子宮內(nèi)膜癌的miRNA診治標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了子宮內(nèi)膜癌的miRNA診治標(biāo)志物，該miRNA標(biāo)志物是miRNA?1266。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了miRNA?1266與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制miRNA?1266的表達(dá)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡，為子宮內(nèi)膜癌的分子治療提供了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
子宮內(nèi)膜癌的m i RNA診治標(biāo)志物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及子宮內(nèi)膜癌的miRNA診治標(biāo)志物，具體的該miRNA 診治標(biāo)志物為miRNA-1266。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer,EC)又稱子宮體癌，是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組 上皮性惡性腫瘤，以來(lái)源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見。為女性生殖道三大惡性腫瘤之一， 占女性全身惡性腫瘤7%，占女性生殖道惡性腫瘤20%-30%。其死亡率占女性全身腫瘤 3%，居第6位。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病與生活方式密切相關(guān)，發(fā)病率在各地區(qū)有差異，在北美和 歐洲其發(fā)生率僅次于乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸腫瘤，高居女性生殖系統(tǒng)癌癥的首位。在我國(guó)，隨 著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)條件的改善，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率亦逐年升高，目前僅次于宮頸癌，居 女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位。子宮內(nèi)膜癌的高發(fā)年齡為60-65歲，其發(fā)病率在世界范圍 內(nèi)呈年輕化趨勢(shì)，并且45歲以下患者逐年增多。但由于診斷時(shí)多數(shù)患者的病變尚局限于子 宮，因此5年生存率較高。
[0003] 子宮內(nèi)膜癌與其他惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相似，是一個(gè)復(fù)雜而繁瑣的過(guò)程。因子宮 內(nèi)膜的不典型性增生與早期子宮內(nèi)膜癌在病理上較難區(qū)分，所以目前子宮內(nèi)膜癌的致病機(jī) 制尚未明確，主要考慮與癌基因、抑癌基因的異常表達(dá)有關(guān)。除雌激素的刺激外，癌基因激 活和抑癌基因失活均可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。任何癌癥的發(fā)生都是一個(gè)緩慢的過(guò)程， 這個(gè)過(guò)程可能涉及多個(gè)基因的改變、多種因素的參與、多個(gè)階段的累積，總之就是一個(gè)細(xì)胞 生物學(xué)過(guò)程由正常轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓?。?xì)胞的這種基因水平的變化往往會(huì)對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和 功能造成影響，使其自身的形態(tài)及功能發(fā)生不可逆性改變，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。它的發(fā) 生、發(fā)展和演變是復(fù)雜且漫長(zhǎng)的過(guò)程，相同基因可能在不同階段起不同的作用，不同基因可 能在同一階段起相同的作用。其中基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要途徑就是通過(guò)miRNA對(duì)其轉(zhuǎn)錄 后水平的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0004] miRNA是一種由19~22個(gè)成熟核苷酸組成的小分子非編碼RNA(non-coding RNA molecules，ncRNAs)，于1993年由Ambros課題組在研究線蟲時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。迄今為止，miRNA在 所有動(dòng)植物中都存在，約占基因組的4%。它們參與調(diào)節(jié)生命的基本過(guò)程，如器官組織的發(fā) 生、發(fā)育等。此外，基于目標(biāo)基因功能的基礎(chǔ)上，miRNA對(duì)癌癥具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，它們可 以作為腫瘤抑制因子，也可以作為致瘤因子。截止2013年6月，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有24521種miRNA，其 中在人類身上發(fā)現(xiàn)2578種。通過(guò)結(jié)合到目標(biāo)mRNA的3'UTR(非編碼區(qū)），miRNA通過(guò)RNA干擾 (RNAi)途徑使轉(zhuǎn)錄后基因在細(xì)胞中沉默，這是一種不同于經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)基因沉默機(jī)制 的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制。miRNA已被證明在生物的正常生長(zhǎng)中起作用，并在癌癥中特異性表 達(dá)，它還與大腦、心臟和其他器官疾病相關(guān)。
[0005] miRNA在女性生殖系統(tǒng)腫瘤方面的研究尚處于初級(jí)階段，目前研究主要集中于上 皮性卵巢癌中的表達(dá)，在子宮內(nèi)膜癌方面的研究較少。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，性激素的分泌可 以對(duì)子宮內(nèi)膜癌中的miRNA的表達(dá)產(chǎn)生影響，而miRNA的異常表達(dá)可以造成子宮內(nèi)膜癌的發(fā) 生、發(fā)展。近年來(lái)關(guān)于miRNA的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，不同拷貝數(shù)的miRNA檢測(cè)的可行性使得相 關(guān)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的診斷成為可能。
[0006] 檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平可以為癌癥的臨床診斷提供參考。目前關(guān)于miRNA在子宮內(nèi) 膜癌中的差異性表達(dá)研究較少，尋找和鑒定與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生相關(guān)的miRNA為miRNA的臨床 診斷和治療提供基礎(chǔ)，有助于子宮內(nèi)膜癌的診斷和預(yù)后評(píng)估達(dá)到新水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種miRNA診治標(biāo)志物，該 診治標(biāo)志物為miRNA-Ι 266。
[0008] 本發(fā)明的目的之二，提供一種診斷產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的早期診斷。
[0009] 本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和治療藥物，實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的精準(zhǔn)分子 治療。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了 miRNA-1266或其同源物在制備診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步，所述產(chǎn)品通過(guò)測(cè)定miRNA-1266或其同源物的表達(dá)水平以診斷子宮內(nèi)膜 癌。
[0013] 進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括通過(guò)使用qRT-PCR、印記雜交、原位雜交、陣列雜交、基因芯 片或新一代測(cè)序來(lái)檢測(cè)miRNA-1266或其同源物的水平以診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品。
[0014] 其中，miRNA-1266或其同源物在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)，與對(duì)照相比，當(dāng)患者 子宮內(nèi)膜組織中的miRNA-1266顯著升高時(shí)，可以判斷患者患子宮內(nèi)膜癌。
[0015] 本發(fā)明提供了一種診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中miRNA-1266 或其同源物的水平來(lái)診斷子宮內(nèi)膜癌。
[0016] 進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、陣列或試劑盒。其中，所述芯片包括固相載體；以及固 定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對(duì)應(yīng)于上面所述的 miRNA-1266的部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測(cè)上面所述的miRNA-1266的表達(dá)水 平的試劑。
[0017] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)miRNA-1266表達(dá)水平的試劑包括針對(duì)miRNA-1266的引物和/或 探針。所述試劑還包括針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的診斷子宮內(nèi)膜癌miRNA的引物和/或探 針。將多種miRNA的檢測(cè)引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過(guò)檢測(cè)多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合 診斷子宮內(nèi)膜癌的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"樣本"不僅包括生物體試樣，例如細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、 淋巴液等）、消化液、咳痰、肺胞氣管支清洗液、尿、便，也包括由這些生物體試樣得到的核酸 提取物(基因組DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制備的cDNA制備物或cRNA制備物等） 或蛋白質(zhì)提取物。另外，也可以對(duì)上述試樣實(shí)施福爾馬林固定處理、醇固定處理、凍結(jié)處理 或石蠟包埋處理。優(yōu)選的所述樣本為組織。
[0019] 本發(fā)明提供了 miRNA-1266或其同源物在制備治療子宮內(nèi)膜癌藥物中的應(yīng)用。
[0020]進(jìn)一步，所述藥物包含miRNA-1266或其同源物的抑制劑。
[0021] 進(jìn)一步，所述miRNA-1266的抑制劑是miRNA-1266或其同源物的反義寡核苷酸或拮 抗劑。根據(jù)miRNA-1266序列設(shè)計(jì)出它的特異性反義寡核苷酸，將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)移到人體 內(nèi)后，它們能夠明顯下調(diào)miRNA-1266的表達(dá)。反義miRNA可包括總計(jì)5-100或10-60個(gè)核苷 酸。反義 miRNA 還可包括總計(jì)為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。優(yōu)選的，反義11^1?祖的序列可包括( &)至少5個(gè)與 miRNAS'端完全相同的核苷酸以及至少5-12個(gè)與所述miRNAS'端靶位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)完全互補(bǔ) 的核苷酸，或(b)至少5-12個(gè)與所述miRNA 3'端祀位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)完全互補(bǔ)的核苷酸
[0022] 根據(jù)miRNA-1266序列設(shè)計(jì)出它的詰抗劑，詰抗劑是經(jīng)過(guò)特殊標(biāo)記與化學(xué)修飾的單 鏈小RNA，將拮抗劑轉(zhuǎn)移到人體后，能夠高效阻斷miRNA-1266的表達(dá)，下調(diào)miRNA-1266表達(dá) 水平。
[0023]本發(fā)明提供了一種治療子宮內(nèi)膜癌的藥物，所述藥物包括包含miRNA-1266或其同 源物的抑制劑。所述的miRNA-1266抑制劑能夠抑制miRNA-1266的表達(dá)或者能夠抑制miRNA-1266 的功能 。所述 miRNA-1266 抑制劑的抑制靶標(biāo)不限于 miRNA-1266 本身， 還包括 miRNA-1266的上下游，例如：編碼miRNA-1266的基因組序列，miRNA-1266靶基因、調(diào)控miRNA-1266 的蛋白或者基因。
[0024] 進(jìn)一步，miRNA-1266抑制劑包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。
[0025]優(yōu)選的，所述抑制劑是miRNA-1266或其同源物的反義寡核苷酸或拮抗劑。
[0026] 進(jìn)一步，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括但不限于:稀釋劑、 緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤(rùn) 劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。
[0027] 所述藥物可以制成包括但不限于顯微注射劑、適于轉(zhuǎn)染的劑型、注射液、片劑、粉 劑、粒劑、膠囊劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。對(duì)于固體藥 物，可使用常規(guī)的無(wú)毒性固體藥學(xué)上可接受的載體例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂 酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服給藥的固體藥物可 包含上列的任何載體和賦形劑和10-95%，優(yōu)選25%-75%的至少一種miRNA-1266基因產(chǎn)物 (或至少一種包含編碼它們的序列的核酸）。用于氣霧劑(吸入)給藥的藥物組合物可包含封 裝在上述脂質(zhì)體中的按重量計(jì)算0.01 %-20%、優(yōu)選按重量計(jì)算1 %-10%的至miRNA-1266 基因產(chǎn)物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和噴射劑。當(dāng)需要時(shí)也可包含載體，如 用于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。
[0028] 本發(fā)明的藥物可以進(jìn)一步包含一種或多種抗癌劑。組合物包含至少一種miRNA-1266 基因產(chǎn)物 (或至少一種包含編碼它們的序列的核酸) 和至少一種化療劑。適用于本發(fā)明 的方法的化療劑，包括但不限于，DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定 劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-C0A抑制劑， CDK抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈 螺旋DNA，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。本發(fā)明的組合物試劑包括但不 限于，阿糖胞苷、甲氨喋呤、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、多柔比星、順鉑、地塞米松、環(huán)磷酰胺、沙可 來(lái)新、甲基亞硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春堿、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素 C、過(guò)氧 化氫、奧沙利鉑、伊立替康、托泊替康、亞葉酸、卡莫司汀、鏈佐星，CPT-11、泰素、他莫昔芬、 達(dá)卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、1 -β-D-阿糖呋喃胞嘧啶、伊馬替尼、氟達(dá)拉濱、多西他賽。 [0029] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述miRNA-1266是成熟miRNA-1266,核苷酸序列如 序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0030] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的miRNA-1266包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，"變 體"是指，與對(duì)應(yīng)野生型miRNA基因產(chǎn)物具有少于100%的同一性并且具有對(duì)應(yīng)野生型miRNA 基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)生物活性的miRNA。此類生物活性的實(shí)例包括但不限于，與子宮內(nèi)膜 癌發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞過(guò)程(例如，細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡）的抑制。這些變體包括物種 變體和由于miRNA基因的一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換、缺失、插入)而產(chǎn)生的變體。在某些實(shí) 施方案中，變體與對(duì)應(yīng)野生型11^1?財(cái)基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、 95%、98%或99%的同一性。其顯示完整miRNA-1266核酸分子相同的功能，它們可能通過(guò)核 苷酸殘基的缺失、置換或者插入而突變。
[0031] 本領(lǐng)域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保 護(hù)性堿基，如TT，也可對(duì)miRNA堿基進(jìn)行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知，在不影響miRNA-1266功能的條件下，對(duì)miRNA-1266進(jìn)行堿基修飾或者在兩端增加 堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明的miRNA-1266核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miRNA-1266 主要呈單鏈形式，而miRNA-1266前體是部分自互補(bǔ)的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的核酸分子 可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0033] 根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的核酸序列，可以生成用于給定miRNA基因產(chǎn)物的RNA印記 雜交的合適探針，包括但不限于，與目標(biāo)miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、 90%、95%、98%、99%或完全互補(bǔ)的探針。標(biāo)記的DNA和RNA采用常規(guī)方法制備，例如核酸探 針用下述物質(zhì)標(biāo)記，如放射性核素3!1、32?、33?、14(：或353，重金屬，能起到標(biāo)記配體的特異 性結(jié)合對(duì)成員功能的配體如生物素、抗生物素蛋白或抗體等，熒光分子，化學(xué)發(fā)光分子、酶 等。
[0034]通過(guò)切口平移法或隨機(jī)引物法，可以將探針標(biāo)記成高比放射性，后者是從單鏈DNA 或從RNA模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的選擇方法。例如，通過(guò)根據(jù)切口平移法用 高效放射性的核苷酸替換現(xiàn)有的核苷酸，可以制備比放射性大大超過(guò)l〇8cpm/微克的32P-標(biāo)記的核酸探針。然后通過(guò)使雜交的濾膜曝光于照相膠片，可以進(jìn)行雜交的放射自顯影檢 測(cè)。對(duì)雜交的濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描，會(huì)提供miRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的精確測(cè) 量。
[0035]本發(fā)明所述的寡核苷酸探針還可包括針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的可用于診斷子 宮內(nèi)膜癌的miRNA的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢測(cè)探針放置在同一芯片上通過(guò)檢測(cè)多 種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷子宮內(nèi)膜癌的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上面所述試劑 還包括針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的診斷子宮內(nèi)膜癌miRNA的引物和/或探針。將多種miRNA 的檢測(cè)引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過(guò)檢測(cè)多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷子宮內(nèi)膜癌 的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0036]所述的mi RNA芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如，如 果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸 探針配制成溶液，然后采用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序列或陣列， 然后通過(guò)放置過(guò)夜來(lái)固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修飾，則其制 備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》；J.L.erisi， V.R.Iyer?P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997;278:680和馬立人，蔣中華主編·生物芯 片.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000，1-130。
[0037] 本發(fā)明的miRNA-1266可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá)miRNA-1266的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。本發(fā)明的可藥用載體可包括但不限于:病毒、脂質(zhì)體、 納米顆?；蚓酆衔锛捌淙我饨M合。相關(guān)的遞送載劑可包括但不限于:脂質(zhì)體、生物相容性聚 合物(包括天然聚合物和合成聚合物）、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、無(wú)機(jī)(包 括金屬)顆粒、以及細(xì)菌或病毒(例如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒）、噬菌體、黏粒或質(zhì)粒 載體。
[0038] 病毒載體可以是能夠接受miRNA基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；，包括但不 限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘 苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。可通過(guò)用來(lái)自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假 型化載體或通過(guò)置換不同的病毒衣殼蛋白（如果合適)來(lái)改變病毒載體的趨向性。
[0039] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3.0表達(dá)載體、pcDNA3.1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、 pTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0040] 可以表達(dá)miRNA-1266的DNA片段可以通過(guò)如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中 (http: //microrna. sanger · ac .uk/sequences/)尋找miRNA-1266在基因組上的位置及具體 序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-1266初始miRNA的位置，在miRNA-1266初始miRNA位 置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增引物中間的序列即可獲得表達(dá)miRNA-1266的DNA片段。
[0041 ]在本發(fā)明中，所述的"反義寡核苷酸"還包括采用如基于核酸鎖或核酸鏈骨架修飾 技術(shù)等手段獲得的經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更 佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩(wěn)定性、活性或治療效果。核酸鎖（1 〇 c ke d nu c 1 e i c acid，LNA)通常是指通過(guò)一個(gè)亞甲基橋?qū)⒑颂堑?'氧原子和4'碳原子連接起來(lái)的修飾技 術(shù)。基于核酸鏈骨架的修飾技術(shù)發(fā)展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改 善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈 硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將DNA骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可 抵抗核酸酶降解。應(yīng)理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都 包含在本發(fā)明中。
[0042]在本發(fā)明中，"陣列"或"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質(zhì)上，所述雜交陣 列原件諸如聚核苷酸探針（例如寡核苷酸）或結(jié)合劑（例如抗體）。所述基質(zhì)可以是固體基 質(zhì)，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纖維光學(xué)粘結(jié)劑或半固態(tài)基質(zhì)，例如硝酸纖維素膜。核 苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微陣列可從產(chǎn)生自已知miRNA序列的基因-特 異的寡核苷酸探針來(lái)制備。陣列可含有每個(gè)miRNA的2種不同的寡核苷酸探針，一種含有活 性的成熟序列，而另一種特異于miRNA的前體。陣列還可含有對(duì)照，諸如與人類直向同源物 僅幾個(gè)堿基不同的一種或多種小鼠序列，其可作為雜交嚴(yán)緊條件的對(duì)照。來(lái)自兩個(gè)物種的 tRNA也可印在微芯片上，提供了特異雜交的內(nèi)部、相對(duì)穩(wěn)定的陽(yáng)性對(duì)照。非特異雜交的一個(gè) 或多個(gè)適當(dāng)?shù)膶?duì)照也可包括于微芯片上。
[0043] 可通過(guò)適合將本發(fā)明所述藥物遞送至受試者的癌細(xì)胞的任何方法對(duì)受試者施用 抑制miRNA-1266表達(dá)的化合物。例如，可通過(guò)適合于用這些化合物或用包含編碼這些化合 物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法來(lái)施用抑制mi RNA-1266表達(dá)的化合物。優(yōu)選的， 用包含抑制miRNA-1266基因表達(dá)的化合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0044] 用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)熟知，包括例如核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或前核 的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或通過(guò)親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的核酸遞送、粒子 加速，磷酸鈣沉淀和通過(guò)病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
[0045] 可通過(guò)任何合適的腸內(nèi)或胃腸外給藥途徑對(duì)受試者施用抑制miRNA-1266表達(dá)的 化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)給藥途徑包括例如口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的胃腸外 給藥途徑包括例如血管內(nèi)給藥(如至脈管系統(tǒng)的靜脈內(nèi)快速注射、靜脈輸注、動(dòng)脈內(nèi)快速濃 注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和導(dǎo)管滴注）、組織外周和組織內(nèi)注射(如瘤周和瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射或 視網(wǎng)膜下注射）、皮下注射或沉積、對(duì)目的組織的直接施用如通過(guò)導(dǎo)管或其它安裝裝置(如 視網(wǎng)膜彈丸劑或栓劑或包含多孔、無(wú)孔或凝膠狀材料的植入體）以及吸入。優(yōu)選的給藥途徑 是注射、輸注和直接至腫瘤的注射。
[0046] 本發(fā)明所述藥物可以單獨(dú)施用或者與其他能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的藥物進(jìn)行組合 施用。施用有效量的miRNA-1266基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段，以便受試者中 癌細(xì)胞的增殖被抑制。
[0047] miRNA基因產(chǎn)物的"生物活性片段"是指，具有對(duì)應(yīng)野生型miRNA基因產(chǎn)物的一個(gè)或 多個(gè)生物活性的miRNA基因產(chǎn)物的RNA片段。如上文中所述，此類生物活性的實(shí)例包括但不 限于，子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞增殖過(guò)程的抑制。在某些實(shí)施方案中，生物活性片段在長(zhǎng)度上為至 少約5、7、10、12、15或17個(gè)核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，可將分離的miRNA基因產(chǎn)物與一種 或多種另外的抗癌治療組合來(lái)給受試者施用。適當(dāng)?shù)目拱┲委煱ǖ幌抻?，化學(xué)療法、放 射療法以及組合(例如，放化療）。
[0048]在本發(fā)明中，可將miRNA-1266基因產(chǎn)物作為裸RNA與遞送試劑一起作為核酸(如重 組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用，所述核酸包含表達(dá)miRNA-1266基因產(chǎn)物的序列。遞送試 劑可以是親脂試劑、聚陽(yáng)離子、脂質(zhì)體等。miRNA-1266基因產(chǎn)物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載 體以及用于遞送此類質(zhì)粒和載體至癌細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
[0049]脂質(zhì)體用于將miRNA-1266基因產(chǎn)物（或包含編碼它們的序列的核酸）遞送至受試 者。脂質(zhì)體可以增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期。可從標(biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)(其通常 包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體。通常，通 過(guò)考慮入目的脂質(zhì)體的大小和血流中直追半衰期等因素，指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。
[0050] 用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向細(xì)胞的配體分子。結(jié)合癌細(xì)胞中普遍存 在的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。還可對(duì)用于脂質(zhì)體進(jìn)行修 飾，以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。此類修飾的脂質(zhì)體具有存在于表面 上或整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的調(diào)理作用抑制部分。優(yōu)選的，脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用抑制部分 和配體兩者。
[0051] 適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有500至約40000道爾頓和優(yōu)選 約20000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙 二醇(PPG)衍生物如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯;合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚 N-乙烯基吡咯酮;線性的、分支的或樹狀聚酰胺-胺;聚丙烯酸;多元醇如羧基或氨基化學(xué)連 接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂。此外調(diào)理作用抑制性聚合物可以是PEG與 多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。調(diào)理作用抑制性聚合物 也可以是包含氨基酸或羧酸如半乳糖醛酸、葡萄醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng) 氨酸、海藻酸、角叉菜膠的天然多糖;氨化多糖或寡糖;羧化多糖或低聚糖如與碳酸的衍生 物反應(yīng)，獲得羧基的連接。優(yōu)選的，調(diào)理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。
[0052]本發(fā)明的藥物組合物包含對(duì)核酸酶的降解具有抗性的至少一種miRNA-1266基因 產(chǎn)物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地合成對(duì)核酸酶具 有抗性的核酸，如通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)在2 '位置被修飾的核糖核苷酸摻入miR基因產(chǎn)物。合適 的2'-修飾的核糖核苷酸包括在2'位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核 苷酸。
[0053] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"治療"的目標(biāo)不以治愈為目的，而是減緩(減少)靶定的病理狀 況或病癥或防止復(fù)發(fā)。如果接受治療有效量的治療劑之后，患者成功地被"治療"，患者顯示 出可觀測(cè)到的和/或可度量的一種或多種特定疾病的跡象和癥狀的減少或消失。例如，癌細(xì) 胞數(shù)目顯著減少或癌細(xì)胞消失，腫瘤尺寸減小;抑制（即在某種程度上減緩，及優(yōu)選地停止） 腫瘤轉(zhuǎn)移;某種程度上抑制腫瘤生長(zhǎng);使在一定程度上減少和/或減輕與特定癌癥相關(guān)聯(lián)的 一種或多種癥狀的時(shí)間增加;減少的發(fā)病率和死亡率，以及改善生活質(zhì)量。疾病的跡象或癥 狀的減輕能夠?yàn)榛颊吒兄Ｖ委熆梢詫?shí)現(xiàn)完全反應(yīng)一定義為癌癥的所有跡象消失，或部分 反應(yīng)一腫瘤尺寸減小，優(yōu)選減小的比例超過(guò)50%、更優(yōu)選75%?；颊咭脖灰暈榈玫街委煟?果患者感受到疾病穩(wěn)定。在一些實(shí)施例中，治療劑的治療是有效的，治療結(jié)果是患者在治療 后具有3個(gè)月無(wú)病狀態(tài)，優(yōu)選6個(gè)月，更優(yōu)選1年、甚至更優(yōu)選2年或更長(zhǎng)時(shí)間。評(píng)估成功治療 和改善疾病的這些參數(shù)易于測(cè)量，通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)具有適當(dāng)技能的醫(yī)生所熟悉的常規(guī)方法進(jìn) 行。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"miRNA基因產(chǎn)物"可以是任何從miRNA基因轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物，包括初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物、初級(jí)m i RNA、pr e_m i RNA、m i RNA* 或成熟m i RNA 〇
[0055] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0056] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種子宮內(nèi)膜癌的診治標(biāo)志物-miRNA-1266,通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物 的表達(dá)水平，可以判斷受試者是否患有子宮內(nèi)膜癌。
[0057] 本發(fā)明提供了一種診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的早期診斷。
[0058]本發(fā)明提供了一種治療子宮內(nèi)膜癌的藥物，所述藥物可以在分子層面上對(duì)患者實(shí) 現(xiàn)個(gè)性化治療。
【附圖說(shuō)明】
[0059]圖1顯示利用QPCR檢測(cè)miRNA-Ι 266在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況；
[0060] 圖2顯示miRNA-1266抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miRNA-1266表達(dá)的抑制作用；
[0061 ] 圖3顯示CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-1266對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響
【具體實(shí)施方式】
[0062]下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0063] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0064] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0065] 實(shí)施例1與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的miRNA的篩選
[0066] 1、樣本獲取:各收集10例正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織。上述所有標(biāo)本的 取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。
[0067] 2、樣本總RNA的提取
[0068] 使用QIAGEN公司的組織RNA提取試劑盒提前總RNA。具體步驟如下：
[0069] 1)在較少RNase干擾的清潔區(qū)，使用含適量液氮的研缽稱取組織樣本約20mg，用杵 棒研磨至粉末狀；
[0070] 2)將樣本轉(zhuǎn)移到一個(gè)不含RNA酶的2ml的離心管中；
[0071 ] 3)加入300μ1 Lysis solution，置于勾衆(zhòng)器內(nèi)，充分研磨l_5min;
[0072] 4)1200(^，4°(：，離心1〇1^11，轉(zhuǎn)移上清至新的1.51111的離心管中；
[0073] 5)加入600μ1 RNase-Free Water，用游禍器混勾；
[0074] 6)加入20μ1蛋白酶K，在55°C水浴鍋中溫浴15min，不斷渦旋混勻；
[0075] 7) 14000g，室溫，離心lmin，使細(xì)胞碎片沉淀于離心管底部，取上清轉(zhuǎn)移到另外一 個(gè)不含RNA酶1.5ml的離心管中；
[0076] 8)加入450μ1的95%乙醇，渦旋混勻；
[0077] 9)取650μ1含乙醇的裂解液加到離心柱中，14000g離心lmin;棄下層，將柱子重新 置于收集管中；
[0078] 10)依照裂解液的容量，重復(fù)步驟9);
[0079] 11)加入400μ1 Wash solution，14000g離心2min;棄下層，將柱置于一新的收集管 中；
[0080] 12)加入100μΙ Enzyme Incubation Buffer和15μ1 DNase I，14000g離心lmin，將 收集管中的溶液重新移入柱中，室溫放置15min;
[0081 ] 13)加入400μ1 Wash solution，14000g離心lmin，棄下層，將柱子重新置于收集管 中；
[0082] 14)加入400μ1 Wash so lut ion，14000g離心2min，棄收集管，把柱子放入 1 · 7mlElution 管中；
[0083] 15)加入30μ1 Elution Buffer，200g離心2min，使溶液充分與柱結(jié)合；
[0084] 16)14000g離心lmin，將RNA使用無(wú) RNA去離子水溶解，待用。
[0085] 3、RNA樣品的質(zhì)量分析(NanoDroplOOO分光光度計(jì)）
[0086] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品，RNA-seq測(cè)序的樣品要求:0D260/0D280為 1·8_2·2 〇
[0087] 將上述提取的R N A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，A g i 1 e n t T e c h η ο 1 0 g i e S 2100BioanalyZer檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，在凝膠成像儀上觀測(cè)、拍照，保存圖像，一般認(rèn)為28S: 18S彡2可以初步判定總RNA質(zhì)量較好。
[0088] 4、miRNA的提取和標(biāo)記
[0089] 1)用Ambion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提獲得miRNA，具體操作按照相應(yīng)說(shuō)明書。 樣品用T4RNA連接酶標(biāo)記步驟依照Thomson的方法。miRNA標(biāo)記方法大致如下：1.4yg miRNA 和500ng 5 ' -磷酸鹽-胞啼啶-尿啼啶cy3_3 '（Dharmacon，Chicago，USA)及2單位T4RNA ligase(NEB，Ipswich，USA)，于4°C孵育2小時(shí)。每份miRNA樣品均設(shè)等量的相應(yīng)陰性對(duì)照。 [0090] 2)標(biāo)記的RNA用0.3M醋酸鈉和2.5倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，再用15μ 1含3 X SSC、 0.2%303和15%甲酰胺的雜交液重懸，所有的雜交重復(fù)兩次，雜交用1^代6巧1丨？了1化^6， PA USA)以保證雜交液在芯片和蓋片之間均勻流動(dòng)。
[0091 ] 3)將雜交室放在雜交儀13：[0]\^161^]\01上（0&。;^&113;[0(]〇印，136；[」;[即，01；[仙）于42 °C水浴過(guò)夜，用洗液洗兩遍。
[0092] 5、miRNA 芯片操作：
[0093] miRNA芯片，采用博奧生物有限公司的miRNA表達(dá)譜芯片（單通道芯片），按照說(shuō)明 書的指示進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)。
[0094] 6、結(jié)果：
[0095] 分析miRNA芯片表達(dá)譜的檢測(cè)結(jié)果，可知miRNA-1266在子宮內(nèi)膜癌患者子宮內(nèi)膜 癌組織中，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，miRNA-1266的水平顯著升高。
[0096] 實(shí)施例2 QPCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA-1266
[0097] 1、根據(jù)miRNA芯片的檢測(cè)結(jié)果選擇miRNA-1266進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1 中的樣本收集方式選擇子宮內(nèi)膜癌組織本和正常子宮內(nèi)膜組織樣本各60例。
[0098] 2、RNA提取過(guò)程同實(shí)施例1。
[0099] 3、逆轉(zhuǎn)錄：
[0100] 1)將10pg-lyg 的總 RNA 模板與 2μ1 10X 緩沖液、2μ1 dATP(10mM)、0.5ylpolyA 多聚 酶、0·5μ1核糖核酸酶(RNase)抑制劑和無(wú)核糖核酸酶水(RNase freewater)混合，體積最后 為 20μ1，37Γ 孵育 lh。
[0101] 2)反應(yīng)管中加入ΙμL 0.5ygAU Oligo(dT)特異性RT引物，70°C孵育5min。
[0102] 3)立即冰上孵育至少2m i η，打斷RNA和引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0103] 4)將上述20μ1反應(yīng)混合物與4μ1 5X緩沖液、ΙμL dNTP(10mM)，0.5yl M-MLV逆轉(zhuǎn) 錄酶，0.5μ1核糖核酸酶（RNase)抑制劑，10μ1 polyA反應(yīng)混合液和4μ1無(wú)核糖核酸酶水 (RNase free water)混合，42°C孵育lh〇
[0104] 4、QPCR 反應(yīng)：
[0105] 1)引物設(shè)計(jì)
[0106] 擴(kuò)增 miRNA-Ι 266的引物
[0107] 正向引物：CCTCAGGGCTGTAGAACAGGGCT(SEQ ID N0.2)
[0108] 反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO·3)
[0109] 擴(kuò)增U6snRNA的引物
[0110] 正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID N0.4)
[0111] 反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID N0.5)
[0112] 2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0113] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0114] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0115]
[0116] 3汗0?反應(yīng)條件：95°(：1〇11^11，（95°(：158,6〇1€6〇8)\45個(gè)循環(huán)。以5￥81?6代611作為 熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，以U6snRNA作為參照基因，通 過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△△ CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0117] 5、結(jié)果
[0118] 如圖1所示，與正常子宮內(nèi)膜組織樣本相比，子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-1266的表達(dá) 水平顯著升高，與miRNA芯片結(jié)果一致。
[0119] 實(shí)施例3 QPCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miRNA-1266的表達(dá) [0120] l、miRNA-1266質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定
[0121] 1)根據(jù)miRNA-1266的序列信息由大連寶生物生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成miRNA-1266 抑制劑質(zhì)粒和隨機(jī)對(duì)照序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒。
[0122] 2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌株
[0123] ①-80°C冰箱取出DH5a感受態(tài)細(xì)菌1〇〇μ1于冰上融化；
[0124] ②將10μ1 pMKITeno質(zhì)粒加入100μΙ DH5a感受態(tài)菌液，輕彈、旋轉(zhuǎn)管底混勻，冰浴 放置30min;
[0125] ③置于42 °C水浴熱休克90s后立即冰浴90s;
[0126] ④加 Amp-LB培養(yǎng)液800μ1，輕輕吹打混勻，于37°C恒溫?fù)u床，lOOrprn振蕩孵育lh，使 細(xì)菌復(fù)蘇；
[0127] ⑤將復(fù)蘇后的菌液于4°C，3000rpm離心10min;
[0128] ⑥吸棄上清，使管中剩余約100μΙ液體，輕輕吹打混勻后將其涂于Amp-LB瓊脂平 板；
[0129] ⑦待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。
[0130] 3)篩選陽(yáng)性菌落
[0131] 經(jīng)16h孵育，固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出白色菌落。取消毒離心管8支，用消毒牙簽小心挑取白 色菌落8株，吸管吸取Amp-LB液體培養(yǎng)基，分別將其沖入相應(yīng)試管，加培養(yǎng)液至5ml。置37°C 恒溫?fù)u床，以200rpm振蕩培養(yǎng)12h，取適量培養(yǎng)物送華大基因進(jìn)行基因測(cè)序。
[0132] 4)提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒(OMEGA公司質(zhì)粒中量提取試劑盒），按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn) 行提取。
[0133] 5)質(zhì)粒濃度的測(cè)定
[0134] 將提取的陽(yáng)性菌液的質(zhì)粒應(yīng)用微型全波長(zhǎng)分光光度計(jì)進(jìn)行濃度的測(cè)定。
[0135] 2、細(xì)胞培養(yǎng)
[0136] 將Ishikawa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RRMI 1640培養(yǎng)基中，于37°C、5% c〇2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0137] 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0138] 將I shikawa細(xì)胞分為四組，實(shí)驗(yàn)組即轉(zhuǎn)染miRNA-1266抑制劑組，陰性對(duì)照組即轉(zhuǎn) 染隨機(jī)對(duì)照序列組，脂質(zhì)體對(duì)照組即轉(zhuǎn)染LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組，空白 對(duì)照組即不轉(zhuǎn)染組。運(yùn)用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照說(shuō)明書。 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組組的工作濃度均為5μΜ。轉(zhuǎn)染后48h收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0139] 4、QPCR 實(shí)驗(yàn)
[0140] 1)細(xì)胞總RNA提取:利用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，按照 說(shuō)明書指示進(jìn)行。
[0141] 2)QPCR:步驟同實(shí)施例2。
[0142] 結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的miRNA-1266的表達(dá)水平顯著下降，表明 miRNA-1266抑制劑能夠有效抑制miRNA-1266的表達(dá)。
[0143] 實(shí)施例4 CCK-8法檢測(cè)miRNA-1266對(duì)細(xì)胞增殖的影響
[0144] 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染按照實(shí)施例3
[0145] 1、轉(zhuǎn)染48h后，收集Ishikawa細(xì)胞:細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每組細(xì)胞配成濃度為2X104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液；
[0146] 2、96孔板每孔0.1ml，每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)鋪5塊96孔板，邊緣孔加 0.1ml無(wú)菌 水或PBS;
[0147] 3、細(xì)胞貼壁后，連續(xù)測(cè)第2處、4811、7211、9611時(shí)間點(diǎn)：加0〇(-8，每孔1(^1，37°(：孵育 4h，450nm波長(zhǎng)測(cè)0D值，記錄各組0D平均值，根據(jù)平均值畫出生長(zhǎng)曲線。
[0148] 4、結(jié)果
[0149] 結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組 的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)。上述結(jié)果表明miRNA-1266的表達(dá)有利于 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，通過(guò)下調(diào)miRNA-1266的表達(dá)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0150] 實(shí)施例5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
[0151] 1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。
[0152] 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。
[0153] 3、步驟
[0154] 1)收集轉(zhuǎn)染48h后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì) 胞，2000rpm離心5min，棄培養(yǎng)基。
[0155] 2)用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，2000rpm離心5min收集細(xì)胞。
[0156] 3)在50μ1 的Binding Buffer中加入5yl7-AAD染液，混勻。
[0157] 4)在收集的細(xì)胞中加入上述7-ADD染液混勻;室溫、避光、反應(yīng)15min。
[0158] 5)反應(yīng)后再加入450μ1的Binding Buffer混勾；加入lylAnnexin V-PE混勾，室溫、 避光反應(yīng)15min。
[0159] 6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞凋亡比率。
[0160] 4、結(jié)果
[0161] 實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率為（15.47 ± 0.012) %，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(0.64 土 0.03) %，轉(zhuǎn)染試劑組的細(xì)胞凋亡率為(0.65±0.01) %，陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(0.73 ±0.02)%，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(？〈0.05)，上述結(jié)果表明，11^1?^-1266的表達(dá)不利于 子宮內(nèi)膜癌的存活，通過(guò)促進(jìn)miRNA-1266的表達(dá)可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡。
[0162] 實(shí)施例6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
[0163] 1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。
[0164] 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。
[0165] 3、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
[0166] (1)包被基底膜：用含0 · 5%FBS的DMEM培養(yǎng)液按1:6稀釋50mg/L Matrigel，取60μ1 包被Transwel 1小室底部膜的上室面，放37°C、5 % C02培養(yǎng)箱孵育4h，棄掉上清。
[0167] (2)將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa培養(yǎng)至24h，去掉完全培養(yǎng)基，以5%FBS培養(yǎng)基繼 續(xù)培養(yǎng)24h。
[0168] (3)倒掉培養(yǎng)液，用3ml D-Hank's solution洗滌細(xì)胞兩次。
[0169] (4)加 lml Trypsin-EDTA solution，混勻后，小心吸去胰酶溶液，37°C放置3-5min〇
[0170] (5)在加入2ml含5 %FBS的MEM/DMEM培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，將 細(xì)胞稀釋至3X105細(xì)胞/ml。
[0171] (6)按1 X103細(xì)胞/孔的濃度接種于transwell小室，下室加入血清濃度為15%的 培養(yǎng)液700μ1，37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)48h。
[0172] (7)取出小室，PBS洗一次。加入預(yù)冷的甲醇，-20 °C固定1 Omin。
[0173] (8)棄凈甲醇，PBS清洗。在PBS中用棉簽輕輕刮去小室上表面的Matrigel膠，用roS 洗上面3次。拿出小室倒置，風(fēng)干。
[0174] (9)將小室放入一新的24孔中，加入200μ1 0.1 %結(jié)晶紫，使膜浸沒，37 °C染色 30min〇
[0175] (10)用ddH20洗3次。小室風(fēng)干后，放入孔中，倒置顯微鏡下取適當(dāng)視野，高倍鏡下 拍照計(jì)數(shù)，計(jì)算視野的細(xì)胞平均數(shù)以代表細(xì)胞侵襲力，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0176] 4、數(shù)據(jù)分析
[0177] 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量采用土標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本均數(shù)的比較 采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析;方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0178] 5、結(jié)果
[0179] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，對(duì)照組之間細(xì)胞穿膜數(shù)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組 同對(duì)照組相比，細(xì)胞穿膜數(shù)明顯減少，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05)。
[0180] 表2 Ishikawa細(xì)胞穿膜數(shù)
[0181]
[0182]上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. miRNA-1266或其同源物在制備診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品通過(guò)測(cè)定miRNA-1266或其同源物 的表達(dá)水平以診斷子宮內(nèi)膜癌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括通過(guò)使用qRT-PCR、印記雜 交、原位雜交、陣列雜交、基因芯片或新一代測(cè)序來(lái)檢測(cè)miRNA-1266或其同源物的水平以診 斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品。4. 一種診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中miRNA-1266 或其同源物的水平來(lái)診斷子宮內(nèi)膜癌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片、陣列或試劑盒。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒包括針對(duì)miRNA-1266的引物 和/或探針。 7. miRNA-1266或其同源物在制備治療子宮內(nèi)膜癌藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物包含miRNA-1266或其同源物的抑 制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA-1266的抑制劑是miRNA-1266或 其同源物的反義寡核苷酸或拮抗劑。10. -種治療子宮內(nèi)膜癌的藥物，其特征在于，所述藥物包括8或9所述的抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105907883SQ201610514465
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年7月1日
【發(fā)明人】任靜, 肖武, 楊承剛
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司