一種h3n2亞型犬流感病毒滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明還公開(kāi)了用于制備該滅活疫苗的H3N2亞型犬流感病毒株以及制備該滅活疫苗的方法，其中所述的H3N2亞型犬流感病毒株，命名為CIV-HLJ株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC?NO.8760。對(duì)本發(fā)明制備得到的犬流感滅活疫苗進(jìn)行安全性和免疫原性評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗對(duì)犬具有良好的安全性，并可以誘導(dǎo)犬體產(chǎn)生理想免疫保護(hù)效果。因此，本發(fā)明的提出為H3N2亞型犬流感疾病防治提供了一種有效的手段。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種犬流感滅活疫苗，其制備方法及由其制備得到的疫苗。屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]犬流感(Canine influenza, Cl)是由正黏病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒中的犬流感病毒(Canine influenza virus, CIV)引起的犬的一種呼吸道急性高度接觸性傳染病，多呈暴發(fā)性流行，傳播非常迅速而且廣泛。2005年，國(guó)內(nèi)首次有Cl的報(bào)道，有研究者對(duì)廣東地區(qū)Cl流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，抗體平均陽(yáng)性率為7.92% (ELISA)和6.25% (HI)，
[0003]目前流行的Cl V主要有H3N8亞型犬流感病毒和H3N2亞型犬流感病毒。國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)H3N8亞型馬流感病毒感染犬的報(bào)道。自2006年以來(lái)，在我國(guó)江蘇、廣東、北京、浙江和遼寧等地相繼發(fā)生了禽源H3N2亞型流感病毒感染犬并導(dǎo)致犬發(fā)生嚴(yán)重呼吸道疾病的事件，血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)犬群中禽源H3N2亞型犬流感病毒導(dǎo)致的犬流感的陽(yáng)性率達(dá)到10%以上。禽源H3N2CIV不僅可以感染犬，而且可以感染雪貂和貓，表明該病毒已經(jīng)跨越種間障礙，具備了感染哺乳動(dòng)物的能力。而犬作為人類(lèi)主要的伴侶動(dòng)物之一，與人之間的接觸非常密切，這也增加了人感染CIV的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]鑒于此，為避免犬流感在犬群暴發(fā)流行及對(duì)人類(lèi)的健康造成威脅，需要切實(shí)有效的防治措施。疫苗是防控病毒性傳染病的有效手段，因而研發(fā)一種擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、保護(hù)性良好的新型高效犬流感疫苗具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗，其特征在于含有滅活的保藏號(hào)為CGMCC N0.8760的H3N2亞型犬流感病毒。
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供所述H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之三是提供所述H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗在制備防治由H3N2亞型犬流感病毒引起的犬流感疾病藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0009]H3N2亞型犬流感病毒的分離與鑒定:2013年，病料采集自黑龍江省某寵物醫(yī)院呼吸道癥狀發(fā)病死亡犬，肺臟組織病料經(jīng)過(guò)研磨后，接種9-11日齡SPF雞胚分離病毒，對(duì)分離毒進(jìn)行血凝、血凝抑制、特異性鑒定及生物學(xué)鑒定，證明分離的病毒為H3N2亞型犬流感病毒，本發(fā)明所分離得到的病毒全稱(chēng)為A/Canine/Heilongjiang/Ll/2013 (H3N2)株,簡(jiǎn)稱(chēng)為CIV-HLJ 株。
[0010]本發(fā)明的一 種H3N2亞型犬流感病毒株，命名為CIV-HLJ株，分類(lèi)命名為犬流感病毒，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.8760 ;保藏時(shí)間是:2014年1月13日；保藏單位是:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。[0011]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的H3N2亞型犬流感病毒在制備H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的一種H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗，其特征在于含有滅活后的本發(fā)明所述的H3N2亞型犬流感病毒株。
[0013]優(yōu)選的，所述的H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗中還含有藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
[0014]一種制備所述的H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0015](I)將保藏編號(hào)為CGMCC N0.8760的H3N2亞型犬流感病毒株按照體積比進(jìn)行500-1500倍稀釋?zhuān)玫较♂尯蟮牟《疽海?br> [0016](2)將步驟⑴得到的稀釋后的病毒液接種9-11日齡SPF雞胚，72h收獲雞胚尿囊液，置-20°C保存，不超過(guò)6個(gè)月；
[0017](3)雞胚尿囊液中加入滅活劑，滅活后，再加入佐劑，乳化，即得。
[0018]其中，優(yōu)選的，所述的滅活劑為丙內(nèi)酯，所述的佐劑為Montanide PET GEL Α。
[0019]更優(yōu)選的，具體操作步驟為:向雞胚尿囊液加入終濃度為質(zhì)量百分比0.2%的β-丙內(nèi)酯，滅活48h，再加入終濃度為質(zhì)量百分比8%的Montanide PET GEL A，利用槳式攪拌器，在剪切速度200rpm下,乳化IOmin,即得。
[0020]對(duì)本發(fā)明制備得到的犬流感滅活疫苗進(jìn)行安全性和免疫原性評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗對(duì)犬具有良好的安全性，并可以誘導(dǎo)犬體產(chǎn)生理想免疫保護(hù)效果。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1CIV-HLJ株HA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0022]1、陰性對(duì)照；2:HA 擴(kuò)增產(chǎn)物；M:DL2000DNA Marker
[0023]圖2CIV-HLJ株NA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0024]1、陰性對(duì)照；2:NA 擴(kuò)增產(chǎn)物；M:DL2000DNA Marker
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026]實(shí)施例1本發(fā)明犬流感病毒A/Canine/Heilongjiang/Ll/2013(H3N2)株的分離鑒定
[0027]材料與方法
[0028]1、病料和雞胚
[0029]病料采集自黑龍江省某寵物醫(yī)院呼吸道癥狀發(fā)病死亡犬的肺臟組織；9_11日齡SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0030]2、病毒增殖及HA試驗(yàn)
[0031] 肺臟組織研磨后5000rpm離心10min,取上清,加入1000U雙抗,接種于9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，0.2ml/枚，37°C培養(yǎng)72h，4°C過(guò)夜，無(wú)菌收集雞胚尿囊液，分裝后，_70°C保存?zhèn)溆?。并測(cè)定其HA效價(jià)。
[0032]3、分子生物學(xué)試劑
[0033]RNA提取試劑TRIzol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMV購(gòu)自Invitrogen公司；PCR擴(kuò)增所用的Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)公司；膠回收(小量)試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。
[0034]4、載體和菌種
[0035]pMD18-T克隆載體和DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自寶生物工程(大連)公司。
[0036]5、病毒RNA的提取與cDNA的制備
[0037]采用TRIzol試劑從雞胚尿囊液提取病毒RNA ；以Uni_12: 5’ -AGCAAAAGCAGG-3’為引物，采用禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMV，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0038]6、引物設(shè)計(jì)
[0039]利用01igo6.0軟件設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增流感病毒的HA和NA基因的特異性引物，如下表I所示。
[0040]表1擴(kuò)增CIV HA和NA基因的特異性引物
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種H3N2亞型犬流感病毒株，命名為CIV-HLJ株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.8760。
2.權(quán)利要求1所述的H3N2亞型犬流感病毒在制備H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。
3.—種H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗，其特征在于含有滅活后的權(quán)利要求1所述的H3N2亞型犬流感病毒株。
4.如權(quán)利要求3所述的H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗，其特征在于還含有藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。
5.一種制備權(quán)利要求3或4所述的H3N2亞型犬流感病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將保藏編號(hào)為CGMCCN0.8760的H3N2亞型犬流感病毒株按照體積比進(jìn)行500-1500倍稀釋?zhuān)玫较♂尯蟮牟《疽海? (2)將步驟(1)得到的稀釋后的病毒液接種9-11日齡SPF雞胚，72h收獲雞胚尿囊液，置-20°C保存，不超過(guò)6個(gè)月； (3)雞胚尿囊液中加入滅活劑，滅活后，再加入佐劑，乳化，即得。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的滅活劑為β-丙內(nèi)酯，所述的佐劑為Montanide PET GEL A0
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于加入向雞胚尿囊液加入終濃度為質(zhì)量百分比0.2%的β -丙內(nèi)酯，滅活48h，再加入終濃度為質(zhì)量百分比8%的Montanide PET GEL A，利用槳式攪拌器，在剪切速度200rpm下,乳化lOmin。
【文檔編號(hào)】A61K39/145GK103937752SQ201410074928
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】劉大飛, 劉春國(guó), 程景, 張洪英, 曲連東 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所