本發(fā)明涉及分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物及檢測方法。

背景技術(shù)：

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，它發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、潛伏期短，對人群尤其是兒童、老年人及機(jī)體免疫力低下的易患人群造成很大的危害。該病癥狀可累及全身，主要表現(xiàn)為急性高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度的呼吸道癥狀，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。20世紀(jì)以來全球至少有4次流感大流行[雷達(dá)，等，2009；宋樂，江曉靜，2014]。流感屬于乙類傳染性，其致病因子流感病毒(Influenza virus)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一種帶包膜并且分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒(候文郁，等，2014)。根據(jù)流感病毒的NP蛋白和M蛋白的抗原性質(zhì)不同，可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒的傳染性、致病性和變異性都明顯高于其他兩種血清型，能引起世界性流感大流行(許沙沙，等，2015)；乙型流感病毒常引起局部暴發(fā)，不引起世界性流感大流行；丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，侵襲嬰幼兒，一般不引起流行(KAITLIN RL,et a1.2013)。

流感病毒的檢測方法包括分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。分離培養(yǎng)法是一種基于細(xì)胞病變的檢測方法，有TCID₅₀的測定和空斑實(shí)驗(yàn)，是流感病毒滴度測定的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，TClD₅₀實(shí)驗(yàn)測得結(jié)果的主觀性較強(qiáng)，結(jié)果不夠精確；空斑實(shí)驗(yàn)是病毒學(xué)中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，但實(shí)驗(yàn)操作的熟練程度要求較高，以上兩種方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且我國大部分實(shí)驗(yàn)室達(dá)不到重大傳染病病毒分離培養(yǎng)要求，因而實(shí)驗(yàn)室通常采用免疫學(xué)檢測與核酸檢測法進(jìn)行診斷(蘇明權(quán)，等，2011)。免疫學(xué)檢測方法包括血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)、免疫熒光(IF)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強(qiáng)，敏感性高，適應(yīng)面廣，方法簡便快速，制樣簡單等特點(diǎn)，但存在操作費(fèi)時(shí)且敏感性較差的問題(Brittain-long R,et a1.2008)。在血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)中，紅細(xì)胞濃度、稀釋液、反應(yīng)的溫度、加抗原與加紅細(xì)胞之間的時(shí)間間隔及結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，而且HI試驗(yàn)需預(yù)處理血清中的非特異性血凝抑制因子，其缺點(diǎn)是存在一定的假陽性。免疫熒光技術(shù)的非特異性染色問題也尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。與免疫熒光相似，ELISA檢測過程中，同樣會(huì)出現(xiàn)假陽性。分子生物學(xué)檢測是業(yè)內(nèi)公認(rèn)靈敏度和特異度最好的一種檢測方法。該方法是在PCR原理的基礎(chǔ)上，先后建立了多種PCR相關(guān)檢測方法，最常用的如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光PCR以及新型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(1oop-mediaed isothermal amplification，LAMP)是日本Notomi等(Notomi T,et a1.2000)在2000年報(bào)道的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。與傳統(tǒng)的擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)擴(kuò)增的特異性更強(qiáng)，反應(yīng)過程只需在60～65℃的恒溫條件下60～90min即可完成，不需要熱循環(huán)。由于反應(yīng)過程中不需要開啟試管蓋，因此大大降低了實(shí)驗(yàn)室污染的可能性，并且具有重復(fù)性好、特意性強(qiáng)、敏感度高和易于操作等特點(diǎn)，是未來流感病毒檢測應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。目前，國內(nèi)外尚未見以熒光RT-LAMP方法檢測D型流感病毒的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物及檢測方法，選取D型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，針對病毒的高保守區(qū)域的6個(gè)特異性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)設(shè)計(jì)了6條特異性引物，旨在建立一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的D型流感病毒檢測方法，該方法在60℃～65℃恒溫條件下1h甚至更短的時(shí)間即可完成基因擴(kuò)增。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物，包括正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B；所述正向內(nèi)引物FIP如SEQ NO.1所示，反向內(nèi)引物BIP如SEQ NO.2所示，正向外引物F3如SEQ NO.3所示，反向外引物B3如SEQ NO.4所示，正向環(huán)引物L(fēng)F如SEQ NO.5所示，反向環(huán)引物L(fēng)B如SEQ NO.6所示。

上述RT-LAMP引物檢測D型流感病毒的檢測方法，它包括以下步驟：

S1.提取流感病毒樣本的總RNA，并以此為模板RNA；

S2.將2μL的模板RNA、12.5μL的反應(yīng)液RM、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的LF和LB各1μL、5μM的F3和B3各1μL、1μL的Bst DNA聚合酶、0.5μL的逆轉(zhuǎn)錄酶、0.5μL熒光染料混合，加水至25mL混勻，加入20μL密封液，密封，混勻離心；

S3.進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)程序：63℃30S，1個(gè)循環(huán)；63℃15s、63℃45s，60個(gè)循環(huán)；于63℃45s處收集熒光信號(hào)。

進(jìn)一步地，所述密封液為液體石蠟。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明選取D型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，針對病毒的高保守區(qū)域的6個(gè)特異性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)設(shè)計(jì)了6條特異性引物，旨在建立一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的D型流感病毒檢測方法，該方法在60℃～65℃恒溫條件下1h甚至更短的時(shí)間即可完成基因擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)檢測方法簡單，檢測迅速，便捷的檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明RT-LAMP體系檢測結(jié)果；

圖2為本發(fā)明RT-LAMP特異性檢測結(jié)果；

圖3為本發(fā)明RT-LAMP靈敏度檢測結(jié)果(由左向右為10⁹-10¹)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。

試驗(yàn)例

按照引物設(shè)計(jì)原則，選取D型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，針對病毒的高保守區(qū)域的6個(gè)特異性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)，用LAMP designer1.14軟件設(shè)計(jì)6條引物，分別為正向內(nèi)引物(FIP)、反向內(nèi)引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向環(huán)引物(LF)及反向環(huán)引物(LB)，引物序列見表1；引物由上海Invitrogen生物科技有限公司合成；合成后的引物用滅菌DEPC水稀釋成100pmol/μL溶液，-20℃保存。

表1 D型流感病毒RT-LAMP引物

病毒RNA的提取方法參照OMEGA公司的Mag-Bind Viral DNA/RNA Kit說明書進(jìn)行，提取流感病毒樣本的總RNA，并以總DNA為模板RNA；

配制25μL的RT-LAMP反應(yīng)體系成分，見表2；同時(shí)設(shè)立不含模板RNA的陰性對照組；

表2 RT-LAMP反應(yīng)混合物

將上述體系充分混勻后，加入20μL密封液(液體石蠟)，混勻離心，封口膠封住蓋緊的管蓋；RT-LAMP反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃30S，1個(gè)循環(huán)；63℃15s、63℃45s，60個(gè)循環(huán)；于63℃45s處收集熒光信號(hào)，熒光通道選為FAM；檢測結(jié)果如圖1所示。

特異性試驗(yàn)

將提取的7株A型流感病毒RNA、21株B型流感病毒的RNA和重組的C型流感病毒質(zhì)粒、D型流感病毒質(zhì)粒，分別進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，對其擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行鑒定，以驗(yàn)證所用引物及所建立方法的特異性，結(jié)果如圖2。

靈敏度試驗(yàn)

將D型流感病毒的合成質(zhì)粒，用ND-1000微量分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算為目的基因的拷貝數(shù)，以10倍比稀釋至10拷貝/μL，對梯度稀釋的陽性對照進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)檢測，結(jié)果如圖3。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> 一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物及檢測方法

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TCAGAATTTG GAGAAGTGGA C 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

AGAGTTCACC ATCGCTACT 19

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CAGAAGGGAT CTGTTTCACA TCCAGTTGTT GCCGTTGATG C 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GAGAAGGCGC AACTACTGGA GCCAGCTTGG ACTTCAATCT TA 42

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CGTCTGATCT CATCTCTAGA TTCC 24

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

AGGTTCAGGA GTTGCTTGG 19