本發(fā)明屬于檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的二重RT-PCR引物、試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

豬藍(lán)耳病又稱為豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)，其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)。自1987年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)該病以來(lái)，該病就迅速蔓延至全世界的養(yǎng)豬業(yè)中，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，豬藍(lán)耳病不僅給我國(guó)生豬業(yè)帶來(lái)了災(zāi)難性的沖擊，而且也爆發(fā)在我國(guó)周邊的國(guó)家如越南、韓國(guó)等國(guó)，可見(jiàn)豬藍(lán)耳病的流行范圍越來(lái)越大。各種品種各種年齡階段的豬均可感染藍(lán)耳病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙和一月齡以內(nèi)仔豬的呼吸道癥狀。母豬的繁殖障礙主要是妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔、死胎、木乃伊胎等，而其他豬尤其是仔豬的呼吸道癥狀主要是咳嗽、打噴嚏、呼吸困難等。OIE將其列為B類傳染病，而我國(guó)將2006年以來(lái)爆發(fā)的高致病性藍(lán)耳病列為“一類傳染病”。PRRSV根據(jù)其抗原性和基因組成特征，國(guó)際上將其分為以LV為代表的歐洲型（Ⅰ型）和以ATCC-2332為代表的北美型（Ⅱ型）。

PRRSV屬于套氏病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約15kb，含有包括ORF5a在內(nèi)的10個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORF5編碼病毒的囊膜蛋白GP5（E蛋白），即便GP5蛋白是變異最大的蛋白，但它比較保守，是病毒復(fù)制必不可少的主要結(jié)構(gòu)蛋白，免疫原性較好，能夠比其他蛋白較早的誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，且中和抗體出現(xiàn)以后，抗血清主要識(shí)別GP5蛋白，GP5蛋白還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。北美型的ORF5基因全長(zhǎng)為603bp，歐洲型的ORF5基因全長(zhǎng)為606bp，通過(guò)對(duì)ORF5基因的擴(kuò)增與分析，能夠在一定程度上反映PRRSV的特征。加之，我國(guó)歐洲型藍(lán)耳病的爆發(fā)呈現(xiàn)出愈來(lái)愈嚴(yán)重的趨勢(shì)，給藍(lán)耳病的防控帶來(lái)更一步的困難，同時(shí)也提醒我們對(duì)藍(lán)耳病的防控需要更新認(rèn)識(shí)。當(dāng)前，同一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)同一頭豬已然存在既感染歐洲型藍(lán)耳病又感染北美型藍(lán)耳病的情況，臨床上基本不能區(qū)分，給預(yù)防與治療帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)出同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的方法和試劑盒，對(duì)掌握豬藍(lán)耳病的分子流行病學(xué)、遺傳進(jìn)化、疫苗研發(fā)等方面具有重要的指導(dǎo)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于運(yùn)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、序列比對(duì)及反應(yīng)體系優(yōu)化，構(gòu)建一種用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的二重RT-PCR方法和試劑盒，實(shí)現(xiàn)北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的快速擴(kuò)增效果。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的二重RT-PCR引物，其核苷酸序列如下所示：

NA-ORF5-F: 5^，-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGC-3^，（SEQ ID NO：1）；

NA-ORF5-R:5^，- GCTGAGTACACHCCCCAAAG-3^，（SEQ ID NO：2）；

EU-ORF5-F: 5^，-ACCATYGCTTGTTTGTTCGCCAT-3^，（SEQ ID NO：3）；

EU-ORF5-R: 5^，-CTTTCTCACAGCGTATGCTCG-3^，（SEQ ID NO：4）。

一種用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的二重RT-PCR試劑盒，該試劑盒包含上述引物。

一種用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的二重RT-PCR方法，包括下列步驟：

1) 從樣品中提取病毒核酸；

2) 以核酸為模板，用上述所述的引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3) 將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，根據(jù)條帶大小確定北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的ORF5全長(zhǎng)基因序列。

優(yōu)選的，步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 step Buffer 25 μL，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F和EU-ORF5-R各1 μL，病毒核酸模板6 μL，余量水，總體積為50μL。

優(yōu)選的，步驟2）中RT-PCR反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸60s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

優(yōu)選的，步驟3）中在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，如果僅含有900bp大小的片段，則判定在待檢測(cè)樣品中擴(kuò)增出北美型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列；如果僅含有1036bp大小的片段，則判定在待檢測(cè)樣品中擴(kuò)增出歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列；如果同時(shí)含有上述兩種大小的片段，則判定在待檢測(cè)樣品中同時(shí)擴(kuò)增出歐洲型和北美型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列。

一種快速區(qū)分北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的二重RT-PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：

NA-ORF5-F： 5^，-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGC-3^，（SEQ ID NO：1）；

NA-ORF5-R： 5^，-GCTGAGTACACHCCCCAAAG-3^，（SEQ ID NO：2）；

EU-ORF5-F： 5^，-ACCATYGCTTGTTTGTTCGCCAT-3^，（SEQ ID NO：3）；

EU-ORF5-R： 5^，-CTTTCTCACAGCGTATGCTCG-3^，（SEQ ID NO：4）。

一種快速區(qū)分北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的二重RT-PCR試劑盒，該試劑盒含有上述的引物。

一種快速區(qū)分北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的二重RT-PCR檢測(cè)方法，包括下列步驟：

1)從待測(cè)樣品中提取病毒核酸；

2)以核酸為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，確定病毒類型。

優(yōu)選的，步驟2）中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 25μL，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F和EU-ORF5-R各1μL，病毒核酸模板6μL，余量水，總體積為50 μL。

優(yōu)選的，步驟2）中RT-PCR反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸60s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

優(yōu)選的，步驟3）中在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，如果僅含有900bp的片段，則判定待檢測(cè)樣品中含有北美型豬藍(lán)耳病病毒；如果僅含有1036bp的片段，則判定在待檢測(cè)樣品中含有歐洲型豬藍(lán)耳病病毒；如果同時(shí)含有上述兩種大小的片段，則判定在待檢測(cè)樣品中同時(shí)含有歐洲型和北美型豬藍(lán)耳病病毒。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明公開(kāi)了一種可以用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒ORF5全長(zhǎng)基因序列的二重RT-PCR方法和試劑盒，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)研究豬藍(lán)耳病的分子流行病學(xué)、遺傳進(jìn)化、疫苗研發(fā)等方面具有重要的指導(dǎo)意義。此外，該方法中的變性和退火溫度僅需要20s，且只需要一臺(tái)PCR儀器即可同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，也可作為北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的鑒別診斷方法，有助于豬藍(lán)耳病病毒的快速分型。

本發(fā)明二重RT-PCR引物特異性強(qiáng)，敏感性高，而且覆蓋面廣。其中NA-ORF5-F和NA-ORF5-R引物對(duì)可以最大限度的覆蓋更多的北美型豬藍(lán)耳病病毒（包括北美型豬藍(lán)耳病經(jīng)典株、變異株及疫苗株）；EU-ORF5-F和EU-ORF5-R引物對(duì)可以最大限度的覆蓋更多的歐洲型豬藍(lán)耳病病毒（包括疫苗株及野毒株）。

本發(fā)明的引物還可以用于鑒別北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒，利用二重RT-PCR檢測(cè)方法，只需要一臺(tái)PCR儀器即可同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，適用于養(yǎng)殖業(yè)快速鑒別北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒，同時(shí)也適用于科學(xué)研究不同分型的豬藍(lán)耳病病毒以及后期的疫苗研發(fā)等研究。

附圖說(shuō)明

圖1特異性試驗(yàn)結(jié)果；泳道M: DNA Marker 2000；泳道1：北美型+歐洲型PRRSV；泳道2：歐洲型PRRSV；泳道3：北美型PRRSV；泳道4：豬圓環(huán)病毒2型；泳道5：豬瘟病毒；泳道6：豬口蹄疫病毒；泳道7：豬偽狂犬病毒；泳道8：豬細(xì)小病毒；泳道9：豬庫(kù)布病毒；泳道10：豬丁型冠狀病毒；泳道11：陰性對(duì)照；

圖2 二重RT-PCR敏感性結(jié)果；

圖3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

材料和方法

北美型豬藍(lán)耳病病毒活疫苗（TJM-F92株）購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)有限公司，歐洲型豬藍(lán)耳病病毒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所分離鑒定。豬圓環(huán)病毒2型病毒毒株、豬瘟病毒毒株、豬口蹄疫病毒毒株、豬偽狂犬病毒毒株、豬細(xì)小病毒毒株、豬庫(kù)布病毒毒株、豬丁型冠狀病毒毒株、歐洲型和北美型豬藍(lán)耳病病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所制備保存。

主要試劑

DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen，PCR試劑購(gòu)自北京天根公司和TaKaRa公司，DNA Marker 2000購(gòu)自TaKaRa公司。

實(shí)施例1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的基因組序列，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，其中NA-ORF5-F和NA-ORF5-R引物對(duì)可以最大限度的覆蓋更多的北美型豬藍(lán)耳病病毒（包括北美型豬藍(lán)耳病經(jīng)典株、變異株及疫苗株）；EU-ORF5-F和EU-ORF5-R引物對(duì)可以最大限度的覆蓋更多的歐洲型豬藍(lán)耳病病毒（包括疫苗株及野毒株）。其堿基序列如下所示。

NA-ORF5-F: 5^，-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGC-3^，（SEQ ID NO：1）；

NA-ORF5-R:5^，- GCTGAGTACACHCCCCAAAG-3^，（SEQ ID NO：2）；

EU-ORF5-F: 5^，-ACCATYGCTTGTTTGTTCGCCAT-3^，（SEQ ID NO：3）；

EU-ORF5-R: 5^，-CTTTCTCACAGCGTATGCTCG-3^，（SEQ ID NO：4）。

實(shí)施例2 二重RT-PCR檢測(cè)方法

1）RNA 的提取

按照Axygen公司的DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒核酸的提取。

2）二重RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以臨床分離并鑒定為北美型和歐洲型混合感染的陽(yáng)性豬藍(lán)耳病病毒核酸為二重RT-PCR的模板，建立二重RT-PCR方法。采用50μL RT-PCR反應(yīng)體系：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 step Buffer 25 μL，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F和EU-ORF5-R各1 μL，病毒核酸模板6 μL，RNase Free ddH₂O 14 μL，總體積為50μL。

RT-PCR反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸60s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。

結(jié)果觀察：取50 μL RT- PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

實(shí)施例3 特異性試驗(yàn)

按照實(shí)施例2的方法，利用二重RT-PCR方法對(duì)北美型和歐洲型混合感染的PRRSV及豬圓環(huán)病毒2型病毒、豬瘟病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬庫(kù)布病毒、豬丁型冠狀病毒進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見(jiàn)圖1。泳道M: DNA Marker 2000；泳道1：北美型+歐洲型PRRSV；泳道2：歐洲型PRRSV；泳道3：北美型PRRSV；泳道4：豬圓環(huán)病毒2型；泳道5：豬瘟病毒；泳道6：豬口蹄疫病毒；泳道7：豬偽狂犬病毒；泳道8：豬細(xì)小病毒；泳道9：豬庫(kù)布病毒；泳道10：豬丁型冠狀病毒；泳道11：陰性對(duì)照。

由圖1可知：采用優(yōu)化好的二重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)北美型和歐洲型混合感染的PRRSV陽(yáng)性核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果獲得大小約為900bp及1036bp的片段，與測(cè)序結(jié)果900bp和1036bp的片段相吻合。而豬圓環(huán)病毒2型病毒、豬瘟病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬庫(kù)布病毒、豬丁型冠狀病毒等核酸擴(kuò)增后未呈現(xiàn)條帶，表明該方法具有較好的特異性。

實(shí)施例4 敏感性試驗(yàn)

分別測(cè)定北美型和歐洲型PRRSV陽(yáng)性重組質(zhì)粒的模板濃度，然后進(jìn)行倍比稀釋，來(lái)測(cè)定該方法的敏感性。結(jié)果見(jiàn)圖2，其中泳道M：DNA Marker 2000；泳道1-9：陽(yáng)性質(zhì)粒按照10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍倍比稀釋結(jié)果；泳道10：陰性對(duì)照。

經(jīng)檢測(cè)，優(yōu)化后的二重RT-PCR對(duì)北美型和歐洲型PRRSV的敏感性分別為23.71 pg/ml和9.17pg/ml。

實(shí)施例5 重復(fù)性擴(kuò)增試驗(yàn)

對(duì)10份鑒定為北美型和歐洲型單一或混合感染的PRRSV陽(yáng)性核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示均能準(zhǔn)確的得出擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)一步經(jīng)核酸測(cè)序，確定上述結(jié)果完全正確，準(zhǔn)確率為100%。

實(shí)施例6 臨床樣品擴(kuò)增試驗(yàn)

對(duì)用已經(jīng)確定豬藍(lán)耳病病毒類型的21份臨床樣本其中的11份進(jìn)行ORF5全長(zhǎng)基因擴(kuò)增，結(jié)果如圖3，其中泳道M: DNA Marker 2000， 泳道1、2、3、4為確認(rèn)僅感染北美型PRRSV的樣品，僅擴(kuò)增出約為900bp的片段；泳道5、6、7、8為確認(rèn)僅感染歐洲型PRRSV的樣品，僅擴(kuò)增出約為1036bp的片段；泳道9、10、11為確認(rèn)既感染北美型又感染歐洲型PRRSV的樣品，同時(shí)擴(kuò)增出約為900bp和1036bp的片段；泳道12為陰性對(duì)照。與預(yù)期結(jié)果完全相符，因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)得到的引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F、EU-ORF5-R可以很好的擴(kuò)增臨床樣品中感染的豬藍(lán)耳病病毒的ORF5全長(zhǎng)基因序列，成功構(gòu)建了能夠快速擴(kuò)增豬藍(lán)耳病病毒北美型和歐洲型ORF5全長(zhǎng)基因序列的雙重RT-PCR方法。此外，通過(guò)擴(kuò)增，也可以區(qū)分北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒，用于臨床上病毒的鑒定。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所

<120> 一種用于同時(shí)擴(kuò)增北美型和歐洲型豬藍(lán)耳病病毒的二重RT-PCR引物、試劑盒

和方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttttagcct gtctttttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgagtaca chccccaaag 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accatygctt gtttgttcgc cat 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttctcaca gcgtatgctc g 21