本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種葡萄斑點(diǎn)病毒熒光定量PCR檢測的專用引物和方法。

背景技術(shù)：

葡萄是一種及具經(jīng)濟(jì)價值和營養(yǎng)價值的水果，近年來隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，病毒病已成為限制其產(chǎn)量和質(zhì)量提高的重要因素。葡萄斑點(diǎn)病為世界性分布的病毒病，在我國僅見遼寧、山東、新疆等地有該病的零星報道。葡萄斑點(diǎn)病毒(Grapevine fleck virus，GFkV)為蕪菁黃花葉病毒目(Tymovirus)成員，長期以來，葡萄斑點(diǎn)病毒的分類地位一直未能明確，隨著分子生物學(xué)和計算機(jī)技術(shù)逐步深入地滲透到葡萄斑點(diǎn)病毒的研究中，直到2002年6月經(jīng)國際病毒分類委員會批準(zhǔn)，在植物病毒分類中新增一個屬即斑點(diǎn)屬(Maculavirus)，并把GFkV作為該屬的模式種。GFkV于1966年被Vuittenez首次發(fā)現(xiàn)，隨后對其危害癥狀、寄主范圍和理化特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該病毒在栽培品種上潛伏侵染，在沙地葡萄和嫁接砧木上引起危害，可以引起寄主果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的降低，但是作為一種潛隱性病毒，其侵染寄主植物后沒有明顯的癥狀表現(xiàn)，給該病毒的早期診斷帶來較大的困難，目前，世界范圍內(nèi)只有該病毒的一條基因組序列和三條全長CP基因序列，由此可見對該病毒的研究是非常少的。與此同時，GFkV常與其他葡萄病毒伴隨發(fā)生，關(guān)于其病毒與病毒、病毒與植物互作機(jī)制的基礎(chǔ)研究也逐漸受到重視。因此，有必要建立一種高效、靈敏的對GFkV進(jìn)行定量檢測的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種葡萄斑點(diǎn)病毒熒光定量PCR檢測的專用引物和方法，該檢測方法可實(shí)現(xiàn)對供試葡萄樣品中GFkV基因組拷貝數(shù)的絕對定量。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種葡萄斑點(diǎn)病毒熒光定量PCR檢測的專用引物，包括引物GFkV23和引物GFkV24；其中，所述引物GFkV23的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物GFkV24的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還公開了一種葡萄斑點(diǎn)病毒熒光定量PCR檢測方法，通過PCR擴(kuò)增、克隆獲得陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，然后以已知濃度的目的基因作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測算出待測樣品中的病毒含量。

進(jìn)一步地，該方法包括以下步驟：

1)提取GFkV毒源材料的總RNA，用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為模板，以GFkV23和GFkV24為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，連接克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選并挑取含陽性克隆的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒得到陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

2)陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別梯度稀釋至10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL為模板，以GFkV23和GFkV24為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以Ct值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3)提取待測樣品的總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為模板，按照與步驟2)中完全相同的條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所得Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得到待測樣品中GFkV基因組RNA的含量。

進(jìn)一步地，在步驟1)中，所述PCR反應(yīng)體系為：2×Ex Taq Mix 12.5μL，10μM GFkV23和GFkV24引物各1.0μL，cDNA 2.0μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。

進(jìn)一步地，在步驟1)中，所述PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，35cycles；72℃10min。

進(jìn)一步地，在步驟2)中，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與濃度的換算方式按照如下公式：拷貝數(shù)＝濃度×10^-9×6.02×10²³/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，其中，拷貝數(shù)的單位為copy/μL，濃度的溫單位為ng/μL。

進(jìn)一步地，在步驟2)中，所述熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Green qPCR Mix 10.0μL，10μM GFkV23和GFkV24各1.4μL，模板1.0μL，雙蒸水補(bǔ)足至20μL。

進(jìn)一步地，在步驟2)中，所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃5s，60℃15s，72℃20s，read，40cycles；65℃to 94℃，0.5℃/10s，read。

與現(xiàn)有技術(shù)RT-PCR和ELISA兩種檢測方法相比，本發(fā)明創(chuàng)建的GFkV熒光定量PCR檢測方法可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)簡化了操作步驟，并節(jié)省了檢測時間；與RT-PCR相比，RT-PCR需要將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后在紫外凝膠系統(tǒng)下成像后才能看到檢測結(jié)果，肉眼無法直接看到，ELISA整個檢測過程下來需要2天。該有點(diǎn)主要是由于我們采用了與RT-PCR接近的常規(guī)分子操作單結(jié)合了熒光定量的分子特性使檢測結(jié)果直接在定量PCR儀上顯示。

2)但瓊脂糖凝膠成像需要在EB中染色，EB極易污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，對操作人員健康有不利影響；本優(yōu)點(diǎn)主要是由于我們采用了的應(yīng)該定量相關(guān)試劑無毒無害。

3)ELISA和RT-PCR只能對病毒進(jìn)行定性檢測，無法定量檢測，我們創(chuàng)建的方法可以實(shí)現(xiàn)對病毒的定量檢測。熒光定量PCR隨著反應(yīng)的進(jìn)行熒光的衰退實(shí)現(xiàn)對模板拷貝數(shù)的監(jiān)測，從而實(shí)現(xiàn)對檢測病毒的定量化。

4)本方法與目前最常用的分子檢測方法和血清學(xué)檢測方法相比極大的簡化了檢測步驟，節(jié)約了檢測時間；提高了檢測的靈敏度，增強(qiáng)了檢測效果；降低了實(shí)驗(yàn)危害，保護(hù)了實(shí)驗(yàn)操作者。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板擴(kuò)增獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2是本發(fā)明以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線；

圖3是本發(fā)明以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板擴(kuò)增的溶解曲線。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1

1.引物合成

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物GFkV23(5’-TTCCTGTGGTATGACATCACG-3’，如SEQ ID NO.1所示)和GFkV24(5’-CAGTGGGTTGGACGAAGGCT-3’，如SEQ ID NO.2所示)，用雙蒸水溶解至10μM備用。

2.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

2.1.感染GFkV的葡撻枝條樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所病毒課題組保存。使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN,DP140916)提取樣品總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。

2.2.使用Oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega，具體步驟如下：

70℃水浴5min，冰置5min，加入下列成分：

42℃反應(yīng)1h，95℃滅活5min，得到的cDNA；

2.3.以cDNA為模板，以GFkV23和GFkV24為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所使用的Ex Taq Mix購自康為世紀(jì)，反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃補(bǔ)充延伸10min。

2.4.PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中120V恒壓電泳15min，凝膠在EB染液中染色5min后用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像拍照；用潔凈刀片割下大小約為693bp的產(chǎn)物，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN,DP209)純化回收目標(biāo)產(chǎn)物，具體方法參照說明書；回收片段連接pGEM-T easy(Promega)克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(康為世紀(jì))，在含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆，具體方法參照相關(guān)說明書；經(jīng)PCR驗(yàn)證陽性的單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN，DP103)提取質(zhì)粒得到陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測定質(zhì)粒濃度。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

3.1.參照公式：拷貝數(shù)(copy/μL)＝(濃度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至10⁸copy/μL，再將10⁸copy/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL。

3.2.分別以各濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用Quant One Step RT-qPCR Kit(SYBR Green)試劑盒(TIANGEN，F(xiàn)P303)進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系如下：

使用Bio-Rad iQ^TM5實(shí)時熒光定量PCR儀按如下反應(yīng)程序進(jìn)行：94℃3min；94℃5s，60℃15s，72℃20s，read，40cycles；65℃to 94℃，0.5℃/10s，read。程序運(yùn)行結(jié)束后由軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝-3.156×log(X)+34.564，R²＝0.976。

實(shí)施例2待測植物材料的定量檢測

待測葡萄枝條樣品采自遼寧省葫蘆島市興城市，按照上述方法提取樣品總RNA，以O(shè)ligod(T)為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，GFkV23和GFkV24為引物，完全按照上述體系和程序進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到平均Ct值為24.30，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到待測樣品CVA拷貝數(shù)為1.79×10³copy/μL。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所

<120> 一種葡萄斑點(diǎn)病毒熒光定量PCR檢測的專用引物和方法

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttcctgtggt atgacatcac g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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