流感病毒突變體及其用途
【專利摘要】本文中公開了與突變體病毒有關(guān)的組合物和方法，具體地是突變體流感病毒。本文中公開的突變體病毒包括突變體M2序列，且可用于免疫原性組合物中，例如，作為疫苗。本文中也公開了用于繁殖病毒突變體的方法、組合物和細胞，以及與疫苗接種有關(guān)的方法、裝置和組合物。
【專利說明】流感病毒突變體及其用途
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/501，034的權(quán)益，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003]流感是美國成年人死亡的主要原因。每年，約36，000人死于流感，超過200，000人住院。流感是一種高度接觸傳染的疾病，其通過咳嗽、噴嚏和通過與攜帶病毒的物體(諸如門把手和電話)的直接物理接觸而傳播。流感的征狀包括發(fā)熱、極度疲勞、頭痛、寒冷和身體疼痛；約50%的受感染者沒有征狀，但是仍然是接觸傳染的。免疫接種在65歲以下的健康人中具有70-90%的預(yù)防流感的有效性，只要循環(huán)病毒株的抗原性與疫苗的抗原性匹配。
[0004]疫苗接種是預(yù)防流感的主要方法，并且活的減毒的和滅活的(殺死的)病毒疫苗都是目前可得到的。通常鼻內(nèi)施用的活病毒疫苗會活化免疫系統(tǒng)的所有階段，且可以刺激針對多種病毒抗原的免疫應(yīng)答。因而，活病毒的應(yīng)用克服了在滅活病毒疫苗的制備過程中可能發(fā)生的病毒抗原破壞的問題。另外，與由滅活疫苗誘導(dǎo)的免疫相比，由活病毒疫苗產(chǎn)生的免疫通常更持久、更有效和更有交叉反應(yīng)性，并且活病毒疫苗的生產(chǎn)成本比滅活的病毒疫苗更低。但是，減毒病毒的突變經(jīng)常是不太確定的，且恢復(fù)是一個問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種核酸序列，其包含SEQ ID N0:1。
[0006]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種核酸序列，其包含SEQ ID N0:2。
[0007]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種核酸序列，其包含SEQ ID N0:3。
[0008]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種組合物，其包含與(i)啟動子和(ii)轉(zhuǎn)錄終止序列可操作地連接的SEQ ID N0:USEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。
[0009]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種重組流感病毒，其包含M基因中的突變。在某些實施方案中，所述重組流感病毒包含SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。在某些實施方案中，所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些實施方案中，在體外宿主細胞系統(tǒng)中至少10代，所述M基因中的突變不會恢復(fù)成野生型或編碼功能性M2蛋白的非野生型序列。在某些實施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些實施方案中，所述病毒在被所述病毒感染的哺乳動物中是非致病性的。在某些實施方案中，所述體外細胞系統(tǒng)包含中國倉鼠卵巢細胞。在某些實施方案中，所述體外細胞系統(tǒng)包含VeiO細胞。
[0010]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種細胞，其包含權(quán)利要求5-10中的任一項所述的重組流感病毒。在某些實施方案中，所述細胞是在體外。在某些實施方案中，所述細胞是在體內(nèi)。
[0011]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種組合物，其包含:含有M基因中的突變的重組流感病毒。在某些實施方案中，所述組合物包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在某些實施方案中，所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些實施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些實施方案中，所述組合物對施用所述組合物的哺乳動物是非致病性的。在某些實施方案中，在給哺乳動物施用所述組合物以后約3周內(nèi)，所述組合物在哺乳動物中引起可檢測的免疫應(yīng)答。
[0012]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種疫苗，其包含:含有M基因中的突變的重組流感病毒。在某些實施方案中，所述疫苗包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3。在某些實施方案中，所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些實施方案中，所述病毒是甲型流感病毒。在某些實施方案中，所述疫苗對施用所述疫苗的哺乳動物是非致病性的。在某些實施方案中，在給哺乳動物施用所述疫苗以后約3周內(nèi)，所述疫苗在哺乳動物中引起可檢測的免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，除了所述重組病毒以外，所述疫苗包含至少2種不同的流感病毒株。在某些實施方案中，所述疫苗包含至少一種乙型流感病毒或乙型流感病毒抗原。在某些實施方案中，所述疫苗包含至少一種丙型流感病毒或丙型流感病毒抗原。在某些實施方案中，所述疫苗包含一種或多種病毒或病毒抗原，所述病毒或病毒抗原包含人甲型流感和得自非人物種的大范圍流行流感病毒。在某些實施方案中，所述疫苗包含選自HlNl、H2N2和H3N2的人甲型流感病毒。
[0013]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于繁殖重組流感病毒的方法，所述方法包括:使宿主細胞與重組流感病毒SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3接觸；在適合病毒復(fù)制的條件下，溫育宿主細胞足夠的時間，和分離后代病毒顆粒。
[0014]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于制備疫苗的方法，所述方法包括:將宿主細胞放入生物反應(yīng)器中；使所述宿主細胞與重組病毒SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ IDN0:3接觸；在適合病毒繁殖的條件下，溫育所述宿主細胞足夠的時間；分離后代病毒顆粒；和配制所述后代病毒顆粒用于作為疫苗來施用。
[0015]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于免疫受試者的方法，所述方法包括:施用包含重組流感病毒的組合物,所述重組流感病毒包含M基因中的突變，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
[0016]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于降低受試者中的甲型流感病毒感染的可能性或嚴重程度的方法，所述方法包括:施用包含重組流感病毒的組合物，所述重組流感病毒包含M基因中的突變，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些實施方案中，所述重組流感病毒包含SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3。在某些實施方案中，所述方法包括:提供至少I個加強劑量的組合物，其中在第一次施用以后3周提供所述至少I個加強劑量。在某些實施方案中，所述方法包括:鼻內(nèi)地、肌肉內(nèi)地或皮內(nèi)地施用所述組合物。在某些實施方案中，所述方法包括:皮內(nèi)地進行施用。在某些實施方案中，所述方法包括:使用微型針遞送裝置進行施用。
[0017]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于皮內(nèi)施用免疫原性組合物的方法，所述方法包括:(a)提供微型針遞送裝置，其包括(i)穿刺機構(gòu)；(ii)免疫原性組合物層，其包括多個能夠刺穿皮膚和允許免疫原性組合物皮內(nèi)施用的微型針；和(b)壓迫所述穿刺機構(gòu)；其中所述免疫原性組合物包含含有M基因中的突變的重組流感病毒，且其中所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。在某些實施方案中，所述重組流感病毒包含SEQ ID NOiUSEQ ID NO:2或SEQ ID N0:3。在某些實施方案中，所述微型針陣列最初位于裝置殼體的內(nèi)部，并在桿致動后，允許微型針延伸穿過裝置底部并插入皮膚中，由此允許疫苗流體輸注進皮膚中。
[0018]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種重組流感病毒，其包含M基因中的突變，其中所述病毒不在未修飾的選自以下的宿主細胞中復(fù)制:a中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Vero細胞、或Madin-Darby犬腎細胞。在某些實施方案中，所述M基因中的突變導(dǎo)致病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成病毒表達具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
[0019]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種重組細胞，其包含編碼流感病毒M2離子通道基因的核酸，其中所述核酸在所述細胞中表達。
[0020]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種重組細胞，其包含2，6-唾液酸受體基因。
[0021]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種重組細胞，其包含表達(i)病毒的M2離子通道基因和(ii) 2，6-唾液酸受體基因的細胞基因組或表達載體。在某些實施方案中，所述細胞是真核細胞。在某些實施方案中，所述真核細胞是中國倉鼠卵巢細胞或Vero細胞。在某些實施方案中，所述重組細胞進一步包含人流感病毒，其中所述病毒不表達功能性M2蛋白。
[0022]在一個方面，本公開內(nèi)容提供了一種用于生產(chǎn)重組流感病毒顆粒的方法，所述方法包括:(A)用人流感病毒感染權(quán)利要求47-52中的一項所述的細胞，其中所述細胞要么(i)組成型地表達功能性 的M2離子通道蛋白，要么(ii)在病毒感染以后被誘導(dǎo)表達功能性的M2離子通道蛋白，且其中所述病毒僅在有細胞表達的功能性M2離子通道蛋白存在下成功地復(fù)制；和(B)分離后代病毒顆粒。在某些實施方案中，所述方法進一步包括:將分離的病毒顆粒配制成疫苗。在某些實施方案中，所述病毒包含人流感病毒，且其中所述病毒不表達功能性M2蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1的圖描繪了 M2離子通道在流感病毒生命周期中的作用，其中(I)流感病毒附著于細胞表面上的唾液酸受體；(2)病毒被內(nèi)化進細胞中；(3)M2離子通道在病毒表面上表達；(4)M2離子通道打開以允許質(zhì)子進入，從而導(dǎo)致進入細胞核的病毒RNA的釋放，發(fā)生復(fù)制，并導(dǎo)致病毒蛋白合成；和(5)病毒組分被包裝進病毒粒子中和釋放。
[0024]圖2是野生型和突變體M2基因的示意圖。如下刪除A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)M區(qū)段的M2基因:在Ml蛋白的開放讀碼框下游插入2個終止密碼子，隨后刪除跨膜結(jié)構(gòu)域中的51個核苷酸以抑制全長M2蛋白的表達。
[0025]圖3顯示了未加工的Ml和M2的核苷酸序列。
[0026]圖4的圖顯示了正常MDCK細胞和穩(wěn)定表達M2蛋白的MDCK細胞(M2CK)中的Μ2Κ0(ΛΤΜ)(上圖)和野生型PR8(下圖)病毒的生長動力學(xué)。以10_5的感染復(fù)數(shù)，用病毒感染細胞。確定細胞上清液中的病毒滴度。野生型PR8在兩個細胞類型中生長至高滴度，而M2K0 ( Δ TM)僅在M2CK細胞中生長得較好，在MDCK細胞中根本不生長。[0027]圖5的蛋白質(zhì)印跡表明，Μ2Κ0(ΔΤΜ)病毒在正常細胞中生產(chǎn)病毒抗原，但是不生產(chǎn)M2。用PR8感染的小鼠血清(組Α)或抗-M2單克隆抗體(組B)探測細胞裂解物。泳道1，分子量標志物；泳道2，被PR8感染的MDCK細胞；泳道3，被Μ2Κ0( Λ TM)感染的MDCK細胞；泳道4，未感染的MDCK細胞。
[0028]圖6的圖顯示了接種Μ2Κ0變體以后小鼠體重的變化。
[0029]圖7Α的圖顯示了接種Μ2Κ0變體的小鼠中的抗體應(yīng)答。
[0030]圖7Β的圖顯示了感染后6周加強的小鼠的血清中的抗_PR8IgG抗體滴度。
[0031]圖8的圖顯示了接種M2K0變體以后，流感攻擊以后小鼠體重的變化。
[0032]圖9的圖顯示了接種M2K0變體以后，流感攻擊以后的小鼠存活。
[0033]圖10的圖顯示了鼻內(nèi)地(IN)、真皮內(nèi)地(ID)或肌肉內(nèi)地(頂)接種PR8以后小鼠體重的變化。
[0034]圖1lA的圖顯示了在接種PR8以后2周從具有1.SxlO'pfu (Lo)或1.8xl04pfu (Hi)的病毒濃度的小鼠收集的血清中的抗體滴度。圖1lB的圖顯示了在接種PR8以后7周從具有1.SxIO1Pfu(Lo)或1.8xl04pfu(Hi)的疫苗濃度的小鼠收集的血清中的抗體滴度。
[0035]圖12的圖顯示了在接種PR8以后，流感攻擊以后的小鼠存活。
[0036]圖13的圖顯示了在接種PR8以后，流感攻擊以后的小鼠體重的變化。
[0037]圖14的圖顯示了接種后7周從小鼠收集的血清中的抗體滴度，所述小鼠真皮內(nèi)地接種 1.8xl04pfu PR8。`
[0038]圖15的圖顯示了真皮內(nèi)地接種1.8x104pfu PR8的小鼠的體重的變化。
[0039]圖16的圖顯示了被雜亞型病毒感染的小鼠在攻擊后的存活百分比。
[0040]圖17的圖顯示了得自不同疫苗接種組的小鼠的ELISA滴度。
[0041]圖18的圖顯示了同亞型病毒感染以后小鼠的存活百分比。
[0042]圖19的圖顯示了雜亞型病毒攻擊以后小鼠的存活百分比。
[0043]圖20的圖顯示了接種的雪貂(ferret)的體重的變化。給雪貂接種IO7TCID5tl的Μ2Κ0(ΔΤΜ)病毒(組Α)或IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (Η3Ν2)甲型流感病毒(組B)。接種后監(jiān)測體重3天。
[0044]圖21的圖顯示了接種的雪貂的體溫的變化。給雪貂接種IO7TCID5tl的Μ2Κ0( Λ TM)病毒(組Α)或IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒(組B)。接種后監(jiān)測體溫3天。
[0045]圖22的圖顯示了疫苗接種以后雪貂的體重的變化。給雪貂接種IO7TCID5tl的M2K0 ( Δ TM)病毒[Gl 和 G3]、IO7TCID50 的 FM#6 病毒[G2 和 G4]或 OPT1-MEM? [G5]。在激發(fā)疫苗接種以后(組A)和接受加強疫苗以后(組B)，監(jiān)測體重的變化14天。
[0046]圖23的圖顯示了攻擊以后雪貂的體重的變化。用IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒攻擊雪貂。接種后監(jiān)測體重14天。
[0047]圖24的圖顯示了疫苗接種以后雪貂的體溫的變化。給雪貂接種IO7TCID5tl的M2K0 ( Δ TM)病毒[Gl 和 G3]、IO7TCID50 的 FM#6 病毒[G2 和 G4]或 OPT1-MEM? [G5]。在激發(fā)疫苗接種以后(組A)和接受加強疫苗以后(組B)，監(jiān)測體溫的變化14天。
[0048]圖25的圖顯示了攻擊以后雪貂的體溫的變化。用IO7TCID5tl的A/布里斯班/10/2007 (H3N2)甲型流感病毒攻擊雪貂。接種后監(jiān)測體溫14天。[0049]圖26的圖顯示了病毒接種以后雪貂的重量的變化。在第O天給供體雪貂接種IO7TCID50 的 M2K0 ( Δ TM)病毒(組 A)或 IO7TCID50 的 A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2)病毒(組B)。接種后24小時(第I天)，將供體放入具有直接接觸(DC)的籠子中，所述籠子鄰近容納氣溶膠接觸(AC)的籠子。在供體接種以后，監(jiān)測體重的變化14天。
[0050]圖27的圖顯示了病毒接種以后雪貂的體溫的變化。在第O天給供體雪貂接種IO7TCID50 的 M2K0 ( Δ TM)病毒(組 A)或 IO7TCID50 的 A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2)病毒(組B)。接種后24小時(第I天)，將供體放入具有直接接觸(DC)的籠子中，所述籠子鄰近容納氣溶膠接觸(AC)的籠子。在供體接種以后，監(jiān)測體溫的變化14天。
[0051]圖28的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會引起體液和粘膜應(yīng)答。組A顯示了施用PR8、皿21(0(八了1)、滅活的？1?8(1隊頂)或PBS以后的血清IgG和IgA滴度。組B顯示了施用PR8、Μ2Κ0(Δ TM)、滅活的PR8 (IN、IM)或PBS以后肺洗液IgG和IgA滴度。
[0052]圖29的圖表明，Μ2Κ0(ΔΤΜ)疫苗會保護小鼠免于致命的同亞型和雜亞型病毒攻擊。組A顯示了同源PR8 (HlNl)攻擊以后的小鼠體重變化。組B顯示了異源Aichi (Η3Ν2)攻擊以后的小鼠存活。
[0053]圖30的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會控制呼吸道中的攻擊病毒復(fù)制。組A顯示了PR8 (HlNl)攻擊以后的病毒滴度。組B顯示了 Aichi(H3N2)攻擊以后的病毒滴度。
[0054]圖31的圖顯示了血清中針對Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗的抗體應(yīng)答的動力學(xué)。
[0055]圖32的圖顯示了血清和呼吸道中針對Μ2Κ0( Λ TM)疫苗的粘膜抗體應(yīng)答。
[0056]圖33的圖顯示了小鼠中響應(yīng)于Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗的抗_HA IgG的動力學(xué)。
[0057]圖34的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會誘導(dǎo)與和IVR-147類似的免疫應(yīng)答。組A顯示了施用FIuMistiID, Μ2Κ0(ΛΤΜ)Η3、IVR-147和PBS的動物中的血清病毒滴度。組B顯示了施用FluMisftD、Μ2Κ0(ΛΤΜ)Η3、IVR-147和PBS的動物中的肺洗液病毒滴度。組C顯示了施用^.爪化^113、厘21(0(八1￥)!13、1￥1?-147和？85的動物中的鼻甲病毒滴度。
[0058]圖35的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會保護免于Aichi攻擊。組A顯示了施用FluMist?H3, Μ2Κ0(Δ TM)Η3,IVR-147和PBS的動物在Aichi攻擊以后的體重減輕。組B
顯示了施用FluMist:" H3、Μ2Κ0(Δ TM)Η3,IVR-147和PBS的動物在Aichi攻擊以后的存活
百分比。
[0059]圖36的圖表明，Η5Ν1Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會引起針對HA的IgG抗體滴度。
[0060]圖37 的圖顯示了施用 Μ2Κ0 (ATM)CAO7、WT CA07 和 FluiVlisC CA07 疫苗以后的體重。
[0061]圖38的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒不會在小鼠的呼吸道中復(fù)制。
[0062]圖39的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗表現(xiàn)出快速的抗體動力學(xué)。
[0063]圖40的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會保護免于Η3Ν2病毒、A/Aichi/2/1968的異源攻擊。
[0064]圖41的圖表明，Μ2Κ0(ΛΤΜ)疫苗會激發(fā)在攻擊后恢復(fù)的細胞應(yīng)答。[0065]圖42的圖表明，Μ2Κ0( Λ TM)病毒會產(chǎn)生與M2的野生型病毒類似的mRNA水平。
[0066]圖43的瓊脂糖凝膠顯示了 pCMV-PR8-M2表達質(zhì)粒的限制酶切消化。泳道 I 和 5 ;lKb DNA 梯型劑(Promega, Madison, WI, USA)，泳道 2-4 ；Eco Rl 消化的PCMLV-PR8-M2:0.375 μ g (泳道 2)、0.75 μ g (泳道 3)和 1.5 μ g (泳道 4)。
[0067]圖44的圖顯示了 pCMV-PR8-M2與流感M2基因的開放讀碼框的序列比對。
[0068]圖45的圖顯示了雪貂呼吸道中的Μ2Κ0( Λ TM)和FIuiVHsL病毒復(fù)制。
[0069]圖46的圖顯示了用A/布里斯班/10/2007 (Η3Ν2)病毒鼻內(nèi)攻擊以后鼻洗液中的Μ2Κ0(δτμ)和 FluMisf 病毒滴度。
[0070]圖47的圖顯示了僅用Μ2Κ0(ΛΤΜ)和FluMisK激發(fā)組疫苗接種以后雪貂中的IgG滴度。 [0071]圖48的圖顯示了用Μ2Κ0(ΔΤΜ)和FluMist?激發(fā)_加強組疫苗接種以后雪貂中的IgG滴度。
[0072]圖49的圖顯示了從用Μ2Κ0(ΛΤΜ)或FluMist °疫苗接種至攻擊后，雪貂血清中的ELISA IgG滴度的總結(jié)。
[0073]圖50的圖顯示了傳播研究中得自雪貂的鼻洗液中的病毒滴度。Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒沒有傳播(沒有檢測到病毒)，而對照布里斯班(Brisb)/10病毒確實傳播。
[0074]圖51的圖顯示了用A/加利福尼亞、A/拍斯(Perth)和B/布里斯班(brisbane)病毒鼻內(nèi)地(IN)、肌肉內(nèi)地(IM)和真皮內(nèi)地(ID FGN)接種疫苗的受試者中的IgG滴度。
[0075]圖52的圖顯示了肌肉內(nèi)地(IM)或真皮內(nèi)地(ID FGN)施用激發(fā)劑量或激發(fā)和加強劑量的A/珀斯(H3N2)疫苗的受試者中的IgG滴度。
[0076]圖53的圖顯示了在接種后O、30和60天在通過肌肉內(nèi)(IM)和真皮內(nèi)(ID)遞送接種 FluLaval:A/ 加利福尼亞 /7/2009NYMC X_181、A/ 維多利亞 /210/2009NYMC X-187 (A/珀斯/16/2009-樣病毒)和B/布里斯班/60/2008的豚鼠中的病毒滴度。
[0077]圖54的圖顯示了免疫接種越南/1203/2004病毒以后5個月攻擊的、Η5Ν1Μ2Κ0(Δ TM)接種疫苗的受試者的存活百分比。
[0078]圖55的圖顯示了免疫接種越南/1203/2004病毒以后4周攻擊的、Η5Ν1Μ2Κ0( Λ TM)接種疫苗的受試者的存活百分比。
【具體實施方式】
[0079]1.定義
[0080]在本文中使用以下術(shù)語，提供所述術(shù)語的定義用于引導(dǎo)。
[0081]除非明確地闡明僅表示單數(shù)，否則本文中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”表示單數(shù)和復(fù)數(shù)。
[0082]術(shù)語“約”和一般范圍的應(yīng)用(不論是否用術(shù)語約限定)是指，包括的數(shù)字不限于在本文中闡述確切數(shù)字，且意圖表示在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下基本上在舉例的范圍內(nèi)的范圍。本文中使用的“約”會被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解，且在一定程度上隨它所應(yīng)用的上下文而變化。如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在它所應(yīng)用的上下文下不清楚該術(shù)語的應(yīng)用，“約”是指特定術(shù)語的至多加或減10%。
[0083]本文中使用的“受試者”和“患者”互換使用，且表示動物，例如，任意脊椎動物物種的成員。本文公開的主題的方法和組合物對于溫血脊椎動物(包括哺乳動物和禽類)而言是特別有用的。示例性的受試者可以包括:哺乳動物諸如人類，以及由于將要絕種而重要的、經(jīng)濟上重要的(在農(nóng)場中飼養(yǎng)的動物，用于人類消費)和/或?qū)τ谌祟愒谏鐣现匾?作為寵物或在動物園中飼養(yǎng)的動物)哺乳動物和禽類。在某些實施方案中，所述受試者是人。在某些實施方案中，所述受試者不是人。
[0084]本文中使用的術(shù)語“有效量”或“治療有效量”或“藥學(xué)有效量”表示，足以實現(xiàn)期望的治療和/或預(yù)防效果的量，例如，導(dǎo)致疾病、病癥和/或其征狀的預(yù)防的量。在治療或預(yù)防應(yīng)用的背景下，施用給受試者的組合物的量將取決于疾病的類型和嚴重程度以及個體的特征，諸如一般健康、年齡、性別、體重和對組合物藥物的耐受性。還將取決于疾病或病癥的程度、嚴重程度和類型。技術(shù)人員將能夠根據(jù)這些和其它因素確定適當?shù)膭┝?。在某些實施方案中，施用多次劑量。額外地或可替換地，在某些實施方案中，施用多個治療組合物或化合物(例如，免疫原性組合物，諸如疫苗)。
[0085]本文中使用的術(shù)語“分離的”和/或“純化的”表示核酸(例如，載體或質(zhì)粒)、多肽、病毒或細胞的體外制備、分離和/或純化，使得它不伴有不希望的體內(nèi)物質(zhì)，或者從通常與其一起存在的不希望的體內(nèi)物質(zhì)中基本上純化。例如，在某些實施方案中，通過體外培養(yǎng)和繁殖得到分離的病毒制品，且其基本上不含有其它感染性病原體。本文中使用的“基本上不含有”是指，使用該化合物或試劑的標準檢測方法，低于特定化合物(諸如不希望的核酸、蛋白、細胞、病毒、感染性病原體等)的檢測水平。
[0086]本文中使用的術(shù)語“重組病毒”表示這樣的病毒:其已經(jīng)經(jīng)過體外操作(例如,使用重組核酸技術(shù))，以將 變化引入病毒基因組和/或以將變化引入病毒蛋白。例如，在某些實施方案中，重組病毒可以包括野生型、內(nèi)源、核酸序列和突變體和/或外源核酸序列。額外地或可替換地，在某些實施方案中，重組病毒可以包括修飾的蛋白組分，諸如突變體或變體基質(zhì)、血凝素、神經(jīng)氨酸酶、核蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白和/或聚合酶蛋白。
[0087]本文中使用的術(shù)語“重組細胞”或“修飾的細胞”表示這樣的細胞:其已經(jīng)經(jīng)過體外操作(例如，使用重組核酸技術(shù))，以將核酸引入細胞中和/或以修飾細胞的核酸。重組細胞的例子包括:攜帶外源性質(zhì)粒、表達載體等的原核或真核細胞，和/或包括對它們的細胞核酸的修飾(例如，在細胞基因組中的置換、突變、插入、缺失等)的細胞。一種示例性的重組細胞是，已經(jīng)經(jīng)過體外操作以表達外源性蛋白(諸如病毒M2蛋白)的細胞。
[0088]本文中使用的術(shù)語“突變體”、“突變”、和“變體”互換使用，且表示與野生型序列不同的核酸或多肽序列。在某些實施方案中，突變體或變體序列是天然存在的。在其它實施方案中，重組地和/或化學(xué)地引入突變體或變體序列。在某些實施方案中，核酸突變包括:對RNA和/或DNA序列的修飾(例如，添加、缺失、置換)。在某些實施方案中，稀釋包括化學(xué)修飾(例如，甲基化)，且也可以包括天然的和/或非天然的核苷酸的置換或添加。核酸突變可以是沉默突變(例如，一個或多個核酸變化，其編碼與野生型序列相同的氨基酸)，或者可以導(dǎo)致編碼的氨基酸的變化，產(chǎn)生終止密碼子，或者可以引入剪接缺陷或剪接改變。對編碼序列的核酸突變也可以導(dǎo)致保守的或非保守的氨基酸變化。
[0089]本文中使用的術(shù)語“vRNA”表示這樣的RNA:其包含病毒基因組，包括分段的或未分段的病毒基因組，以及正鏈和負鏈病毒基因組。vRNA可以是完全內(nèi)源的和“野生型”，和/或可以包括重組體和/或突變體序列。
[0090]本文中使用的術(shù)語“宿主細胞”表示，諸如病毒等病原體可以在其中復(fù)制的細胞。在某些實施方案中，宿主細胞是體外培養(yǎng)的細胞(例如，CHO細胞、VeiO細胞、MDCK細胞等)。額外地或可替換地，在某些實施方案中，宿主細胞是體內(nèi)的(例如，被感染的脊椎動物諸如禽或哺乳動物的細胞)。在某些實施方案中，可以修飾宿主細胞，例如，以增強病毒生產(chǎn)，諸如通過增強宿主細胞的病毒感染，和/或通過增強病毒的生長速率。作為例子，但是不作為限制，示例性的宿主細胞修飾包括:在宿主細胞的細胞表面上重組表達2-6-連接的唾液酸受體，和/或在已經(jīng)被造成病原體或病毒缺失或無效的宿主細胞中重組表達蛋白。
[0091]本文中使用的術(shù)語“感染”表示，攜帶疾病或病原體，諸如病毒。感染可以是故意的，諸如通過施用病毒或病原體(例如，通過疫苗接種)，或非故意的，諸如通過病原體從一個生物體向另一個生物體的自然轉(zhuǎn)移，或從被污染的表面向生物體的自然轉(zhuǎn)移。
[0092]如本文中使用的，與病毒結(jié)合使用的術(shù)語“減毒的”表示這樣的病毒:其與未減毒的相應(yīng)物相比具有降低的毒力或致病性，但是仍然是可存活的或活的。通常，與未減毒病毒相比，減毒會使得感染性病原體(諸如病毒)對受感染的受試者的有害性或毒力更低。這不同于殺死的或完全滅活的病毒。
[0093]如本文中使用的，與病毒結(jié)合使用的術(shù)語“型”和“株”互換使用，且用于泛指具有不同特征的病毒。例如，甲型流感病毒是與乙型流感病毒不同類型的病毒。同樣地，甲型流感HlNl是與甲型流感H2N1、H2N2和H3N2不同類型的病毒。額外地或可替換地，在某些實施方案中，可以將不同類型的病毒(諸如甲型流感H2N1、H2N2和H3N2)稱作“亞型”。
[0094]本文中使用的 “M2K0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ)”表示 SEQ ID NO: 1、含有 SEQ ID NO:1 的病毒、或包含含有SEQ ID NO:1的病毒的疫苗，取決于它所應(yīng)用的上下文。例如，在描述本文中證實的M2基因的突變時，“Μ2Κ0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ)”表示SEQ ID NO:1。在描述疫苗的病毒組分時，“Μ2Κ0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ) ”表示這樣的重組流感病毒:其具有PR8的內(nèi)部6個基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(ΡΑ、ΡΒ1、ΡΒ2)、非結(jié)構(gòu)(NS)、基質(zhì)(M))，但是其不表達功能性M2蛋白。在描述疫苗時，“Μ2Κ0”或“Μ2Κ0(ΛΤΜ)”表示包含Μ2Κ0(ΛΤΜ)重組病毒的疫苗。
[0095]本文中使用的“Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒”包括這樣的重組流感病毒:其具有PR8的內(nèi)部6個基因(核蛋白(NP)、聚合酶基因(ΡΑ、ΡΒ1、ΡΒ2)、非結(jié)構(gòu)(NS)、基質(zhì)(M))，但是其不表達功能性M2蛋白，無論是單獨的還是與其它病毒組分和/或編碼其它病毒組分的基因相組合。在某些實施方案中，所述Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒包含其它流感病毒的基因。在某些實施方案中，所述病毒包含甲型流感/布里斯班/10/2007-樣A/烏拉圭/716/2007 (Η3Ν2)的HA和NA基因。在某些實施方案中，所述Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒包含A/越南/1203/2004 (Η5Ν1)病毒的HA和NA基因。在某些實施方案中，所述Μ2Κ0(ΛΤΜ)病毒包含A/加利福尼亞/07/2009 (CA07)(HlNlpdm)病毒的HA和NA基因。
[0096]I1.甲型流感病毒
[0097]A.概述
[0098]流感是美國成年人死亡的主要原因。流感的致病菌是正粘病毒科的病毒，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感是在人類中最常見的和最有毒的。[0099]甲型流感病毒是有包膜的負鏈RNA病毒。甲型流感病毒的基因組被包含在8個單獨的(未成對的)RNA鏈上，其補體編碼11種蛋白(HA、NA、NP、Ml、M2、NSl、NEP、PA、PBl、PB1-F2、PB2)。總基因組大小為約14，000個堿基。該基因組的分段性質(zhì)允許在細胞同居過程中在不同病毒株之間交換整個基因。8個RNA區(qū)段如下。I)HA編碼血凝素(需要約500個血凝素分子才能構(gòu)成I個病毒粒子)；2)NA編碼神經(jīng)氨酸酶(需要約100個神經(jīng)氨酸酶分子才能構(gòu)成I個病毒粒子)；3)NP編碼核蛋白；4)M使用得自相同RNA區(qū)段的不同讀碼框編碼2種蛋白(Ml和M2)(需要約3000個Ml分子才能構(gòu)成I個病毒粒子);5)NS使用得自相同RNA區(qū)段的不同讀碼框編碼2種蛋白(NSl和NEP) ;6)PA編碼RNA聚合酶；7)PBl使用得自相同RNA區(qū)段的不同讀碼框編碼RNA聚合酶和PB1-F2蛋白(誘導(dǎo)細胞凋亡)；8)PB2編碼RNA聚合酶。
[0100]存在幾種甲型流感亞型，它們根據(jù)H數(shù)目(對于血凝素型)和N數(shù)目(對于神經(jīng)氨酸酶型)命名。目前，存在16種不同的已知H抗原(Hl至H16)和9種不同的已知N抗原(NI至N9)。每個病毒亞型已經(jīng)突變成具有不同致病特性的多種株；一些對一個物種是致病性的，但是其它不是致病性的，一些對多個物種是致病性的。已經(jīng)在人類中證實的示例性的甲型流感病毒亞型包括、但不限于=HlNl，其造成“西班牙流感”和2009年的豬流感爆發(fā)；H2N2，其造成二十世紀50年代后期的“亞洲流感” ;H3N2，其造成二十世紀60年代后期的香港流感；H5N1，通過它在2000年中期的傳播，造成全球流感大范圍流行威脅；H7N7 ;H1N2，其目前在人類和豬中流行；和H9N2，H7N2, H7N3, H5N2, H10N7。
[0101]鑒定了一些甲型流感變體，并如下命名:根據(jù)它們的最類似的已知分離物，且因而假定共享譜系(例如，福建流感病毒-樣)；根據(jù)它們的典型宿主(例如人流感病毒)；根據(jù)它們的亞型(例如H3N2);和根據(jù)它們的致病性(例如LP，低致病性的)。因而，與分離物A/福建/411/2002 (H3N2)類似的病毒引起的流感可以被稱作福建流感、人流感和H3N2流
感。
[0102]另外，有時根據(jù)所述株在其中流行或適應(yīng)的物種(宿主)來命名流感變體。使用該慣例命名的主要變體是:禽流感、人流感、豬流感、馬流感和犬流感。還已經(jīng)根據(jù)它們在家禽(特別是雞)中的致病性來命名變體，例如，低致病性的禽流感(LPAI)和高致病性的禽流感(HPAI)。
[0103]B.生命周期和結(jié)構(gòu)
[0104]流感病毒的生命周期通常包括:與細胞表面受體結(jié)合，進入細胞和病毒核酸脫殼，隨后病毒基因在細胞內(nèi)復(fù)制。合成病毒蛋白和基因的新拷貝以后，這些組分裝配成后代病毒顆粒，所述顆粒隨后離開細胞。不同的病毒蛋白在這些步驟的各步中起作用。
[0105]甲型流感顆粒由包囊病毒核心的脂質(zhì)包膜構(gòu)成。包膜的內(nèi)側(cè)襯有基質(zhì)蛋白(M1)，而外表面的特征在于2類糖蛋白刺突:血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。M2(—種跨膜離子通道蛋白)也是脂質(zhì)包膜的一部分。參見例如，圖1。
[0106]HA蛋白(一種三聚體I型膜蛋白)負責結(jié)合宿主細胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸寡糖(含有與半乳糖連接的末端唾液酸的寡糖)。該蛋白也負責在通過胞吞而內(nèi)化病毒粒子以后病毒和宿主細胞膜之間的融合。
[0107]神經(jīng)氨酸酶(NA)(—種四聚體II型膜蛋白)是從宿主細胞與HA和NA的糖綴合物切割末端唾液酸殘基的唾液酸酶，且因而被公認為受體破壞酶。該唾液酸酶活性是后代病毒粒子從宿主細胞表面的有效釋放以及后代聚集的阻止(由于病毒的HA與其它糖蛋白的結(jié)合活性)所必需的。因而，HA的受體結(jié)合活性和NA的受體破壞活性可能作為抗衡起作用，從而允許流感的有效復(fù)制。
[0108]基因組區(qū)段被包裝進病毒顆粒的核心。RNP (RNA+核蛋白，NP)是呈螺旋形式，3個病毒聚合酶多肽與每個區(qū)段結(jié)合。
[0109]流感病毒生命周期起始于HA與宿主細胞表面上的含唾液酸受體的結(jié)合，其后是受體介導(dǎo)的胞吞。圖1。晚期核內(nèi)體的低pH會觸發(fā)HA的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，由此暴露出HA2亞基的N端(所謂的融合肽)。融合肽啟動病毒和胞內(nèi)體膜的融合，并且基質(zhì)蛋白(Ml)和RNP復(fù)合物釋放到細胞質(zhì)內(nèi)。RNP由將vRNA殼體化的核蛋白(NP)以及由PA、PBl和PB2蛋白形成的病毒聚合酶復(fù)合物組成。RNP被轉(zhuǎn)運到細胞核中，在此發(fā)生轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。RNA聚合酶復(fù)合物催化3個不同的反應(yīng):(I)合成具有5'帽和3'聚腺苷酸結(jié)構(gòu)的mRNA、(2)合成全長互補RNA(cRNA)，和(3)使用cDNA作為模板合成基因組vRNA。隨后，將新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白裝配成RNP，從細胞核輸出，轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜，在此發(fā)生后代病毒顆粒的出芽。神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白如下在感染后期起作用:從唾液酸寡糖除去唾液酸，由此從細胞表面釋放出新裝配的病毒粒子，并阻止病毒顆粒的自我聚集。盡管病毒裝配涉及蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vRNA相互作用，但是這些相互作用的性質(zhì)很大程度上還是未知的。
[0110]C.M2蛋白的作用
[0111]如上所述,3種蛋白跨病毒膜:血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和M2。HA和NA的細胞外結(jié)構(gòu)域(胞外結(jié)構(gòu)域)是高度可變的，而M2的胞外結(jié)構(gòu)域在甲型流感病毒中是基本上不變的。不希望受理論的約束，在甲型流感病毒中，認為M2蛋白(其具有離子通道活性)在病毒生命周期的早期階段 在宿主細胞穿透和病毒RNA脫殼之間起作用。一旦病毒粒子經(jīng)過胞吞作用，認為病毒粒子-相關(guān)的M2離子通道(一種同源四聚體螺旋束)會允許質(zhì)子從核內(nèi)體流到病毒粒子內(nèi)部，以破壞酸不穩(wěn)定的Ml蛋白-核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)相互作用，從而促進RNP釋放到細胞質(zhì)中。另外，在其HA被細胞內(nèi)切割的某些流感株(例如A/禽瘟疫/Rostock/34)中，認為M2離子通道會升高跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)的pH，從而避免在此隔室中由低PH條件引起的HA的構(gòu)象變化。還證實了 M2跨膜結(jié)構(gòu)域自身可以充當離子通道。認為M2蛋白離子通道活性在流感病毒的生命周期中是必不可少的，因為已經(jīng)證實，阻斷M2離子通道活性的鹽酸金剛烷胺會抑制病毒復(fù)制。但是，尚未直接證實該活性在甲型流感病毒復(fù)制中的必要條件。M2蛋白的結(jié)構(gòu)顯示在圖2中。M2蛋白的核酸序列以及Ml序列顯示在圖3中。
[0112]盡管乙型和丙型流感病毒在結(jié)構(gòu)上和在功能上類似于甲型流感病毒，但是存在一些差異。例如，乙型流感病毒沒有具離子通道活性的M2蛋白。相反，NB蛋白(NA基因的產(chǎn)物)可能具有離子通道活性，且因而具有甲型流感病毒M2蛋白的類似功能。類似地，丙型流感病毒也沒有具離子通道活性的M2蛋白。但是，丙型流感病毒的CMl蛋白可能具有該活性。
[0113]II1.M2病毒突變體
[0114]在一個方面，公開了攜帶突變體M2vRNA序列的甲型流感病毒。通常，這樣的突變體不具有M2離子通道活性，表現(xiàn)出減弱的體內(nèi)生長性能，不可產(chǎn)生感染性后代，且在受感染的受試者中是非致病性的或表現(xiàn)出減少的發(fā)病機制。突變體病毒是免疫原性的，并且當用作疫苗時，會提供對抗相應(yīng)野生型和/或其它致病性病毒的感染的保護。另外，不論使用何種宿主細胞，本文中公開的M2突變體是穩(wěn)定的，且不會突變以表達功能性的M2多肽。額外地或可替換地，在某些實施方案中，在沒有可檢測地改變它的功能的情況下，產(chǎn)生這些突變體的Ml蛋白。在某些實施方案中，攜帶突變體M2核酸序列的病毒不可在宿主細胞中復(fù)制，而對應(yīng)的野生型病毒可以在所述宿主細胞中繁殖。作為例子，但是不作為限制，在某些實施方案中，所述野生型病毒可以在培養(yǎng)的MDCK細胞、CHO細胞和/或VeiO細胞中生長、繁殖和復(fù)制，而攜帶突變體M2序列的對應(yīng)病毒不可在相同類型的細胞中生長、繁殖或復(fù)制。
[0115]如上面所指出的，在某些實施方案中，所述M2突變體病毒是穩(wěn)定的，且不會在宿主細胞中突變或恢復(fù)成野生型或編碼功能性M2蛋白的非野生型序列。例如，在某些實施方案中，所述M2突變體病毒可在宿主細胞中穩(wěn)定2代、3代、5代、10代、12代、15代、20代、25代或超過25代。在某些實施方案中，所述宿主細胞是未修飾的宿主細胞。在其它實施方案中，所述宿主細胞是經(jīng)修飾的宿主細胞，諸如表達M2蛋白的MDCK細胞。
[0116]在某些實施方案中，所述M2突變體包括一個或多個核酸置換和/或缺失。在某些實施方案中，所述突變局部化在編碼以下的一個或多個的核酸中:M2蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域，M2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，和/或M2蛋白的細胞質(zhì)尾巴。額外地或可替換地，在某些實施方案中，一個或多個核酸突變會產(chǎn)生M2肽的剪接變體、一個或多個終止密碼子和/或一個或多個氨基酸缺失。在某些實施方案中，
[0117]攜帶突變體M2核酸的病毒產(chǎn)生無功能的M2多肽。在某些實施方案中，攜帶突變體M2核酸的病毒不產(chǎn)生M2多肽。在某些實施方案中，攜帶突變體M2核酸的病毒產(chǎn)生截短的M2多肽。在某些實施方案中，截短的M2多肽具有氨基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD。
[0118]在下面的表1-3中提供了 3個示例性的、非限制性的M2病毒突變體(M2_l、M2-2和M2-3)。在所述表中，小寫字母對應(yīng)于M2序列；大寫字母對應(yīng)于Ml序列；用粗體下劃線顯示突變體序列(例如，終止密碼子、剪接缺陷)。M2-2突變體中標有下劃線的(小寫字體)字母指示在M2-1和M2-3突變體中缺失的區(qū)域。
[0119]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸序列，其包含SEQ ID N0:lo
2.—種核酸序列，其包含SEQ ID N0:2。
3.一種核酸序列，其包含SEQ ID N0:3。
4.一種組合物，其包含與(i)啟動子和(ii)轉(zhuǎn)錄終止序列可操作地連接的SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3。
5.一種重組流感病毒，其包含M基因中的突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組流感病毒，所述重組流感病毒包含SEQID NO: 1、SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO:3。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組流感病毒，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中的任一項所述的重組流感病毒，其中所述M基因中的突變不會恢復(fù)成野生型或編碼功能性M2蛋白的非野生型序列在體外宿主細胞系統(tǒng)中至少10代。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中的任一項所述的重組病毒，其中所述病毒是甲型流感病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中的任一項所述的重組病毒，其中所述病毒在被所述病毒感染的哺乳動物中是非致病性的。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其中所述體外細胞系統(tǒng)包含中國倉鼠卵巢細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其中所述體外細胞系統(tǒng)包含Vero細胞。
13.一種細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求5-10中的任一項所述的重組流感病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細胞，其中所述細胞是在體外。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細胞，其中所述細胞是在體內(nèi)。
16.—種組合物，其包含:含有M基因中的突變的重組流感病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，所述組合物包含SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQID N0:3。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的組合物，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中的任一項所述的組合物，其中所述病毒是甲型流感病毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中的任一項所述的組合物，其中所述組合物對施用所述組合物的哺乳動物是非致病性的。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中的任一項所述的組合物，其中在給哺乳動物施用所述組合物以后約3周內(nèi)，所述組合物在所述哺乳動物中引起可檢測的免疫應(yīng)答。
22.—種疫苗，其包含:含有M基因中的突變的重組流感病毒。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，所述疫苗包含SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ IDN0:3。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的疫苗，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24中的任一項所述的疫苗，其中所述病毒是甲型流感病毒。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25中的任一項所述的疫苗，其中所述疫苗對施用所述疫苗的哺乳動物是非致病性的。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-26中的任一項所述的疫苗，其中在給哺乳動物施用所述疫苗以后約3周內(nèi)，所述疫苗在所述哺乳動物中引起可檢測的免疫應(yīng)答。
28.根據(jù)權(quán)利要求22-27中的任一項所述的疫苗，所述疫苗包含除了所述重組病毒以外的至少2種不同的流感病毒株。
29.根據(jù)權(quán)利要求22-28中的任一項所述的疫苗，所述疫苗包含至少一種乙型流感病毒或乙型流感病毒抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求22-29中的任一項所述的疫苗，所述疫苗包含至少一種丙型流感病毒或丙型流感病毒抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求22-30中的任一項所述的疫苗,所述疫苗包含一種或多種病毒或病毒抗原，所述一種或多種病毒或病毒抗原包含人甲型流感和得自非人物種的大范圍流行流感病毒。
32.根據(jù)權(quán)利要求22-31中的任一項所述的疫苗，其中所述人甲型流感病毒選自H1N1、H2N2 和 H3N2。
33.一種用于繁殖重組流感病毒的方法，所述方法包括:使宿主細胞與重組流感病毒SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3接觸；在適合病毒復(fù)制的條件下，溫育所述宿主細胞足夠的時間，和分離后代病毒顆粒。
34.一種用于制備疫苗的方法，所述方法包括:將宿主細胞放入生物反應(yīng)器中；使所述宿主細胞與重組病 毒SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3接觸；在適合病毒繁殖的條件下，溫育所述宿主細胞足夠的時間；分離后代病毒顆粒；和配制所述后代病毒顆粒用于作為疫苗來施用。
35.一種用于免疫受試者的方法，所述方法包括:施用包含重組流感病毒的組合物，所述重組流感病毒包含M基因中的突變,其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
36.一種用于降低受試者中的甲型流感病毒感染的可能性或嚴重程度的方法，所述方法包括:施用包含重組流感病毒的組合物,所述重組流感病毒包含M基因中的突變，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述重組流感病毒包含SEQID NO: 1、SEQID NO:2 或 SEQ ID NO:3。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37中的任一項所述的方法，所述方法包括:提供至少I個加強劑量的所述組合物，其中在第一次施用以后3周提供所述至少I個加強劑量。
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38中的任一項所述的方法，所述方法包括:鼻內(nèi)地、肌肉內(nèi)地或皮內(nèi)地施用組合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中皮內(nèi)地進行施用。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中使用微型針遞送裝置進行施用。
42.一種用于皮內(nèi)施用免疫原性組合物的方法，所述方法包括: (a)提供微型針遞送裝置，所述微型針遞送裝置包括(i)穿刺機構(gòu)；(ii)免疫原性組合物層，所述免疫原性組合物層包括多個能夠刺穿皮膚和允許免疫原性組合物皮內(nèi)施用的微型針；和(b)壓迫所述穿刺機構(gòu)； 其中所述免疫原性組合物包含含有M基因中的突變的重組流感病毒，且其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述重組流感病毒包含SEQID NO: 1、SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO:3。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述微型針陣列最初位于裝置殼體的內(nèi)部，并在桿致動后，允許所述微型針延伸穿過所述裝置底部并插入皮膚中，由此允許疫苗流體輸注進皮膚中。
45.一種重組流感病毒，其包含M基因中的突變，其中所述病毒不在未修飾的選自以下的宿主細胞中復(fù)制:中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、VeiO細胞或Madin-Darby犬腎細胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述 的重組病毒，其中所述M基因中的突變導(dǎo)致所述病毒表達M2蛋白的失敗，或者造成所述病毒表達具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的截短的M2蛋白。
47.一種重組細胞，其包含編碼流感病毒M2離子通道基因的核酸，其中所述核酸在所述細胞中表達。
48.一種重組細胞，其包含2，6-唾液酸受體基因。
49.一種重組細胞，其包含表達(i)病毒的M2離子通道基因和(ii) 2，6-唾液酸受體基因的細胞基因組或表達載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求47-49中的任一項所述的重組細胞，其中所述細胞是真核細胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求47-50中的任一項所述的重組細胞，其中所述真核細胞是中國倉鼠卵巢細胞或VeiO細胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求47-51中的任一項所述的重組細胞,所述重組細胞進一步包含人流感病毒，其中所述病毒不表達功能性M2蛋白。
53.一種用于生產(chǎn)重組流感病毒顆粒的方法，所述方法包括:(A)用人流感病毒感染根據(jù)權(quán)利要求47-52中的一項所述的細胞，其中所述細胞要么(i)組成型地表達功能性的M2離子通道蛋白，要么(ii)在病毒感染以后被誘導(dǎo)表達功能性的M2離子通道蛋白，且其中所述病毒僅在有所述細胞表達的功能性M2離子通道蛋白存在下成功地復(fù)制；和(B)分離后代病毒顆粒。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，所述方法進一步包括:將分離的病毒顆粒配制成疫苗。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54所述的方法，其中所述病毒包含人流感病毒，且其中所述病毒不表達功能性M2蛋白。
【文檔編號】C12N15/33GK103781901SQ201280040857
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月24日
【發(fā)明者】帕穆克·比爾賽爾, 八田靖子 申請人:復(fù)爾健有限公司