本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，具體涉及一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法。
背景技術：
：微衛(wèi)星dna是真核生物基因組中短的串聯(lián)重復序列(zietkiewicze,rafalskia,labudad.genomefingerprintingbysimplesequencerepeat(ssr)-anchoredpolymerasechainreactionamplification.genomics,1994,20:176-183)。由于微衛(wèi)星位點數(shù)量多，在基因組中均勻分布，共顯性遺傳且易于檢測，微衛(wèi)星dna得到了廣泛的應用(wanqh,wuh,fujiharat,etal.whichgeneticmarkerforwhichconservationgeneticsissue.electrophoresis,2004,25:2165-2176)。大熊貓的微衛(wèi)星已用來解決親子鑒定、遺傳多樣性、遺傳結構等問題(lids,cuihm,wangcd,etal.afastandeffectivemethodtoperformpaternitytestingforwolonggiantpandas.chinesesciencebulletin,2011,56:2559-2564；zhuy,wanqh,yub,etal.patternsofgeneticdifferentiationatmhcclassigenesandmicrosatellitesidentifyconservationunitsinthegiantpanda.bmcevolutionarybiology,2013,13:227.)。但是，上述遺傳學實驗均需要采用多個微衛(wèi)星位點，研究者需要花費大量的時間和實驗成本。更重要的是，要消耗較多的dna樣本。然而，對于大熊貓這種瀕危動物來說，dna樣本十分珍貴。故發(fā)明一種對樣本量要求少、成本低、高效的微衛(wèi)星實驗體系對于大熊貓的保護遺傳學研究來說具有重要的意義。目前，其他物種的微衛(wèi)星遺傳學研究中采用多重pcr以解決上述問題。微衛(wèi)星多重pcr指在一個pcr體系中加入多對微衛(wèi)星特異性引物，對同一個模板的不同區(qū)域進行同時擴增的pcr技術(chamberlainjs,gibbsra,ranierpn,etal.deletionscreeningoftheduchennemusculardystrophylocusviamultiplexdnaamplification.nucleicacidsresearch,1988,16:11141-11156.)。微衛(wèi)星多重pcr可以同時擴增多個目的片段，能夠達到節(jié)約實驗樣品、實驗成本、提高實驗效率的目的。微衛(wèi)星多重pcr的核心內(nèi)容在于如何設計和優(yōu)化引物組合，使得引物之間不存在相互作用、不產(chǎn)生非特異擴增、不使擴增產(chǎn)物重疊。盡管微衛(wèi)星多重pcr技術已在其他物種中廣泛得到應用(文萍,趙建,李偉等.基于微衛(wèi)星多重pcr技術的黃喉擬水龜親子鑒定[j].水生生物學報,2015,(06):1134-1141.；李佳凱,王志勇,韋信鍵等.大黃魚微衛(wèi)星多重pcr體系的建立及其應用[j].水產(chǎn)學報,2014,(04):470-475.)，但是迄今為止，大熊貓微衛(wèi)星多重pcr體系仍未建立起來。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明是克服目前大熊貓微衛(wèi)星研究中的技術不足之處，提供一套高效的大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系的檢測方法。本發(fā)明一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法，大致包括1)提取基因組dna；2)評估原始引物(單對引物)擴增產(chǎn)物的片段大??；3)設計并優(yōu)化三重pcr引物組合；4)三重pcr擴增及條件優(yōu)化；5)基因分型效果檢測并確定最終組合方式。具體包括以下步驟：a、dna樣品提取：采用axygen血液基因組提取試劑盒對大熊貓血液基因組dna進行提??；b、評估引物的擴增產(chǎn)物的大?。簭奈墨I(huangj,liyz,dulm,etal.2015.genome-widesurveyandanalysisofmicrosatellitesingiantpanda(ailuropodamelanoleuca),withafocusontheapplicationsofanovelmicrosatellitemarkersystem.bmcgenomics,16:article61.)中選擇15對擴增效果好、分型效果佳、多態(tài)性高的大熊貓微衛(wèi)星引物，分別為gpz6，gpz47，gpz20，gpl47，gpl29，gpl60，gpz54，gpl8，gpl31，gpl44，gpz51，gpl28，gpl53，gpy20，gpy5，在上述15對引物上游的5’端加入接頭序列5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’，引物合成后，分別對大熊貓dna進行單重pcr擴增，對擴增后的pcr產(chǎn)物按照150～200bp，200～250bp，250bp以上三個不同區(qū)間進行初步分組；c、引物優(yōu)化：采用primerpremier6.0重新設計引物使得擴增產(chǎn)物長度符合要求，且引物組合需使得三個片段區(qū)域各包含5對引物；d、引物組合評估：利用primerpremier6.0進行引物間的評估，選擇兩兩引物之間δdg<4.0的引物組合備用；e、三重pcr體系：對d步驟選擇的三重pcr組合均采用10μlpcr體系；f、三重pcr擴增條件優(yōu)化：采用降落pcr程序?qū)嵤┤豴cr；g、基因分型：取1ulpcr產(chǎn)物在7％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，激光掃描檢測目的產(chǎn)物。上述一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法，其中b步驟中擴增體系為：1μl含mg2+的10xbuffer，0.8μl2.5mm的dntp，引物的上下游10mmol/l各加0.3μl,0.3μl1pmol/μl的5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’(μ13熒光引物)，0.1μl5u/μl的rtaq酶，10～20ng基因組dna，補加滅菌超純水至體系為10μl。上述一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法，其中b步驟中擴增的條件為：95℃總變性5分鐘，95℃變性30秒，退火溫度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后72℃總延伸5分鐘。上述一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法，其中e步驟中所述三重pcr體系為：1μl含mg2+的10xbuffer，0.8μl2.5mm的dntp，三對引物的上下游10mmol/l各加0.1μl，0.3μl1pmol/μl的5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’(μ13熒光引物)，0.1μl5u/μl的rtaq酶，10～20ng基因組dna，補加滅菌超純水至體系為10μl。上述一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法，其中f步驟中所述降落pcr分為四個階段，第一個階段95℃變性5分鐘；第二個階段，95℃變性30秒，62.5℃退火30秒，72℃延伸30秒，共15個循環(huán)；第三個階段，95℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20個循環(huán)；第四個階段，72℃延伸5分鐘。進一步的，上述一套大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法，其中所述第二個階段退火溫度每循環(huán)一次，減少0.7℃。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr體系檢測方法簡單，與大熊貓常規(guī)的微衛(wèi)星pcr體系相比，節(jié)約66.7％的dna樣本、66.7％的成本、效率提高了200％。本發(fā)明可在大熊貓的親子鑒定、種群遺傳多樣性和遺傳結構的評估方面進行推廣。附圖說明圖1大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr分型圖(第一組)，不同泳道代表不同的個體；圖2大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr分型圖(第二組)，不同泳道代表不同的個體；圖3大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr分型圖(第三組)，不同泳道代表不同的個體；圖4大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr分型圖(第四組)，不同泳道代表不同的個體；圖5大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr分型圖(第五組)，不同泳道代表不同的個體；圖6都江堰大熊貓基地種群微衛(wèi)星三重pcr基因部分分型結果。具體實施方式下面結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。實施例1本實例是利用在中國大熊貓保護研究中心都江堰大熊貓基地采集的大熊貓樣品進行三重pcr體系檢測方法的建立。具體方法如下：(1)dna樣品提?。?4個血液樣本由中國大熊貓保護研究中心提供，按照axygen血液基因組提取試劑盒的說明進行大熊貓血液基因組dna提取。(2)評估引物的擴增產(chǎn)物的大小。從文獻(huangj,liyz,dulm,etal.2015.genome-widesurveyandanalysisofmicrosatellitesingiantpanda(ailuropodamelanoleuca),withafocusontheapplicationsofanovelmicrosatellitemarkersystem.bmcgenomics,16:article61.)中找出擴增效果好、分型效果佳、多態(tài)性高的15對大熊貓微衛(wèi)星引物，gpz6,gpz47,gpz20,gpl47,gpl29,gpl60,gpz54,gpl8,gpl31,gpl44,gpz51,gpl28,gpl53,gpy20,gpy5.在上述的15對引物上游的5’端加入接頭序列(5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’)，引物合成后分別對(1)步驟中的dna樣本進行擴增；擴增體系如表1；擴增條件：95℃總變性5分鐘，95℃變性30秒，退火溫度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)。最后72℃總延伸5分鐘。取pcr產(chǎn)物1μl進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。上述pcr產(chǎn)物按照150-200bp,200-250bp,250bp以上三個不同區(qū)間進行初步分組。表1單重pcr體系組成體系體積(μl)10xbuffer(mg2+)1.0dntp(2.5mm)0.8標記上游引物(10mmol/l)0.1未標記下游引物(10mmol/l)0.1m13熒光引物(1pmol/μl)0.3rtaq(5u/μl)0.1gdna10～20ng無菌水補加到10μl(3)引物優(yōu)化：引物組合需使得三個片段區(qū)域各包含5對引物。gpz47,gpy20,gpy5,gpl53,gpl28,gpl44與部分引物重疊，用primerpremier6.0重新設計引物使得擴增產(chǎn)物長度符合要求。優(yōu)化后的引物分組如表2。表215對引物擴增片段相對位置相對位置引物上gpz20、gpl44*、gpy5*、gpl53*、gpy20*中gpz47*、gpz6、gpl60、gpl8、gpl28*下gpl47、gpz54、gpl31、gpz51、gpl29注：*表示此引物進行片段大小的優(yōu)化。(4)引物組合評估：利用primerpremier6.0進行引物間的評估。三重pcr引物組合要求每兩對引物之間的δdg<4.0。故選擇兩兩引物之間δdg<4.0的引物組合備用(引物之間不易形成引物二聚體和發(fā)卡結構)。滿足條件的三重pcr組合共有23組(見表3所示)。表3兩兩引物間δdg<4.0的三重pcr引物組合組號引物名稱a引物名稱b引物名稱c1gpl29gpz47*gpy20*2gpl29gpl8gpy203gpz51gpz6gpz204gpz51gpz6gpy5*5gpz51gpz6gpl536gpz51gpl28gpy57gpz51gpl28gpz208gpl31gpl60gpl53*9gpl31gpl60gpl4410gpl31gpl60gpz2011gpz54gpl8gpy512gpz54gpl8gpz2013gpz54gpl28gpy514gpz54gpl28gpz2015gpz54gpz47gpz2016gpz54gpz47gpy517gpl47gpl28*gpl44*18gpl47gpl28gpy519gpl47gpl28gpz2020gpl47gpl8gpl4421gpl47gpl8gpy522gpl47gpl8gpz2023gpl47gpz6gpl44(5)三重pcr體系：上述23組三重pcr組合均采用10μlpcr體系(見表4)。μ13熒光引物的序列為5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’。表4三重pcr體系組成體系體積(μl)10xbuffer(mg2+)1.0dntp(2.5mm)0.8引物1標記上游(10mmol/l)0.1引物1未標記下游(10mmol/l)0.1引物2標記上游(10mmol/l)0.1引物2未標記下游(10mmol/l)0.1引物3標記上游(10mmol/l)0.1引物3未標記下游(10mmol/l)0.1m13熒光引物(1pmol/μl)0.3rtaq(5u/μl)0.1gdna10～20ng無菌水補加到10μl(6)三重pcr擴增條件優(yōu)化：由于不同的引物退火溫度有一定的差異，普通的pcr擴增程序無法同時滿足三對引物的擴增條件。本發(fā)明采用降落pcr程序?qū)嵤┤豴cr。降落pcr的退火溫度在一定范圍內(nèi)變化，可以達到多對引物的退火溫度。本發(fā)明的降落pcr分為四個階段，第一個階段95℃變性5分鐘；第二個階段，95℃變性30秒，62.5℃退火30秒(退火溫度每個循環(huán)減少0.7℃)，72℃延伸30秒，共15個循環(huán)；第三個階段，95℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20個循環(huán)；第四個階段，72℃延伸5分鐘。(7)基因分型：取1ul三重pcr產(chǎn)物在7％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。1000v電泳2.5小時，激光掃描檢測目的產(chǎn)物。舍棄擴增效果不佳、有非特異性擴增、鬼影帶嚴重、帶型不易讀取、擴增片段大小相近的組合。本發(fā)明所述的5組三重pcr引物組合及引物序列如表5所示，5組大熊貓微衛(wèi)星位點的三重pcr分型電泳圖依次見圖1～圖5所示。由電泳結果可以看出，本發(fā)明中的5組三重pcr引物組合擴增效果佳、無非特性擴增、帶型容易讀取。都江堰大熊貓部分個體的三重pcr分型電泳圖如圖6。表5大熊貓微衛(wèi)星三重pcr引物組合如果采用單對引物逐一擴增的方法，需要消耗2100ng的dna，105個單位的r-taq，進行15個pcr擴增。而采用本發(fā)明的方法，本實例只消耗了700ng的dna，35個單位的r-taq，僅進行5個pcr擴增。相較于前者，節(jié)約66.7％的dna樣本、66.7％的成本、效率提高了200％。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權利要求的保護范圍內(nèi)。當前第1頁12