專利名稱：子宮內膜癌的檢測的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及癌癥的檢測方法，尤其是子宮內膜癌的檢測方法。本發(fā)明的方法適用于大規(guī)模篩分，例如在子宮內膜癌風險不斷增加的婦女中進行篩分。
背景技術：
目前已經很清楚地知道在一些惡性腫瘤中，腫瘤的侵占性和腫瘤細胞蛋白酶表達之間具有很高的相關性。例如，最近七年中，已經積累了令人信服的證據(jù)表明，腫瘤侵染和轉移過程與基質金屬蛋白酶家族的成員直接相關。
臨床醫(yī)生長期以來一直認為需要研制一種客觀標準用于癌癥的早期檢測，以及當治療患有惡性腫瘤的病人時，用于評價預后因素。通常判斷子宮內膜癌的階段、侵入子宮肌層的深度、腫瘤的組織學級別和類型以及侵入淋巴管空間的程度對于疾病的侵占性具有某種程度的預測價值。然而，這些因素均不精確，它們均依賴主觀判斷。例如，通過組織學檢查確定腫瘤的類型和級別時，曾報道這種評價在不同病理學家之間可能導致不同數(shù)值的幾率高達85％(Baak和Oort，1991)。因此目前沒有預測個體病人預后的方法。
越來越清楚地了解到子宮內膜癌進程的準確預測，和各種類型治療后生存的可能性，也都依賴惡性腫瘤細胞的本質特征和它們與宿主的相互作用(Baak，1991)。因此該領域的主要研究目標就在于發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞的生物學特征，從而確定腫瘤的侵染和轉移潛力。
從其它類型癌癥的研究中可以知道，涉及腫瘤細胞生物學，例如DNA倍性(Iversen，1986；van der Putten等，1989；Berchuck等，1992；Podratz等，1993；Lukes等，1994)、介導細胞-細胞粘附的E-鈣粘蛋白的表達(Sakuragi等，1994)、以及涉及細胞侵入的基質金屬蛋白酶(MMP)的分泌(Liotta等，1986；Stetler-Sevenson等，1993)均能夠通過提供涉及腫瘤細胞行為的可重現(xiàn)的客觀測量方法，提高預后評價和生存預測的準確性。已經表明細胞中DNA含量(倍性)的改變與卵巢、乳房、結腸、肺、前列腺癌(Seckinger等，1989)的生物學行為，以及子宮惡性腫瘤的生物學行為有關(Moberger等，1985；van der Putten等，1989)。通常，具有正常二倍體DNA的癌細胞比具有異常、非整倍體或多倍體DNA的癌細胞的預后更好。因此，確定子宮內膜癌和其它癌癥中DNA的倍性，成為評價與疾病再發(fā)生有關的預后和生存可能性的有力工具，而且也是比分子或基因標識更有效的預測方式(Lukes等，1994)。
目前已經了解到在一些惡性腫瘤中，腫瘤的侵占性和腫瘤組織中蛋白酶的表達之間具有很高的相關性。例如，最近七年中，不斷積累的令人信服的證據(jù)表明腫瘤侵染和轉移過程與基質金屬蛋白酶(MMP)家族成員和組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)直接有關(Stetler-Stevenson等綜述，1993)。曾有報道檢測生物體液中的MMP，特別是檢測MMP與TIMP的復合物，可以用于測定轉移性癌(美國專利No 5324634，Zucker)這些酶在生理組織再造(月經)和侵入(胚培植)過程中也可以由正常細胞合成和分泌(Salamonsen，1995，1996)。MMP可以以完全活化型或者以酶活性得以表現(xiàn)之前需要激活的潛伏型存在于組織中。
最近我們已經證明在長尾猴卵巢周期和懷孕早期，MMP釋放到子宮腔中(我們尚未公開的結果)。而且，曾報道在一些腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)這些酶過量表達，例如，結腸直腸和鱗狀細胞癌中的這類酶。
最近，論證卵巢癌細胞，而非正常卵巢上皮細胞，超水平分泌類似于MMP-2和MMP-9的基質金屬蛋白酶，該酶直接降解基底膜蛋白質(Moser等，1994；Salamonsen，1996)。這種蛋白質水解能力與子宮惡性腫瘤的侵入潛力有關。而且，應用單克隆抗體的免疫組織化學已經用于將MMP-2定位于各種瘤細胞(包括子宮內膜癌)的細胞質和原生質膜，同時TIMP-2主要定位于這些組織的基質(Hoyhtya等，1994)。除此之外，關于MMP和TIMP在子宮內膜癌中的表達知道的很少。這類信息對于研究控制子宮內膜癌和其它類型惡性腫瘤的生物學行為的方法是至關重要的。
現(xiàn)在我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，從子宮內膜癌患者的子宮洗液中可以檢測到基質金屬蛋白酶，但對照婦女的子宮洗液沒有檢測到。這一發(fā)現(xiàn)可能實現(xiàn)以最小的侵入進行靈敏的診斷試驗，以及可以用于篩分風險人群或普通人群的篩查試驗，或者用于推測治療(putative treatment)的臨床試驗。該試驗也適用于監(jiān)測治療效能和檢測癌的復發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供一種分析子宮內膜癌存在和/或風險的方法，包括以下步驟從子宮內膜癌的高風險受試者或懷疑患子宮內膜癌的受試者體內獲取子宮洗液樣品；測定洗液中基質金屬蛋白酶(MMP)的水平。
為了本說明書的目的，“子宮內膜癌的檢測”這種表示方法應當廣義地理解，它包括對癌癥可能存在還是不存在的檢測，或者對癌前期狀態(tài)下的細胞或癌癥發(fā)展早期時的細胞的檢測。因此本發(fā)明不僅包括活化子宮內膜癌的檢測，還包括發(fā)展成為該活化癌的風險的檢測。
可以使用任何合適的溶液輸入子宮腔，然后回收和收集該溶液，得到子宮洗液，用于檢測。上述合適的溶液對本領域技術人員是顯而易見的，包括任何不干擾MMP檢測的無菌無毒溶液。合適溶液的一個例子是無菌鹽水。輸送和回收洗液可以使用任何方法，作為例子常規(guī)使用注射器和導管。洗液可以以回收的方式收集，或者轉移到另一個容器中。輸送、回收和收集的方法通常選擇對病人和臨床醫(yī)生都能提供舒適和方便的方法。
本發(fā)明的方法中可以使用任何合適的方法測定洗液中的MMP水平。例如，合適的方法包括基于測定酶活性的方法、和/或基于測定酶的存在或存在水平的方法。可以測定總MMP，包括潛伏的、活化的、和TIMP-結合的MMP。本領域技術人員將很容易就能夠確定一種方法是否合適，如果必要可以使用陽性和陰性對照樣品。例如，明膠酶譜分析法適用于檢測MMP-2和MMP-9的所有形式。任選地，酶譜分析法可以與光密度分析法聯(lián)合，以便提供各種酶類型和形式(即潛伏或活化)酶的半-定量評價方法。也可以用基于底物的活性分析法分析活化酶。
可以測量子宮洗液存在的總明膠分解活性；雖然這種方法不能分辯存在的MMP的不同類型，但它的確提供了一種快速評價總MMP活性的方法。然而，優(yōu)選測定MMP-2和/或MMP-9的活性水平。
或者，可以用例如ELISA、熒光分析法、化學發(fā)光分析法、或放射免疫分析法測定總酶水平。特別優(yōu)選ELISA或化學發(fā)光分析法，因為它們快速、靈敏、專屬性強，并且在用于大規(guī)模分析時容易自動化。這些方法也可以進行定量測定。Barrett(1995)詳細描述了很多測定這類酶的適當方法。
任選地，也可以測定洗液中的組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)的水平，例如通過反相酶譜分析法或ELISA。
在本發(fā)明的另外一個實施方案中，在獲取子宮洗液的同時，還收集了子宮內膜表層細胞樣品，例如，將一個子宮刷插入子宮腔，子宮內膜細胞用于細胞學檢查，確定倍性和細胞核形態(tài)測量，上述確定的MMP水平與DNA倍性相關，當存在子宮內膜癌時，將它作為子宮內膜癌預后的一個指標。
可以使用標準圖象細胞記數(shù)法和自動設備確定倍性和細胞核形態(tài)。
第二方面，本發(fā)明提供了一種評價子宮內膜癌預后的方法，包括以下步驟對接受子宮內膜癌手術的病人進行手術前，獲取子宮洗液測定其中的MMP活性；獲取所述病人的子宮內膜細胞樣品；獲取腫瘤細胞樣品和臨近的正常子宮內膜樣品，進行組織學檢查；關聯(lián)MMP活性、DNA倍性和腫瘤級別和類型，作為預后的指標。
如果因為某種原因，不能手術切除子宮，子宮內膜癌的初步治療方法可以使用放療、化療、子宮內膜部分切除(例如，使用光動態(tài)療法、或刮除術，而不是子宮切除術)的保守療法；某些情況下，刮除術與其它方法聯(lián)合使用。對接受上述保守治療的病人進行癌癥復發(fā)的追蹤和檢測特別重要。
第三方面，本發(fā)明提供了一種監(jiān)測子宮內膜癌治療效能的方法，包括以下步驟從接受這種治療的病人體內獲取子宮洗液樣品；測定洗液中的MMP水平。這種方法也適用于監(jiān)測推測治療的效能。
第四方面，本發(fā)明提供了一種對接受保守治療的原發(fā)子宮內膜癌患者檢測其子宮內膜癌復發(fā)的方法。包括以下步驟從上述患者體內獲取子宮洗液樣品；測定洗液中的MMP水平。
優(yōu)選使用上述定量光密度酶譜分析法或ELISA測定MMP-2和MMP-9的活性。
本發(fā)明的方法適用于篩分無癥狀或健康婦女，或者風險人群，例如糖尿病婦女或接受絕經期后激素替代治療的婦女。
第五方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，用于分析子宮內膜癌的存在和/或風險，含有(a)一種沖洗子宮腔的合適溶液，和(b)輸送、回收和收集子宮洗液的裝置，優(yōu)選的試劑盒還包括(c)測定所述洗液中MMP水平的試劑，試劑盒還可以進一步任選包括一種或多種(d)獲取子宮內膜上皮細胞樣品的裝置，
(e)一個或多個顯微鏡載玻片，(f)裝有組織固定劑的容器。
在一個優(yōu)選實施方案中，試劑盒含有(a)沖洗子宮腔的無菌生理可接受溶液，(b)無菌注射器，(c)無菌輸液管或導液管，(d)裝子宮洗液的容器，和任選地(e)子宮刷，和/或(f)一個或多個顯微鏡載玻片。
另外，試劑盒還優(yōu)選含有一個裝有組織固定液的容器；更優(yōu)選固定液是4％的多聚甲醛。
為了本說明書的目的，應當清楚地理解“包含”這個詞意味著“包括但不限于”，并應理解“含有”也具有相應的意思。
附圖簡述

圖1表示子宮內膜癌患者的子宮洗液樣品進行連續(xù)稀釋后的酶譜結果。
圖2比較了子宮內膜癌患者的一系列子宮洗液樣品得到的結果，其中在特異性MMP活性抑制劑缺乏(凝膠的左半邊)或存在(凝膠的右半邊)情況下進行酶譜分析。
圖3比較了子宮內膜癌患者的子宮洗液樣品(圖3a)和對照受試者樣品(圖3b)得到的酶譜結果。對照樣品以四倍于癌癥患者樣品的濃度裝載。
圖4比較了子宮內膜癌患者子宮洗液樣品(第3道)和各種對照受試者樣品的酶譜結果。第5道和第7道，第6道和第8道分別來自同樣的受試者；然而第7道和第8道的樣品濃度是第5道和第6道樣品濃度的四倍。
圖5和圖6各自表示來自子宮內膜癌患者的一系列不同樣品，以同樣的濃度跑凝膠，以便在各樣品間進行直接比較。
圖7表示MMP-9的ELISA分析結果，所示為微滴培養(yǎng)板各孔的光密度。
圖8顯示了代表微滴培養(yǎng)板中顏色反應的灰度。
發(fā)明詳述患者下面將以僅參考下列非限制性實施例和附圖的方式詳細描述本發(fā)明。
研究組包括幾乎所有在皇家婦女醫(yī)院接受外科治療的子宮內膜癌患者(表1)。
對照組包括因為其它疾病接受外科治療或診斷的婦女，并且她們同意接受子宮沖洗。
為了更迅速地積累研究人群的數(shù)目，在Mercy醫(yī)院接受子宮癌治療的患者也包括在內。
第一組研究人群包括正在接受子宮出血調查的絕經期后期和絕經期前后的婦女。對這些患者進行診斷性子宮鏡檢以及進行子宮擴張術和刮除術之前，先進行子宮腔的真空沖洗。
第二組研究人群包括正在接受子宮內膜癌手術治療的婦女。該組中，開始手術的時候首先沖洗子宮腔。
第三組人群包括無癥狀婦女，她們于上述研究組在同樣的年齡范圍內，她們作為對照將接受子宮沖洗和子宮內膜上皮的細胞學檢查。
對所有癌癥患者收集下列樣品用于進行下文描述的研究(1)子宮洗液的無細胞上清液，用于通過酶譜分析其中的分泌酶(MMP)和其抑制物(TIMP)。目前為止已經利用明膠酶譜(表1)、ELISA、和免疫印記對MMP-2和MMP-9進行了檢查。我們用酪蛋白酶譜進行的MMP-1和MMP-3的測定表明這些酶不分泌到子宮中，或者分泌水平非常低。
(2)用于測定DNA倍性的子宮內膜細胞每個病人的這種細胞得自于子宮洗液的細胞沉淀；子宮刷獲取到的子宮內膜上皮細胞；和惡性腫瘤或顯微鏡載玻片的接觸印痕。每種方式制得的細胞都用于倍性分析，應用上述三種方式得出一致的結果。倍性測定已有報道，其中提供了評價癌癥患者預后的客觀和可重現(xiàn)的參數(shù)。
(3)腫瘤塊和附近正常子宮內膜在Carnoy固定液和多聚甲醛中固定。利用免疫組織化學法研究這些組織的組織切片是否存在MMP，利用原位雜交研究這些酶(MMP)和其抑制物的基因轉錄。也對部分病人的腫瘤和附近正常組織的樣品進行冷凍，用于后續(xù)深入研究，例如，對組織中的MMP進行直接分析。
子宮液和子宮細胞的收集裝有5ml鹽水的注射器與輸液管連接。輸液管通過子宮頸插入子宮，沖洗子宮腔，收集回注射器的液體轉移到一支試驗管中。另將一個子宮刷插入子宮腔，收集子宮內膜表層細胞用于細胞學分析。
子宮液以3000rpm離心10分鐘。收集上清液部分，并于-80℃貯藏用于后續(xù)MMP/TIMP分析。子宮內膜細胞沉淀和使用子宮刷得到的子宮內膜細胞樣品在2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AAS)涂布的載玻片上制片。在4％多聚甲醛中固定這些細胞載玻片，然后用Feulgen染色，利用成像細胞記數(shù)法評價DNA倍性。
子宮內容物的處理對于癌癥和對照研究組，立即以3000rpm離心子宮洗液10分鐘，以沉淀細胞，然后冷凍上清液用于后續(xù)MMP和TIMP研究。用下述的成像細胞記數(shù)法測定兩組細胞沉淀的DNA倍性。對接受子宮內膜癌手術切除的患者，制備下列樣品。在打開切除的子宮后，至少接觸腫瘤表面兩次獲取樣品，用與細胞沉淀同樣的方法進行DNA倍性測定。另外，在處理剩余的子宮進行組織病理學檢查之前，首先切下惡性腫瘤組織樣品，特別是侵入?yún)^(qū)的惡性腫瘤組織樣品，以及與正常子宮內膜組織相鄰的腫瘤組織樣品，用于免疫組織化學和原位雜交研究。后者包括侵入子宮肌層深度的評價，以及腫瘤級別和類型的評價。另外還確定有否淋巴結和附件轉移。
DNA倍性研究將從子宮洗液中得到的脫落的上皮細胞沉淀分散、用培養(yǎng)基清洗、重懸浮，然后用60μm的尼龍網濾器過濾。通過細胞旋轉離心分離作用將細胞懸浮液固定到聚賴氨酸涂布的載玻片上。一種裝備了計算機的光學成像分析系統(tǒng)用于對這些制片和子宮腫瘤的接觸印痕片進行定量Feulgen DNA染色。該設備用已知DNA量的細胞(鼠肝細胞)校準，該已知DNA量的細胞與試驗樣品一起分別在載玻片的一端染色。選擇分析200-300個細胞。分別掃描每一個細胞核，制備每個細胞中DNA含量的直方圖，在這些直方圖的基礎上，根據(jù)主峰和次級峰的定位，確定DNA倍性(二倍體DNA的指數(shù)1.0±0.1)。
子宮洗液中MMP和TIMP的分析通過明膠酶譜(MMP-2、MMP-9)或酪蛋白酶譜(MMP-1、MMP-3、MMP-7)分析子宮洗液中的酶活性。樣品在含明膠或酪蛋白(各1mg/ml)的10％丙烯酰胺凝膠上，在非還原條件下，進行SDS-PAGE。凝膠在含50mmol/LTris-HCl，5mmol/L CaCl2，NaN3，0.02％(w/v；pH7.5)和1％Triton X-100的緩沖液中沖洗后，在無Triton的同樣緩沖液中37℃保溫2-24小時，然后用考馬斯亮藍染色。明膠酶或酪蛋白酶的活性通過凝膠的陰性染色顯示出來。潛伏MMP和活化MMP都可以通過這種方法檢測出來，因為SDS可以激活潛伏MMP。保溫期間(5mmol/L EDTA和2.5mmol/L對-菲咯啉)，可以將MMP抑制物加入適當?shù)牡胤?。定量檢測時，為了補償個體間子宮洗液中蛋白質含量的較大差異，裝載的體積應當與子宮洗液的總體積相關，由此可以評價每個個體子宮內腔中MMP的相對濃度。利用適應凝膠描記要求的HP桌面掃描儀，應用Deskscan軟件和NIH成像程序1.54版，對上述凝膠進行光密度分析，所述分析是通過測量目標酶或者個體樣品由泳道圖譜描記出來的峰下面積進行的。在一塊凝膠上或一套凝膠上平行進樣和電泳，進行定量比較研究。每塊凝膠至少含有兩種稀釋度的標準品，每套凝膠含四種稀釋度的上述標準品。目標酶活性非常高的泳道，進一步稀釋樣品重新電泳。作為定量技術的酶譜的應用已有報道(Kleiner和Stetler-Stevenson，1994，其中列出了參考文獻)。該技術非常靈敏，檢測限比例如ELISA(檢測限為每種樣品ng范圍)等方法低很多，對于MMP-2和MMP-9其檢測限均為每種樣品2pg的數(shù)量級(1nM)。
明膠酶活性分析該分析涉及樣品與14C-標記的膠原底物共同保溫。底物從荷蘭豬的皮膚中獲取出來，然后透析、用14C標記，使用之前，60℃加熱20分鐘變性，從而轉化成為可以被MMP-2和MMP-9消化的14C-明膠的形式。
通過底物與100μg/ml的胰蛋白酶共同保溫，測定總明膠分解活性。樣品或者不經處理，或者預先與氨基苯酚乙酸汞保溫，以便激活潛伏的MMP。分析樣品在37℃保溫4-24小時，加入30％三氯乙酸/1％鞣酸停止反應。所有未消化的底物形成沉淀。通過對消化的并釋放到上清液中的標記底物的量進行記數(shù)測定所有的酶活性。通過這種分析系統(tǒng)，計算各樣品的特異性活性成為可能；一單位的活性定義為在37℃每分鐘能夠降解1μg底物的酶量。該分析方法不僅對定義樣品中已經激活的酶活性有用，而且對定義潛伏酶激活后具有的潛在活性有用；在生理學領域，它代表樣品中的酶降解胞外基質成分的速率。該分析方法僅測量總明膠酶活性；它不能分辯明膠酶例如MMP-2和MMP-9活性之間的差異。特異性MMP可以由酶譜分辯出來。
免疫組織化學和原位雜交分析MMP和TIMP的專屬試劑和方法已有文獻描述(例如，Rawdanowicz等，1994；Jeziorska等，1996；Salamonsen和Woolley，1996)。目前，抗血清已有商業(yè)提供(例如Biogenesis Ltd，U.K.，Triple Point Biologics，Oregon U.S.A.，The Binding Site，U.K.)，純化酶和TIMP也有提供(Calbiochem，Cambridge MA，U.S.A.)。已經克隆了所有相關基因，公開了其序列，并是公眾可得到的。
利用上述抗血清和堿式磷酸酶/抗-堿式磷酸酶(APAAP)檢測系統(tǒng)(Serotec)(Salamonsen等，1991；Salamonsen等，1993；Rawdanowicz等，1994)對Carnoy’s固定的或多聚甲醛、蠟包封的組織進行免疫組織化學分析。多聚甲醛固定通常更為常規(guī)，能夠使小樣品得出較好的結果。原位雜交使用異羥洋地黃毒苷-標記的DNA或RNA探針。
實施例1 MMP釋放到接受子宮內膜癌研究的患者的子宮腔中對從52位子宮內膜癌患者和40位接受子宮出血或其它婦科疾病診斷程序的對照病人中得到的樣品，用酶譜檢查其中的MMP-2和MMP-9，并用圖象細胞記數(shù)檢查子宮內膜表層細胞的DNA倍性。對于發(fā)現(xiàn)患有子宮內膜癌的患者，評價其惡性腫瘤的級別。MMP-2和MMP-9進一步分為下列假設的分析類型潛伏MMP-2、活化MMP-2、二聚體MMP-9、糖基化前MMP-9和活化MMP-9。潛伏和活化MMP-2和MMP-9的鑒別按照后面實施例的描述，隨后確定。
結果在表1和表2中概述。另外，用酪蛋白酶譜對MMP-1、MMP-3和MMP-7進行了測定，但無論是對照中還是子宮內膜癌患者的子宮洗液都沒有發(fā)現(xiàn)可以檢測到的水平。
表1概述了從各種級別的子宮內膜癌患者得出的酶譜結果，與改組其它臨床和病理指標的關系。明膠酶酶譜分為兩種分子形式的MMP-2和三種分子形式的MMP-9。到目前為止，在子宮內膜癌患者的子宮洗液中發(fā)現(xiàn)可檢測到的最弱的明膠裂解活性是代號為J.O.的患者體內的一種形式的MMP-2(賦予+)和兩種形式的MMP-9(均賦予+)。如果三個加號的總數(shù)，即所有MMP部分水平總和的積分，作為診斷子宮內膜癌陽性所需要的最低水平，表2所列出的對照中，沒有一個可以診斷為假陽性。到目前為止，子宮內膜癌組也沒有遇到假陰性結果(缺乏所有的MMP活性)。對于個體癌癥患者的子宮洗液，觀察到明膠裂解活性水平在3-22個加號之間。
表1子宮內膜癌患者各參數(shù)比較的最新結果摘要MMP表現(xiàn)型*患者 年 級 DNA倍 惡性級別 淋巴結涉 血管侵子宮肌層 潛伏活化 推測的二聚 前 活化姓名 齡 別 性狀況 入狀況 入狀況侵入深度 MMP-2 MMP-2體MMP-9 MMP-9 MMP-9B.F. 58 1 多倍體0.93 無 無＞1/3(通常2mm) ++ ++ +++ ++++++++M.R. 50 1 二倍體0.34 無 有表層(5/27) +++ +++++ ++++++++S.H. 57 1 二倍體0.03 無 有＜1/3+ -++++ +B.M. 59 1 二倍體0.26 無 無表層(1/10) ++ +++++ +++++ +++W.B. 72 1 多倍體1.39 無 無距漿膜2.8mm +++++ +++ ++++ +++++ +++V.Q. 58 1 二倍體0.17 無 有表層 +++++++ +++ +++++A.K. 58 1 二倍體0.48 無 有7/8 +++ ++ ++++++C.H. 54 1 二倍體0.16 無 無4/13(內側第三層) ++ +++++ +++++++J.E 62 1 二倍體0.29 無 無5/15 + +++ +++ +A.K. 65 1 二倍體0.13 無 無內側一半 +++ ++++ +++++ ++++C.M. 67 1 二倍體0.34 無 有2/3 +++++ +++ ++++++++++ +++J.Q. 57 1 二倍體0.21 有 有8/22 ++++-++ +++++N.K. 73 1 二倍體0.05 無 無1/32 ++ -+++ -Z.K. 53 1 二倍體0.07 無 無1/11 ++ +++ +S.S. 49 1 二倍體0.09 有 無5/32 +++ ++++ -D.R. 67 1 多倍體0.53無無表層(2/3) + ++ +++++ ++M.T. 73 1 多倍體3.00無無表層 + + - ++ -G.M. 67 1 二倍體0.16無無距鄰近的子宮肌+ ++++ ++ -層1mmT.O’ 84 1 多倍體0.48無有12/15 +++ - + +++++TR.F. 64 1 二倍體0.02- 無7/26 ++ + +++++ +++++ +++L.H. 62 1 - - - 無0 ++++++++ ++++ ++++++++++C.T. 73 1 二倍體0.08- 無4/18 -- + ++ +L.C. 53 2 多倍體1.72無無＜內側第三層 +++ - ++ +++++J.O. 55 2 多倍體0.54無無0 +- + + -V.D. 60 2 二倍體0.16無無5/13 ++ - ++ +++ ++D.S. 55 2 二倍體0.13無有表層 ++ - ++++++ +P.T. 65 2 多倍體0.58有有距漿膜2.8mm +++ + ++++ +++++ +A.B. 60 2 二倍體0.17無有全部厚度 ++ + ++ +++ +J.B. 72 2 多倍體1.55有無＞2/3 ++++ ++++++++++ ++B.R. 55 2 二倍體0.05無無＜1/3 +++ ++++ +++++ ++++D.W. 63 - 多倍體1.57無無2/13 +++ ++++ +++ +I.F. 68 2 多倍體0.77無無11/27++ +++- ++ -D.M. 54 2 多倍體2.31- 有8/24 ++ ++++ ++++E.H. 75 2 - - 有無漿膜內5mm+++++ +++++ +++++ +++C.C. 51 2 二倍體0.72無無9/19 ++ ++ - + -M.S. 73 2 多倍體＞3 無無5/13 + ++++ + ++++ -D.S. 63 2 - - 無 無 1/21 +++- +++ + +D.K. 57 2 多倍體＞3 有有＞內層2/3++ + +++++++++ +++E.L. 61 2 二倍體0.03有有12/21++ - +++++ +++++ +++L.R. 62刮除時為2級 ++ - +++ ++++ +C.G. 63 2 二倍體0.28有有17/16++++ ++++++++++++ +++C.S. 60 2 多倍體2.07- 有表層(2/11) ++ - ++ ++ ++++K.K. 64刮除時為3級 - ++ - + -C.S. 68 3 二倍體0.03無無＞內層1/3(最小) - ++ - + -R.B. 76 3 多倍體2.44無無2/12 + +++- ++ -L.D 63 3 二倍體0.36無有10/17++ - - +++++T.B. 94 子宮刮片顯示原位鱗狀細胞瘤，偶爾有碎片顯示侵入性鱗狀細胞 ++ ++ + ++ -瘤.考慮到患者的年齡和整體健康沒有進行TAH.O.L. 79 - 多倍體0.4 多倍體橫紋肌肉瘤++ - - ++++A.J. 58 3 多倍體＞3 無無表層(4/17) ++++ +++ +++++ +L.S. 79 3 二倍體0.53無無內層一半+++ +++++++++++ ++++I.F. 54 3 二倍體0.25無有內層一半+ -+++ +H.M. 68 3 二倍體0.35- 有0/15+++++ +-+++ -*所有子宮洗液樣品均稀釋1∶40；酶譜結果基于與酶帶的大小和密度有關的打分系統(tǒng)無(-)，非常低(+)，低(++)，中等(+++)，高(++++)，非常高(+++++)。
#惡性腫瘤級別代表0.01-3.0范圍內的一個分值。涉及低惡性級別(在0.01-1.0之間)的腫瘤與高存活率有關，惡性級別在1.1-1.9之間的腫瘤具有中等存活率，而高惡性級別(2.0-3.0之間)的腫瘤具有較短的平均存活時間。Bocking A等，DNA-細胞光密度診斷和惡性腫瘤分級的計算規(guī)則。定量分析細胞學(Anal.Quant.Cytol.)，6(1)1-8，1984。
表2概述從對照患者(無臨床可檢測的子宮內膜癌)得到酶譜結果，以及該組的其它臨床和病理學參數(shù)。明膠酶譜顯示5個患者存在非常低水平的潛伏MMP-2，一個患者存在非常低水平的120kDa明膠酶(推測是MMP-9)。迄今為止在稀釋用于酶譜分析的子宮洗液中沒有檢測到其它形式的MMP。大多數(shù)對照病人的子宮洗液中缺乏可檢測到的明膠分解活性，或者單分子形式的MMP活性非常低，打分最大值為一個加號，表明當子宮洗液中檢測到幾種MMP部分時，可以特異和靈敏地診斷為子宮內膜癌。
表2對照組中各參數(shù)比較的最新結果摘要患者姓名 年齡 DNA倍 臨床記錄 MMP表現(xiàn)*性狀況 潛伏活性推測的二聚體 前- 活性-MMP-2 MMP-2 MMP-9 MMP-9 MMP-9F.O. 46- 子宮內膜異位癥；無殘留的發(fā)育異常- - - - -D.R. 37二倍體 糊狀斑塊表明發(fā)育不良- - - - -S.S. 52- 異常椎形糊狀斑塊；僅退化性改變 - - - - -N.A. 54- ^CINII，由激光手術切除 - - - - -J.F. 50二倍體 固形卵巢塊；一次偶發(fā)絕經后出血 + - - - -V.S. 60倍體- 絕經后出血；未診斷出癌癥- - - - -D A. 39- 原位子宮頸瘤；無發(fā)育異常或惡性癥狀 - - - - -E.P 45二倍體 起初診斷子宮內膜癌進行刮除術，但復查后為陰性- - - - -C.N. 32- ^CINIII，由激光手術切除 - - - - -N.T. 52- ^CINII，由激光手術切除 - - - - -F.S. 35二倍體 ^CINIII，之后活檢，未觀察到^CIN - - - - -J.I. 22- 右側卵巢囊腫- - + - -A.H. 24- 實施擴張術和刮除術；使用微丸+ - - - -D.E. 59- ^CINIII，之后活檢，未觀察到^CIN - - - - -J.F. 24實施擴張術和刮除術 - - - - -K.F.26二倍體實施擴張術和刮除術- - - - -A.V.36二倍體^CINIII斑塊；活檢時未觀察到發(fā)育異常 - - - - -M.D.43二倍體^CINI斑塊；椎狀、擴張、切除術 - - - - -D.W.25- 擴張和切除，子宮鏡檢 - - - - -M.B.48- NIDDM；月經過多；擴張和切除術，子宮鏡檢 + - - - -S.D. - 月經周期不規(guī)律；診斷為II型糖尿病(NIDDM) - - - - -J.F.34- ^CINIII斑塊；椎狀活檢 - - - - -J.O.26- 原位子宮頸瘤；椎狀活檢- - - - -L.M.32- ^CINI；發(fā)育不良程度較低；停止避孕 - - - - -J.K.23- 擴張和切除術；子宮切開，腎盂檢查 - - - - -A.O.48- ^CINIII和月經周期不規(guī)律；椎狀活檢 - - - - -C.A.47- 原位子宮頸腺癌；椎狀活檢 - - - - -A.K.70- 服用他莫昔芬；絕經后出血；子宮內膜增厚；復雜的盆腔- - - - -腫塊；實施全腹子宮切除(TAH)……良性、萎縮性、固著的息肉。C.Di. 71- 絕經后出血；涂片正常；因子宮內膜息肉實施TAH - - - - -G.L.62- 絕經后出血；刮除術表明部分再生，無非典型表現(xiàn) + - - - -G.M.67- 子宮內膜顯示與他莫昔芬處理一致的特征 - - - - -N.L.54- 刮除術表明無異常組織；椎狀活檢表明高級別的異常狀況+ - - - -
具有單一病灶P.A. 48 - 椎狀活檢，原位癌 -----D.R. 61 - 子宮內膜息肉，使用他莫昔芬-----S N. 31 - 刮除術表明無增生或惡性的跡象 -----L.R. 61 - 使用他莫昔芬；良性子宮內膜息肉-----L.G. 46 - 實施擴張術和刮除術，子宮切開 -----N.K. 47 - 起初復合型增生；刮除后增生性子宮內膜；無增生或-----發(fā)育異常B.M.- 椎狀活檢 -----A.I. 73 二倍體 絕經后出血，子宮鏡檢表明復合型增生；TAH后的病理 -----診斷發(fā)現(xiàn)良性子宮內膜息肉*所有子宮沖洗樣品以1∶40的比例稀釋；酶譜結果基于涉及酶帶的大小和密度的打分系統(tǒng)無(-)，非常低(+)，低(++)，中等(+++)，高(++++)，非常高(+++++)。^原位癌(CIN)
實施例2 MMP-9和MMP-2的ELISA分析BiotrakTMMMP-9 ELISA試劑盒(CalbiochemR)，能夠提供對子宮洗液樣品中MMP-9的簡單且專屬的檢測。該分析法的靈敏度為0.6ng/ml。該分析法使用定向抗MMP-9不同表位的兩種抗體。樣品或標準品中存在的所有MMP-9均結合到預先用抗-MMP-9涂層的微滴培養(yǎng)板上。對后進行第二個保溫步驟，其中加入與辣根過氧化物酶結合檢測抗體，形成固定化復合物。向各孔中加入四甲基對二氨基聯(lián)苯底物，進行顏色反應檢測每孔中的過氧化物酶復合物的量。產物的藍顏色用微滴培養(yǎng)板分光光度計(Beckman)在630nm處測定。用630nm的平均光密度對標準品ng/ml作圖，制備標準曲線。從中通過曲線外推確定各樣品的濃度(ng/ml)。一個微滴培養(yǎng)板(96孔)允許構建一個標準曲線和測量40個未知樣品一式二份。ELISA方案能夠在一天內得到結果。
制備10個癌癥和10個對照患者的不稀釋樣品和以1∶4的比例稀釋的樣品，然后分析MMP-9的存在或缺乏。圖7表示原始數(shù)據(jù)，其中顯示了微滴培養(yǎng)板各孔的光密度。圖8表示微滴培養(yǎng)板中產物顏色反應的灰度；按順序，它是子宮洗液樣品中MMP-9存在量的最初表示。所有癌癥樣品都有一個明顯高于對照的光密度值，以至癌癥樣品的測量值超出了標準曲線。作為這項工作的延續(xù)，將大量樣品連續(xù)稀釋，用ELISA試驗分析。這種滴定方法確立了檢測子宮癌時MMP-9的定值或基本水平(ng/ml)。
用BiotrakTMMMP-2 ELISA試劑盒也可以該方法測定MMP-2，所述試劑盒同樣購買自CalbiochemR。
實施例3 細胞生物學研究已確診子宮癌的患者，子宮切除作為部分治療方法。切除子宮后，如果可能，從以下兩個位置切除子宮內膜組織(a)相應于惡性損傷的位置，(b)顯微鏡檢查時，子宮內膜看起來是正常的位置。
腫瘤組織和正常組織均在含0.15M NaCl、10mM CaCl2、和0.05％Brij35的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，于冰面上勻漿。離心得到上清液，通過染料結合法，用BilRad蛋白質分析試劑測定蛋白質的濃度。
用明膠酶譜檢查組織勻漿中MMP的表型。上清液，經校準使每道蛋白質的量相同，如上述將明膠注入凝膠，進行SDS-PAGE。
酶譜表明所有組織樣品都有MMP-9和MMP-2的釋放。然而，顯然正常子宮內膜區(qū)的組織樣品比同一患者腫瘤組織樣品釋放明顯較低水平的MMP。因此，腫瘤組織中出現(xiàn)上調，尤其的MMP-9的水平上調。
這些研究表明前面部分描述的本發(fā)明的方法檢測的MMP-9和MMP-2水平的升高，主要源于子宮中存在的癌組織的分泌，而不是源于非-人組織的分泌。
實施例4 子宮內膜癌細胞的培養(yǎng)如上述子宮切除后，將來源于腫瘤位點的子宮內膜組織從子宮上切下來。將該組織樣品剪成小塊，然后在含10％FCS的α-最小基本培養(yǎng)基(MEM)中沖洗。然后將腫瘤組織碎片置于不含F(xiàn)CS的膠原酶/MEM溶液中在37℃保溫40分鐘。無關細胞在MEM+10％FCS中沖洗掉，然后接種于7cm2培養(yǎng)皿上。
生長旺盛的細胞在3-4天內鋪滿平皿，看起來包含形態(tài)均一的細胞群體。相比較而言，來源于子宮內膜正常區(qū)域的上皮細胞在同樣的時間內不能形成足夠的單層細胞。當腫瘤細胞鋪滿后，培養(yǎng)基更換為無血清MEM。細胞在無血清條件下培養(yǎng)24小時，然后收集培養(yǎng)基用酶譜確定分泌的MMP的狀況。
在凝膠上均可以鑒定前-MMP-2和前-MMP-9。該研究表明培養(yǎng)的癌癥細胞分泌與子宮腔內的癌癥細胞類似的酶譜。
實施例5 免疫印記子宮洗液樣品用10％凝膠進行SDS-PAGE。樣品在還原條件下電泳，然后將它們轉移到二氟化聚乙二烯薄膜上。該薄膜在固定緩沖液中沖洗，然后用單克隆MMP-2抗體(IM33L，CalbiochemR)作為探針測定。隨后在TBS(pH7.4)中清洗3次，每次10分鐘，將薄膜與辣根過氧化物酶結合的檢測抗體一起保溫。然后進行化學發(fā)光反應，以便檢測固定化的MMP-2抗原。該反應中，辣根過氧化物酶催化光的發(fā)散，其來源于發(fā)光試劑的氧化。常使用增強劑增強光的發(fā)散。依賴于薄膜上抗原量的發(fā)散的光，捕獲到自動射線照像膠片上，得到永久記錄的結果。MMP-9以同樣的方式用特異性單克隆MMP-9抗體(IM37L，CaliochemR)檢測。
該技術清楚地定義為子宮內膜癌患者子宮洗液中檢測到的酶的鑒定。免疫印記顯示酶譜檢測到的兩種主要酶是MMP-2和MMP-9。也對其余的帶進行了檢測，但還沒有鑒定這些明膠酶的分子特征。暫時認為它們是MMP-2和MMP-9的替換形式(例如，表1所示的MMP-2和MMP-9的推測形式)。
實施例6 子宮超聲和子宮流體MMP分析檢測子宮內膜癌這個預期試驗的目的在于通過陰道超聲掃描術評價子宮流體MMP分析的靈敏度和特異性，該分析用于檢測因異常子宮出血接受檢查的婦女是否患有子宮內膜癌。因為該檢查涉及輸入生理鹽水的子宮超聲掃描術，我們實驗室對同意接受該實驗的患者獲取起始子宮洗液樣品用于分析MMP。接受檢查的人群包括年齡在45-65歲，絕經過程中和絕經后的婦女。該研究期望發(fā)現(xiàn)具有患子宮內膜癌高風險女性人群比相應年齡的無癥狀婦女，子宮MMP水平升高的發(fā)生率。據(jù)估計高風險人群子宮內膜癌的發(fā)生率在2-10％之間。
表3概述通過明膠酶譜研究105個患者的子宮洗液得到的結果，8個患者(7.6％)MMP水平升高。在陽性MMP實驗的8個患者中，子宮內膜組織的組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)其中5個患有子宮癌。其它3個患者經組織學實驗沒有檢測到異常癥狀。然而，由于子宮洗液中MMP水平的升高，應該保證對這類患者進行有規(guī)律的跟蹤檢查，特別是確定這種升高是否與子宮癌形成的風險增加有關。未得到假陰性結果。
表3通過鹽水輸入子宮超聲掃描術因異常子宮出血檢查的患者子宮液的MMP分析MMP酶譜的結果 組織學證明患有子宮內癌的患者有 無 總和升高的MMP 5 3 8基礎MMP0 97 97總和 5 100105基于到目前為止的總體研究，可以斷定1.實驗的靈敏度為100％(5個檢測到癌癥的患者中5個MMP升高)。2.實驗的特異性為97％(沒有得癌癥的100個患者中97個MMP水平為基礎值)。
3.實驗的預測價值為62.5％(MMP升高的共8個患者中5個患癌癥)。
我們發(fā)現(xiàn)本研究中所有患子宮內膜癌的婦女的子宮分泌物含有明顯升高的MMP-2和MMP-9水平，相比較而言對照組的子宮分泌物中無MMP-2和MMP-9或MMP-2和MMP-9水平非常低。癌癥組和對照組之間酶水平的這種顯著并且一致的差別強有力地說明，分析子宮分泌物中的MMP作為對所有級別的子宮內膜癌的靈敏和可靠的診斷實驗是有用的。
因為子宮灌洗是相對簡單和非侵入性的方法，因此利用明膠酶譜分析子宮洗液樣品，或其它分析MMP的方法，例如ELISA，可以任選地與用于子宮頸疾病的糊狀涂片結合，用作子宮內膜惡性腫瘤的常規(guī)篩分試驗。初步統(tǒng)計學分析表明本發(fā)明試驗的靈敏度為100％。與常規(guī)糊狀涂片通常觀察到的80％的靈敏度相比，它非常令人滿意。ELISA或化學發(fā)光分析容易自動化，適于大規(guī)模篩分和臨床病例應用。
另外，我們目前的結果有力地說明MMP-2和MMP-9涉及子宮內膜癌的生長，并且可能涉及腫瘤在子宮內擴散。它可以提供子宮癌的整體治療過程中，特異性酶抑制劑與其它治療性用藥程式結合應用的原理。
各級別子宮內膜腺癌的患者數(shù)目太少，而不能得出任何關于MMP-2和MMP-9水平與組織學級別和侵入子宮肌層深度的關系的結論。然而，通常侵入最深的兩個患者發(fā)現(xiàn)兩個MMP的水平均最高。這些婦女也都發(fā)現(xiàn)有多倍體腫瘤細胞，評價的中度的惡性級別(表1)。這說明MMP-2和MMP-9水平對以前已知的預后指標提供了有用的補充。
為了清楚和易于理解的目的更詳細地描述本發(fā)明時，可以對實施例和本文描述的方法進行各種不偏離本說明書公開的本發(fā)明定義范圍的修飾和改變，這對本領域的技術人員是顯而易見的。
下一頁列出本文引證的參考文件，它們引入本文作為參考。參考文件Baak，J.P.A，癌癥診斷和預后中的定量病理學手冊，1991Barrett，A.J.，酶學方法，蛋白水解酶、天冬氨酸肽酶和金屬肽酶，1995，248413-528Berchuck，A.等，婦科腫瘤學，1992，4461-65BockingA.等，定量分析細胞學，1984，61-8Iversen，O.E.，美國婦產科學雜志，1986，155770-776Jeziorska，M.，Salamonsen，L.A.和Woolley，D.E.，生殖和受精雜志，1996，10743-51Kleiner K.E.和Stetler-Stevenson，W.G.，生物化學分析，1994，2183235-3329Liotta，L.A.等，生物化學年度綜述，1986，551037-1057Lukes，A.S.等，癌癥，1994，732380-2385Moberger，B.等，細胞計量學，1985，5430-436Podratz，K.C.等，美國婦產科學雜志，1993，1681206-1215Rawdanowica，T.J.，Hampton，A.L.，Nagase，H.，Woolley，D.E.和Salamonsen，L.A.，臨床內分泌代謝雜志，1994，79530-536Sakuragi，N.等，婦科腫瘤學，1994，53183-189Salamonsen，L.A.，內分泌學發(fā)展趨勢，1996，728-34Salamonsen，L.A.，Nagase，H.和Woolley，D.E.，細胞學雜志，1991，100381-385Salamonsen，L.A.，Nagase，H.和Woolley，D.E.，生殖與受精雜志增刊，1995，4929-37Salamonsen，L.A.，Nagase，H.，Suzuki，R.和Woolley，D.E.，生殖與受精雜志，1993，98583-589Salamonsen，L.A.和woolley，D.E.，人類生殖，1996，11，增刊，2124-133Seckinger，D等，實驗醫(yī)學病理學文集(Arch.Pathol.Lab.Med.)，1989，113619-626Stetler-Stevenson，W.G.等，細胞生物學年度綜述，1993，9541-573van der Puttten，H.W.H.M等，癌癥，1989 631378-138權利要求
1.檢測子宮內膜癌存在和/或風險的方法，包括以下步驟從子宮內膜癌高危受試者或懷疑患有子宮內膜癌的受試者體內獲得子宮洗液樣品，測量洗液中基質金屬蛋白酶(MMP)的水平。
2.按照權利要求1的方法，其中對洗液中的總明膠分解酶進行測定。
3.按照權利要求1的方法，其中對MMP-2和/或MMP-9的活性水平進行測定。
4.按照權利要求1或3的方法，其中用酶譜，任選地與光密度測量法結合檢測MMP活性。
5.按照權利要求1或2的方法，其中總酶水平通過ELISA、熒光分析法、化學發(fā)光分析法、或放射免疫分析法測定。
6.按照權利要求5的方法，其中MMP水平通過ELISA或化學發(fā)光分析法測定。
7.按照權利要求6的方法，其中MMP水平通過ELISA測定。
8.按照權利要求1-7任意之一的方法，其中還測定金屬蛋白酶的組織抑制劑的水平。
9.按照權利要求1-8任意之一的方法，其中在獲取子宮洗液同時收集子宮內膜表面細胞樣品，子宮內膜細胞用于細胞學檢查，以便確定倍性和核的形態(tài)測定，而MMP的水平與DNA倍性相關在存在子宮內膜癌時其作為子宮內膜癌預后的指標。
10.評價子宮內膜癌預后的方法，包括以下步驟測量接受子宮內膜癌手術的患者實施手術前得到的子宮洗液中的MMP活性；從所述患者體內獲得子宮內膜細胞樣品；獲得子宮內膜腫瘤樣品和附近正常的子宮內膜樣品，用于組織學檢查；聯(lián)系MMP活性、DNA倍性和腫瘤的級別和類型，作為預后的指標。
11.檢測因原發(fā)子宮內膜癌接受保守性治療的患者子宮內膜癌復發(fā)的方法，包括以下步驟從患者體內獲取子宮洗液樣品；測定洗液中的MMP水平。
12.監(jiān)測子宮內膜癌推測治療效果的方法，包括以下步驟從患者體內獲取子宮洗液樣品；測定洗液中的MMP水平，由此檢測是否子宮內膜癌已復發(fā)。
13.按照權利要求11或12的方法，其中對子宮洗液中總明膠水解活性進行測定。
14.按照權利要求11或12的方法，其中對MMP-2和/或MMP-9的活性水平進行測定。
15.按照權利要求11或12的方法，其中通過酶譜，任選地與光密度測量法結合檢測MMP活性。
16.按照權利要求11或12的方法，其中用ELISA、熒光分析法、化學發(fā)光分析法、或放射免疫分析法測定酶水平。
17.按照權利要求16的方法，其中用ELISA或化學發(fā)光分析法測定MMP水平。
18.按照權利要求17的方法，其中用ELISA測定MMP水平。
19.按照權利要求14的方法，其中通過定量光密度計量酶譜或ELISA測定MMP-2和MMP-9的水平。
20.檢測子宮內膜癌存在和/或風險的試劑盒，包括(a)沖洗子宮腔的合適溶液，(b)輸送、回收和收集子宮洗液的裝置。
21.按照權利要求20的試劑盒，進一步含有(c)測定所述洗液中MMP水平的試劑。
22.按照權利要求20或21的試劑盒，進一步含有一個或多個(d)獲取子宮內膜上皮細胞樣品的裝置，(e)一個或多個顯微鏡載玻片，(f)裝有組織固定液的容器。
23.按照權利要求20到22任意之一的試劑盒，包括(a)用于沖洗子宮腔的無菌生理可接受溶液，(b)無菌注射器，(c)無菌輸液管或導液管，(d)用于裝子宮洗液的容器，以及任選地(e)子宮刷，和/或(f)一個或多個顯微鏡載玻片。
24.按照權利要求23的試劑盒，另外還包括裝有組織固定液的容器。
25.按照權利要求23或24的試劑盒，其中固定液是4％的多聚甲醛。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析是否患子宮內膜癌和/或是否存在子宮內膜癌風險的方法,該方法通過測量子宮洗液中基質金屬蛋白酶－2和/或基質金屬蛋白酶－9的水平實現(xiàn)。本方法可以定性或定量,并適用于大規(guī)模篩分和臨床病例。
文檔編號C12Q1/37GK1257550SQ98805312
公開日2000年6月21日 申請日期1998年3月20日 優(yōu)先權日1997年3月20日
發(fā)明者亞歷山大·羅帕塔, 洛伊絲·A·薩拉蒙森, 邁克爾·A·奎因 申請人:默爾本大學, 普利斯·享利醫(yī)學研究院