一種基因?qū)胂到y(tǒng)，aav病毒載體具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，能介導(dǎo)基因的長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，例如一項(xiàng)研究帕金森發(fā)明機(jī)制的模型中，通過對大鼠 模型腦內(nèi)黑質(zhì)部位立體定向注射可表達(dá)α-突觸核蛋白的重組aav病毒研究該蛋白的多巴胺能神經(jīng)元損傷機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦中可持續(xù)表達(dá)α-突觸核蛋白，并且大鼠表現(xiàn)出多巴胺能神經(jīng)元功能損傷的行為特征，說明重組aav病毒可有效介導(dǎo)有功能活性的α-突觸核蛋白在腦內(nèi)的表達(dá)。因此aav病毒在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體內(nèi)和體外研究中，受到越來越多的關(guān)注和重視。
重組aav病毒或其他重組病毒載體在實(shí)際應(yīng)用中往往涉及到病毒滴度的確定問題，根據(jù)所包裝的重組病毒中目的基因的含量確定重組病毒滴度，可有效避免空殼病毒蛋白組分的干擾，因此對含有manf基因的重組病毒的滴度測定可通過manf基因的定量檢測來確定。目前針對manf基因定量的檢測方法主要是熒光定量pcr法，該方法需要特定的儀器，實(shí)驗(yàn)要求高。斑點(diǎn)雜交是基因定量檢測的一種可靠方法，可通過特異性探針的設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高。該方法原理是：具有同源性的雜交探針與目的基因在一定條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)原則雜交形成雙鏈，通過對探針顯影檢測到雜交信號。此種方法具有較高的檢測特異性，目前尚未有針對人源性manf基因檢測的雜交探針。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，提出了一種高效的用于人源性manf基因檢測的特異性地高辛探針及其方法。
為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種用于人源性manf基因檢測的地高辛探針，其特征在于，所述的用于人源性manf基因檢測的地高辛探針序列如seqno：1所示。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及上述的用于人源性manf基因檢測的地高辛探針在病毒滴度檢測方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明第三個(gè)方面涉及一種斑點(diǎn)雜交檢測方法，該斑點(diǎn)雜交檢測方法包括上述所述的地高辛探針，該斑點(diǎn)雜交檢測方法為dna斑點(diǎn)雜交檢測方法，檢測方法包括以下步驟：
步驟1：標(biāo)準(zhǔn)品和樣品dna變性后分別點(diǎn)加在硝酸纖維素膜的表面；
步驟2：將步驟1中處理得到的硝酸纖維素膜放入雜交緩沖液中進(jìn)行預(yù)雜交；
步驟3：將權(quán)利要求1所述的地高辛探針變性后加入到雜交緩沖液中形成探針雜交液，往步驟2處理得到的硝酸纖維素膜上加入探針雜交液，然后溫和振蕩孵育24小時(shí)；
步驟4：將步驟3處理得到的硝酸纖維素膜用洗滌液進(jìn)行洗滌；
步驟5：將步驟4處理得到的硝酸纖維素膜進(jìn)行免疫檢測。
優(yōu)選地，上述的硝酸纖維素膜是帶正電荷的尼龍膜。
優(yōu)選地，上述的步驟1中的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品dna變性條件為：在95℃下，變性5分鐘。
優(yōu)選地，上述的步驟2中的雜交緩沖液是digeasyhyb緩沖液。
優(yōu)選地，上述的步驟4中免疫檢測的化學(xué)顯色物是cspd。
本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及上述斑點(diǎn)雜交檢測方法在病毒滴度檢測方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
1)特異性強(qiáng)
本發(fā)明開創(chuàng)性的設(shè)計(jì)了人源性manf基因檢測的地高辛探針，國內(nèi)尚屬首次，該探針特異性強(qiáng)。
2)檢測靈敏度高
與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明將探針和斑點(diǎn)雜交結(jié)合起來，既能確保檢測的特異性，也能顯著提高檢測靈敏度。
3)操作方便簡單
本發(fā)明操作方便簡單，為manf相關(guān)重組病毒滴度的測定提供一種更加可靠
的檢測方法，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供了便利。
附圖說明
圖1為raav-manf病毒的滴度測定結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā) 明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1
本實(shí)施例涉及一種用斑點(diǎn)雜交來測定病毒滴度的方法，包括以下步驟：
一、raav8-manf病毒dna提取
采用商品化試劑盒提取病毒dna，并測定濃度，控制提取質(zhì)量od260/280為1.8。本實(shí)施例用天根病毒dna提取試劑盒，具體操作按說明書進(jìn)行。
二、斑點(diǎn)雜交
本實(shí)施例用羅氏dighighprimedna標(biāo)記及雜交檢測試劑盒ii。具體操作如下：
1.dna固定
(1)標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：將線性化的人源性manf重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍梯度稀釋；
(2)樣品預(yù)處理：將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品dna置于95℃變性5分鐘，再放置冰上冷卻；
(3)點(diǎn)樣：取各dna樣品1ul，分別點(diǎn)于帶正電尼龍膜的粗糙面；
(4)紫外交聯(lián)：尼龍膜點(diǎn)樣面朝上，計(jì)量70000微焦耳/cm2紫外交聯(lián)。
2.雜交
(1)預(yù)雜交：將適量體積的digeasyhyb緩沖液(約5ml)預(yù)熱到雜交溫度(41℃)。將dna點(diǎn)樣并固定后的膜放入雜交緩沖液，在雜交管中溫和振蕩30分鐘，進(jìn)行預(yù)雜交。
(2)雜交液的準(zhǔn)備：取適量地高辛標(biāo)記的dna探針(在雜交液中濃度約為25ng/ml),將探針放入沸水浴中變性,5分鐘后立即置于冰上或冰水浴中冷卻。將變性的地高辛標(biāo)記探針加入到預(yù)熱的digeasyhyb緩沖液(5ml，41℃)中，充分混勻但要避免產(chǎn)生氣泡。
(3)雜交：倒出預(yù)雜交液，在膜上加入探針雜交液。溫和振蕩孵育24小時(shí)(41℃)。
3.膜洗滌
用足量的2×ssc，0.1％sds在15～25℃連續(xù)振蕩洗膜兩次，每次5分鐘。在65℃，用足量的0.5×ssc，0.1％sds(預(yù)熱到洗滌溫度)連續(xù)振蕩洗膜兩次， 每次15分鐘。
4.免疫檢測
(1)簡單洗膜：在雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌步驟后，將膜簡單地用洗滌緩沖液漂洗1-5分鐘。
(2)封閉和抗體孵育：膜在10ml封閉溶液工作液中41℃孵育45分鐘。然后在10ml抗體溶液工作液中41℃孵育45分鐘。
(3)膜洗滌：用20ml洗滌緩沖液洗膜兩次，每次15分鐘。
(4)熒光反應(yīng)：膜在20ml檢測緩沖液中平衡2-5分鐘。然后將dna點(diǎn)樣的膜面朝上，置于折疊夾(或雜交袋)中，向膜上加入1mlcspdready-to-use，立即蓋上封蓋使cspd平均分布在膜表面，并防止氣泡的產(chǎn)生。25℃孵育60min。再將濕膜置于37℃中孵育10min，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
(5)圖像曝光：在15～25℃條件下，用x光片曝光30分鐘，顯影定影，得到圖像。
本實(shí)例中所用溶液配方詳見雜交試劑盒說明書。
三、圖像結(jié)果分析
將樣品點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品顯影強(qiáng)度作比對，可得出病毒滴度。檢測結(jié)果表明病毒的滴度約為108拷貝/μl，結(jié)果如圖1所示。
從實(shí)施例可以得出本發(fā)明設(shè)計(jì)的地高辛探針，能用于相關(guān)的病毒滴度檢測，檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供了極大便利。
以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。