本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及基于火龍果轉(zhuǎn)錄組測序序列而開發(fā)的ssr引物、pcr擴增及其應用?；谵D(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的多對ssr標記引物，專用于從dna水平對火龍果種質(zhì)的快速鑒定及親緣關系分析。

背景技術：

火龍果(hylocereusspp.)屬于仙人掌科(cactaceae)量天尺屬(hylocereus)和蛇鞭柱屬(seleniereus)，是近年來被廣泛關注的一種新興熱帶、亞熱帶水果?；瘕埞m宜種植范圍廣、抗病蟲害能力強、產(chǎn)量高、效益好和市場風險小，因此火龍果種植被視為一個有良好市場前景和經(jīng)濟效益的農(nóng)業(yè)開發(fā)項目?；瘕埞N質(zhì)的準確、高效鑒定和親緣關系分析，對種質(zhì)的知識產(chǎn)權保護、開發(fā)和利用具有重要現(xiàn)實意義。

目前，火龍果遺傳背景并不清晰，這給火龍果種質(zhì)鑒定、雜交育種、新種質(zhì)挖掘等帶來了很大困難，隨著分子生物學技術的發(fā)展，rapd、aflp、issr、srap等分子標記技術已被用于火龍果種質(zhì)鑒定、親緣關系分析和遺傳圖譜構建，但這些多為顯性標記，不能區(qū)分純合體和雜合體，且這些分子標記覆蓋火龍果基因組比例較小，標記密度較低。

ssr分子標記廣泛應用于評價種質(zhì)資源、分析遺傳多態(tài)性和構建遺傳圖譜研究，具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，est-ssr分子標記基于基因編碼區(qū)開發(fā)，可直接反映基因的表達信息，并具有較高的保守性和通用性。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服火龍果現(xiàn)有分子標記多為顯性標記，不能區(qū)分純合體和雜合體，且覆蓋火龍果基因組比例較小，標記密度較低等缺點，本發(fā)明旨在提供多態(tài)性檢出率高、分辨率更好、共顯性、穩(wěn)定可靠、簡單高效的分子標記鑒定方法。該方法可直接用于火龍果種質(zhì)鑒定、親緣關系分析和遺傳圖譜構建，為種質(zhì)知識產(chǎn)權保護和遺傳改良提供更好的分析工具。本發(fā)明需要解決的關鍵技術是est-ssr標記引物的獲得，以及pcr擴增體系的優(yōu)化。

為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

本發(fā)明的est-ssr標記引物為如下表的1對或任意幾對：

本發(fā)明的方法包括如下步驟：

1.取新采集的或-80℃下保存的幼嫩莖尖，利用天根dnasecureplantkit試劑盒提取基因組dna；

2.根據(jù)火龍果轉(zhuǎn)錄組測序的序列，設計合成125對est-ssr引物，并進行pcr擴增體系優(yōu)化：

1)pcr反應體系為(10μl體系)：10-50ng的模板dna2μl，正、反向引物(10μm)0.25μl，5μlmix及適量ddh2o(2.5μl)。其中，mix含0.1u/μltaqpolymerase，500μmdntp，20mmtris-hcl(ph8.3)，100mmkcl，3mmmgcl2，以及其它穩(wěn)定劑和增強劑，這里的其它穩(wěn)定劑和增強劑采用現(xiàn)有的常規(guī)技術的穩(wěn)定劑和增強劑即可。

pcr反應程序為：

2)隨機選用幾個代表性種質(zhì)的dna，先進行pcr反應，再通過2％瓊脂糖凝膠電泳，對設計引物進行est-ssr位點數(shù)的初篩，篩選出譜帶清晰的引物。

3)將初篩獲得的引物，對8個代表性種質(zhì)的dna進行pcr擴增，然后進行10％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳，復選出譜帶清晰、多態(tài)性豐富的引物。

4)用初篩、復篩獲得的多態(tài)性較好引物，對所有供試種質(zhì)進行ssr分子標記分析，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無和大小來判定結(jié)果。

本發(fā)明采用的火龍果ssr標記引物，來自于本發(fā)明基于火龍果轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)的est-ssr引物。轉(zhuǎn)錄組測序樣本采自貴州省果樹科學研究所資源圃紫紅龍幼嫩莖尖，液氮速凍后送百邁克公司(北京)進行轉(zhuǎn)錄組測序，總獲108127條unigenes。然后使用misa程序進行ssr位點搜索，搜索標準為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重復次數(shù)為10、6、5、5、5、和5。接著用primer3.0引物批量設計程序?qū)衧sr位點的unigene序列設計引物，并且ssr位點側(cè)翼序列長度大于50bp。引物設計主要參數(shù)為：(1)退火溫度(tm)在55-63℃之間。(2)pcr產(chǎn)物大小在100-300bp；引物長度在18-24bp之間；盡量避免引物二級結(jié)構如發(fā)卡結(jié)構、二聚體、錯配、引物二聚體的出現(xiàn)。對批量設計的ssr引物對在unigen庫中進行ssr引物的blast驗證。最后隨機選取125對est-ssr引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

本發(fā)明方法適用于火龍果種質(zhì)快速可靠的分子檢測和鑒定，具有重要的實用價值，與其它方法相比，本發(fā)明具有以下的技術優(yōu)勢：

1、操作簡便快速：本發(fā)明利用基于火龍果轉(zhuǎn)錄組測序的序列設計ssr引物，對樣本進行pcr擴增和常規(guī)的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳后即可判斷結(jié)果，無需對擴增的產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切。

2、pcr體系已優(yōu)化且聚丙烯酰胺變性凝膠的制作技術成熟：在本發(fā)明中，優(yōu)化的pcr體系更適合于火龍果est-ssr標記的擴增。而聚丙烯酰胺變性凝膠的制作技術成熟，已形成一套完整的體系，效果較好。

3、檢測結(jié)果靈敏度高：對待檢樣品僅需提供模板10-50ng，即可準確鑒定其所屬種質(zhì)；

4、結(jié)果高度準確、可靠、重復性好：本發(fā)明已經(jīng)對火龍果不同種質(zhì)dna樣本進行了檢測，經(jīng)過多次重復檢測，檢測準確率100％，為檢測結(jié)果提供了高度的可靠性；

5、本發(fā)明中開發(fā)的est-ssr引物獲得的分子標記，在火龍果基因組中分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性、清晰穩(wěn)定、分辨率高，可有效用于火龍果的種質(zhì)鑒定、親緣關系分析及遺傳圖譜構建等工作，在知識產(chǎn)權保護和遺傳育種上具有重要實際意義；

6、取材方便：火龍果莖的采集不受季節(jié)、地點的限制。

附圖說明

圖1是2對est-ssr引物擴增后2％瓊脂糖凝膠電泳初篩檢測圖，圖中：(1-4分別表示種質(zhì)r3、r4、r5、r7；5-8分別表示種質(zhì)b6、f18、紅4、b5；m為dnamarker)；

圖2是2對est-ssr引物擴增后10％變性page凝膠電泳復篩檢測圖，圖中：(1-8分別表示種質(zhì)r3、r4、r5、r7、b6、f18、紅4、b5；m為dnamarker)；

圖3是引物c30929對紅肉、白肉、黃肉共70個火龍果種質(zhì)檢測圖，圖中：(m為d2000marker，圖中泳道編號與表2供試種質(zhì)編號對應)。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1：

以本發(fā)明中的est-ssr引物，鑒定70份火龍果種質(zhì)，包括50份紅皮紅肉型、10份紅皮白肉型和10份紅皮粉紅肉型，以引物對c30929為例，可區(qū)分供試材料。

1.est-ssr引物的設計及合成

首先對測序得到的序列進行前處理，得到高質(zhì)量無冗余的est序列，利用misa軟件在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中搜索ssr位點，搜索標準為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重復次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5，接著用primer3.0引物批量設計程序?qū)衧sr位點的unigene序列設計引物，并且ssr位點序列長度在18-24bp之間。其中，引物設計的主要參數(shù)為：退火溫度(tm)在54-63℃之間，60℃最佳；pcr產(chǎn)物大小為100-300bp；gc含量在40％-60％之間，50％最佳。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。設計合成的c30929正、反向引物相關信息如表1所示。

表1引物c13719相關信息

2.火龍果種質(zhì)及其基因組dna提取

以70份火龍果種質(zhì)為供試材料，見表2所示。

采用天根dnasecureplantkit(dp320)試劑盒提取基因組dna，利用2％瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測定儀檢測其質(zhì)量和濃度，并用te緩沖液將其稀釋至約20mg.l^-1。

表270份火龍果供試種質(zhì)的名稱及主要性狀

3.pcr擴增

優(yōu)化反應體系為(10μl)：40ng的模板dna，各0.25μl正、反向引物(10μm)，5μlmix及適量ddh2o。其中mix含0.1u/μltaqpolymerase，500μmdntp，20mmtris-hcl(ph8.3)，100mmkcl，3mmmgcl2，以及其它穩(wěn)定劑和增強劑。

優(yōu)化的pcr程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，復性30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸8min，4℃保存。

4.est-ssr引物初篩

將pcr反應產(chǎn)物在含有goldviewⅰ的2％瓊脂糖凝膠中，以5v/cm電壓電泳適當時間，然后于凝膠分析儀中觀察并拍照保存，篩選出條帶清晰的引物，如圖1所示。

5.est-ssr引物多態(tài)性位點復篩

使用初篩引物對樣本進行pcr擴增，使用10％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，觀察其多態(tài)性，如圖2所示。

1)裝板：將玻璃板洗凈晾干后裝入u型硅橡膠框的凹形槽中，有磨砂的玻璃面向內(nèi)，將玻璃板稍微傾斜置于試驗臺上。

2)封膠：用1％的瓊脂密封膠室下端玻璃板與橡膠框之間的縫隙。

3)灌膠：50ml(可灌兩塊板)sds-聚丙烯酰胺凝膠的配方如表3，將配好的膠倒入三角瓶中，充分混勻，待氣泡消失后，沿玻璃板凹口快速均勻地注入膠室中，并插入合適的梳子，將玻璃板平置于試驗臺上，待膠凝固。

表310％聚丙烯酰胺變性凝膠組成成分及添加成分的順序

4)預電泳：拔出梳子，用注射器加ddh2o多次沖洗加樣孔，將凝膠板固定在垂直電泳槽內(nèi)，向槽內(nèi)加入1×tbe緩沖液。接上電極，打開電源，調(diào)試工作環(huán)境為電壓90v，預電泳10min左右。

5)變性：預電泳期間10ulpcr擴增產(chǎn)物中加5μlloadingbuffer，混勻，pcr儀97℃變性10min，4℃保存。

6)點樣：用注射器加1×tbe電解液再次沖洗加樣孔，邊沖洗邊點樣，pcr產(chǎn)物上樣量為1.5μl左右，然后打開電源，調(diào)試工作環(huán)境為電壓150v，電泳3.5小時。

7)電泳結(jié)束后，切斷電源，拔出導線，回收緩沖液，卸下玻璃板；小心取下凝膠，放置于有ddh2o的托盤中沖洗一或兩次，銀染檢測。

8)銀染檢測

(1)固定(10％冰乙酸)：50ml冰乙酸加ddh2o定容至500ml，混勻，倒入裝有凝膠的托盤中于搖床上均勻搖動20min，搖床轉(zhuǎn)速設置為45r/min，之后ddh2o漂洗凝膠兩次(速度快，約5s)。

(2)染色(0.1％agno3)：稱取0.5gagno3用ddh2o定容至500ml，染色時現(xiàn)加入3ml37％的甲醛，混勻，倒入裝有凝膠的托盤中于搖床上避光均勻搖動約15min，搖床轉(zhuǎn)速設置為45r/min，然后ddh2o漂洗2次，時間不超過5s。

(3)顯色：稱取10gnaoh，ddh2o定容至500ml，染色時加入2ml37％甲醛，混勻，倒入裝有凝膠的托盤中于搖床上均勻搖動顯影，搖床轉(zhuǎn)速設置為45r/min，等到譜帶清晰時停止。

(4)ddh2o漂洗凝膠1-2次，盡量不超過5s，立即用數(shù)碼相機拍照記錄。

6.供試種質(zhì)的est-ssr分析

用復篩出的多態(tài)性較好的est-ssr引物(如c30929)，對供試材料進行pcr擴增及變性page凝膠電泳、銀染，結(jié)果如圖3。凝膠制備和染色方法見步驟5。

7.數(shù)據(jù)處理及分析

每種est-ssr引物重復擴增3次，絕大部分帶型可重復，極少數(shù)不能重復的譜帶統(tǒng)計時忽略不計。采用人工讀帶的方式，對擴增結(jié)果進行統(tǒng)計分析，將譜帶按“引物號-片段長度”進行記錄，并按有無分別賦值1和0，建立數(shù)據(jù)庫。

8.指紋圖譜構建

不同引物產(chǎn)生的譜帶數(shù)及多態(tài)性存在差異，根據(jù)用最少的引物組合鑒別盡量多種質(zhì)的原則，建立火龍果種質(zhì)指紋圖譜，且所有供試材料的特異性各不相同，達到種質(zhì)鑒定的目的。

當然，以上只是本發(fā)明的具體應用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發(fā)明所要求的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>貴州大學

<120>利用轉(zhuǎn)錄組測序的ssr分子標記鑒定火龍果種質(zhì)的方法

<130>nm:

<160>20

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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