子宮內膜癌生物標志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了SPARCL1作為子宮內膜癌的診治標志物的用途。據(jù)此可將SPARCL1用于開發(fā)診斷子宮內膜癌的產品、開發(fā)治療子宮內膜癌的藥物。本發(fā)明的研究成果為臨床醫(yī)師制定個性化治療方案提供理論基礎、并且能夠為子宮內膜癌藥物的開發(fā)提供新的藥物靶點。
【專利說明】
子宮內膜癌生物標志物
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥診斷、治療、預測預后領域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測SPARCL1 異常為手段的癌癥診斷、預測預后方法;及激活SPARCL1基因或蛋白質的癌癥治療劑。
【背景技術】
[0002] 子宮內膜癌（endometrial carcinoma或carcinoma of endometrium,EC)是發(fā)生 于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內膜腺體的腺癌最常見，為女性生殖道 三大惡性腫瘤之一，占女性全身惡性腫瘤7%，在全世界范圍不同地區(qū)其發(fā)病率有差異，是 西方工業(yè)化國家最常見的婦科惡性腫瘤，北美、北歐地區(qū)發(fā)病率最高，亞洲日本、印度及中 南美等地區(qū)發(fā)病率較低。我國尚缺乏子宮內膜癌比較詳盡的流行病學調查資料，估計與日 本發(fā)病情況相仿。北美及歐洲發(fā)達國家高于發(fā)展中國家，前者是后者的10倍，其發(fā)病率位于 乳腺癌、大腸癌、肺癌之后，是女性全身第四位常見惡性腫瘤，位居女性生殖道惡性腫瘤第 一位。
[0003] 雖然子宮內膜癌癥狀出現(xiàn)較早、診斷相對較容易。但是在實際臨床工作中關于子 宮內膜癌的診斷及治療仍存在一些爭議。腫瘤的惡性程度及病變范圍，包括手術分期、組織 學類型、腫瘤分級、肌層浸潤深度、淋巴轉移及子宮外轉移等與子宮內膜癌的預后有關。因 此，早期診斷子宮內膜癌非常重要。目前，子宮內膜癌的診斷主要依據(jù)病史及臨床表現(xiàn)，B 超、CT及MRI等影像學檢查，診斷性刮宮，宮腔鏡，腫瘤標志物CA-125等輔助檢查。其中CA-125還可以作為療效觀察的指標。但CA-125的缺乏組織敏感性和特異性，在卵巢上皮性腫 瘤、子宮內膜癌、子宮內膜異位癥、消化系統(tǒng)腫瘤等疾病中均可檢測到CA-125水平升高。因 此，尋找對子宮內膜癌特異性高的腫瘤標志物成為了研究熱點。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測SPARCL1基因或蛋白表達差異來診斷子 宮內膜癌的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測SPARCL1基因或蛋白表達差異來預測子 宮內膜癌預后的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過激活SPARCL1基因或SPARCL1蛋白來治療子 宮內膜癌的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療子宮內膜癌的藥物的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療子宮內膜癌的藥物。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：
[0010]本發(fā)明提供了檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的產品在制備子宮內膜癌診斷工 具中的用途。
[0011]本發(fā)明還提供了檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的產品在制備預測子宮內膜癌 預后工具中的用途。
[0012] 進一步，所述檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的產品包括檢測SPARCL1基因或 SPARCL1蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合SPARCL1基因的核酸或者能夠結合 SPARCL1蛋白的物質（例如抗體）。所述核酸能夠檢測SPARCL1基因的表達水平;所述物質能 夠檢測SPARCL1蛋白的表達水平。
[0013]本發(fā)明的檢測SPARCL1基因的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功 能：如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、AS0 法、高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。
[0014] 包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有 期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。
[0015] 進一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，擴增不應突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴增 的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴增片段長度多態(tài)性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。
[0016] 上面所述的核酸包括擴增SPARCL1基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過 化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O計，并通 過化學合成來制備。
[0017] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為QPCR實驗中使用的擴增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0018] 上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本 領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通 過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴 增它來制備。
[0019] 本發(fā)明的檢測SPARCL1蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例 如，可以包括ELI SA、放射免疫測定法、免疫組織化學法、Wes tern印跡等。
[0020] 本發(fā)明的檢測SPARCL1蛋白的產品包括特異性結合SPARCL1蛋白的抗體或其片段。 可以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質 即可。本發(fā)明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指 保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可 以包括F(at/ )2、Fat/、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V 區(qū)（雙抗體）、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測SPARCL1蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼 抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。
[0021 ]抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶 蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免 疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交 瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的SPARCL1蛋白或其部分對獲得的抗體 實施抗原特異性純化來獲得針對SPARCL1蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w:用 與上文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后 使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得 的抗體的序列信息來獲得抗體片段。
[0022] 標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可 以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用DMS0、緩沖劑、等準 備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸 如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-NH2、生物素標記試劑盒-SH (DojindoLaboratories);堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-NH2、堿性磷 酸酶標記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories);過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標 記試劑盒-NH2、過氧化物酶標記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻膽蛋白標記試劑 盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2， B-藻紅蛋白標記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標記試劑盒SH (DojindoLaboratories);焚光標記試劑盒諸如焚光素標記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555標記試劑盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647標記試劑盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗體 標記試劑盒、Qdot(TM)抗體標記試劑盒（Invitrogen Corporation)和EZ-標記物蛋白質標 記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標記 的抗體或其片段。
[0023] 作為依照本發(fā)明的檢測產品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品 或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、 血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材 料。
[0024] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。
[0025] 在本發(fā)明中，"預后"是指癌癥患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過 程或結果。在本說明書中，預后可以是通過手術處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預后可以通過檢查生物標志物即3?六1?(^1蛋白或 編碼SPARCL1蛋白的基因來預測。預后預測可以這樣進行:根據(jù)生物標志物的有或無，或者 升高或降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。
[0026] 在本發(fā)明中，"預后良好"是指在通過手術處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之 后，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘?，預后好可以意 指在這樣長時間內存活、無轉移、無復發(fā)、或無再發(fā)。例如，預后良好可以意指至少3年或尤 其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉移或復發(fā)。預后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如 本文中所使用的，"預后良好"還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現(xiàn)疾病如轉移，但是 惡性低且不嚴重地影響生存能力。
[0027] 在本發(fā)明中，"預后不良"是指患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短 時期（例如1、2、3、4、5年或更短）內發(fā)生致命狀況?；蛘撸A后差是指在這樣的短時期里死 亡、轉移、復發(fā)、或再發(fā)。例如，預后差可以意指至少3年或尤其至少5年內復發(fā)、轉移、或死 亡。
[0028] 預測預后是指預測患者狀況的過程或結果，并不意味著能以100%的準確度預測 患者狀況的過程或結果。預測預后是指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而并不意 味著通過與某些過程或結果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結果的可能性。如本 發(fā)明而言，本發(fā)明中SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的 患者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。
[0029] 進一步，所述檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的產品可以是檢測SPARCL1基因或 SPARCL1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試 劑的高通量測序平臺。
[0030]本發(fā)明還提供了一種診斷子宮內膜癌的工具，所述工具能夠檢測SPARCL1基因或 SPARCL 1蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合SPARCL 1基因的核酸或者能夠結合 SPARCL1蛋白的物質（例如抗體）。所述核酸能夠檢測SPARCL1基因的表達水平;所述物質能 夠檢測SPARCL1蛋白的表達水平。
[0031]進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。
[0032] 進一步，所述診斷子宮內膜癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量 測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷子宮內膜癌的工具，隨著高通量測序技術的 發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人 群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知 SPARCL1基因的異常與子宮內膜癌相關也屬于SPARCL1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范 圍之內。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種預測子宮內膜癌預后的工具，所述預測子宮內膜癌預后工具 包括能夠結合SPARCL1基因的核酸或者能夠結合SPARCL1蛋白的物質(例如抗體）。所述核酸 能夠檢測SPARCL1基因的mRNA水平;所述物質能夠檢測SPARCL1蛋白的表達水平。
[0034]進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。
[0035] 進一步，所述預測子宮內膜癌預后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高 通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷子宮內膜癌的工具，隨著高通量測序技 術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正 常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知 SPARCL1基因的異常與子宮內膜癌相關也屬于SPARCL1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范 圍之內。
[0036] 本發(fā)明的檢測產品、診斷工具中使用的抗SPARCL1抗體或其片段所識別的氨基酸 的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結合SPARCL1即可。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種診斷子宮內膜癌或預測子宮內膜癌預后的方法，所述方法包 括如下步驟：
[0038] (1)獲取受試者的樣品；
[0039 ] (2)檢測受試者樣品中SPARCL1基因或蛋白的表達水平；
[0040] (3)將測得的SPARCL1基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯(lián)起來。
[0041] (4)與對照相比，SPARCL1基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被診斷為子宮 內膜癌，或該受試者被確定為預后不良。
[0042]本發(fā)明還提供了一種子宮內膜癌的治療方法，所述方法包括激活SPARCL1基因或 SPARCL1蛋白。
[0043]進一步，所述方法包括促進SPARCL1基因的表達，或促進SPARCL1蛋白的表達或增 強SPARCL1蛋白的活性。
[0044] 本發(fā)明還提供了一種癌癥藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后 或在對癌癥模型動物施用測試藥物后的某個時期測量SPARCL1基因或者SPARCL1蛋白的表 達水平來測定癌癥藥物改善癌癥預后的效果。更具體地說，當SPARCL1基因或者SPARCL1蛋 白的表達水平在添加或施用測試藥物后升高時或者恢復正常水平時，可選擇該藥物作為改 善癌癥預后的治療藥物。
[0045] 本發(fā)明還提供了一種含有SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的激活劑的藥物。
[0046] 本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療子宮內膜癌的藥物中的應用。
[0047]本發(fā)明的SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的激活劑不受限制，只要是可以促進或者增 強SPARCL1或涉及SPARCL1上游或下游途徑的物質的表達或活性，且對于治療癌癥有效的藥 物即可。
[0048] 進一步，所述激活劑包括SPARCL1基因、SPARCL1蛋白、促進型miRNA、促進型轉錄調 控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0049] 所述激活劑還包括包含攜帶SPARCL1基因的載體或者宿主細胞。
[0050] 本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補充內源性的SPARCL1蛋白的缺失或不足，通過 提尚SPARCL1蛋白的表達，從而治療因 SPARCL1蛋白缺之導致的子宮內U旲癌。另一方面可以 用于增強SPARCL1蛋白的活性，從而治療子宮內膜癌。
[0051] 本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨施用或與其它藥物一起施用。可以與本發(fā)明的藥 物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預防性藥物的效果即 可，優(yōu)選的是，用于治療或預防癌癥的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰 胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司汀;抗代謝物，諸如 依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽 (cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿啼啶、替加氟吉美啼啶奧替拉西鉀、去氧氟尿 苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤;植物生物堿，諸 如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和 長春堿;抗癌抗生素，諸如放線菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁 stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、啦柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素 C、和米托蒽醌； 基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑;激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、 雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、 潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾 劑，諸如干擾素 α、干擾素 β、干擾素 γ、白介素、烏苯美司、干BCG、和香菇多糖;和分子靶向藥 物，諸如伊馬替尼（imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲 妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。
[0052]本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、 舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。
[0053]本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預防效果即 可，包括但不限于靜脈內，腹膜內，眼內，動脈內，肺內，口服，小泡內，肌肉內，氣管內，皮下 的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關節(jié)內，心室內，直腸，陰道， 顱骨內，尿道內，肝內，瘤內。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。 [0054]本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可 以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例 如對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。
[0055] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷子宮內膜癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有子宮內 膜癌、也包括判斷受試者是否存在患有子宮內膜癌的風險。
[0056] 本文所用的"治療"涵蓋患有相關疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關的 疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：
[0057] (1)預防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾 病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；
[0058] (2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生;或者
[0059] (3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。
[0060] 術語"治療"通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應用），其中可達到某些預 期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止）、改善病癥和治愈 病癥。還包括作為預防措施(例如預防）的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危 險的患者的用途，也包括在術語"治療"中。
[0061] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0062] 本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷子宮內膜癌的分子標志物，使用該分子標志物可以在子 宮內膜癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。
[0063]另外，通過預測患者的預后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方 案策略。
[0064]本發(fā)明的包括SPARCL1基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的子宮內膜癌的 治療藥物。
【附圖說明】
[0065] 圖1顯示利用Western blot檢測SPARCL1蛋白在子宮內膜癌組織與正常子宮內膜 組織中的表達情況；
[0066] 圖2顯示利用Western blot檢測SPARCL1基因過表達情況。
[0067]具體的實施方式
[0068] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0069] 實施例1基因芯片篩選差異表達基因
[0070] 1、樣本收集：
[0071] 子宮內膜癌組織樣本:收集子宮內膜癌患者，全部患者均經(jīng)手術治療，手術石蠟標 本10例。所有患者均經(jīng)過病理檢查確診患有子宮內膜癌。其他入組條件為:所有患者入院前 未接受過任何治療:未合并其他惡性腫瘤;未合并其他激素相關性疾病;臨床資料完整。 [0072] 10例子宮內膜癌患者，發(fā)病平均年齡58歲。患者主要臨床表現(xiàn)為陰道不規(guī)則出血、 下腹痛、月經(jīng)紊亂、陰道排液等，亦有部分患者無明顯癥狀而于健康查體發(fā)現(xiàn)。子宮內膜癌 標本經(jīng)HE染色切片，組織形態(tài)學確診為子宮內膜癌。
[0073] 正常子宮內膜組織樣本：10例正常子宮內膜手術石蠟標本。樣本來源的病人所患 疾病包括:子宮肌瘤、子宮脫垂、膀朧膨出、直腸膨出。
[0074] 2、組織RNA的獲取
[0075] 使用Trizol-步法提取組織總RNA，通過Nanodrop ND-1000讀取260nm和280nm處 的吸光度值(A)測定RNA溶液的純度。經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察， 檢測RNA的完整性。
[0076] 3、基因芯片雜交及掃描
[0077] 總RNA經(jīng)線性化擴增后，cy3-UTP標記，熒光標記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對標記好的cRNAs進行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達譜芯片(4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0078] 4、芯片數(shù)據(jù)處理與分析
[0079] 雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點后，將數(shù)據(jù)導入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達基因。
[0080] 5、統(tǒng)計學處理
[0081] 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0082] 6、結果
[0083] 芯片結果顯示，子宮內膜癌組織與正常子宮內膜組織之間共篩選出654個差異表 達基因，其中表達水平上調的基因421個，表達水平下調的基因233個。
[0084]實施例2大樣本驗證篩選出的差異表達基因
[0085]考慮現(xiàn)有技術中還未見關于該基因與子宮內膜癌相關性進行研究的基因作為候 選基因，同時考慮基因測序的結果，選擇SPARCL1基因（其表達在子宮內膜癌組織中下調)進 行驗證。
[0086] 1、樣本收集
[0087]按照實施例1的方法收集子宮內膜癌組織50例，正常子宮內膜組織60例。
[0088] 2、在mRNA水平上進行驗證
[0089] 2.1提取組織RNA
[0090] 步驟同實施例1。
[0091] 2.2逆轉錄
[0092] 使用逆轉錄試劑盒，用逆轉錄緩沖液對lyg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μ1 反應體系，每個樣品取lyg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分:DEPC水，5 X逆 轉錄緩沖液，10mm〇l/l dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 MMLVRT，模板 RNA。42 °C孵育1小時，72 °C 10分鐘，短暫離心。
[0093] 2.3PCR
[0094] 使用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計mRNA焚光定量上下游PCR引物，合成 引物序列，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒操作，具體步驟按說明書進行操作，采 用25μ1反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可 靠性。配制以下反應體系(如表1所示），各項操作均于冰上進行：
[0096]
[0095] 表1熒光定量PCR各組分及相應體積
[0097]
[0098] 以GAH)H為內參，以SYBR Green I作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR 儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△ ACT法進行相對定量。
[0099] SPARCL1基因引物序列如下所示：
[0100] 上游引物：5'-TCAATAAGCACATTCAAG-3'（SEQ ID N0.1);
[0101] 下游引物：5'-ATTACCATCATCAGTAGG-3'（SEQ ID N0.2)。
[0102] GAPDH基因引物序列如下所示：
[0103] 上游引物：5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0104] 下游引物：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0105] 2.4結果
[0106] 結果顯示，與正常子宮內膜組織相比，子宮內膜癌組織中SPARCL1基因的mRNA水平 明顯下調，相對表達量為〇. 18 ±0.012，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。
[0107] 3、在蛋白水平上進行驗證
[0108] 3.1提取組織總蛋白
[0109]按照EpiQuik組織/細胞總蛋白提取試劑盒的說明書進行蛋白提取的操作。
[0110] 3.2Western blot檢測
[0111] 將提取的蛋白定量進行SDS-PAGE電泳，之后進行轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、 顯色。
[0112] 3.3統(tǒng)計學處理
[0113]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進行分析，以β-actin為內參，將SPARCL1蛋 白條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統(tǒng) 計學意義。
[0114] 3.4 結果
[0115]結果如圖1所示，與正常子宮內膜組織相比，子宮內膜癌組織中SPARCL1蛋白水平 顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇. 05)。
[0116] 實施例3 SPARCL1基因過表達
[0117] 1、質粒構建
[0118] 根據(jù)SPARCL1基因的編碼序列設計擴增引物，引物的設計為本領域技術人員所熟 知。從成人胎腦的cDNA文庫(clontech公司，貨號：638831)中擴增全長的5?六1?(^1基因的編 碼序列，上述cDNA序列插入到真核細胞表達載體pcDNA3. 1中，連接獲得的重組載體 pcDNA3.1-SPARCL1用于后續(xù)實驗。
[0119] 2、子宮內膜癌細胞的培養(yǎng)與轉染
[0120] 2.1細胞培養(yǎng)
[0121] Ishikawa3-H-12細胞系均用50ml的培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清，l〇〇U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素）中，在37 °C，5 %⑶2飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培 養(yǎng)。
[0122] 2.2細胞轉染
[0123] 1、轉染前一天將0.5_2*105個腫瘤細胞懸浮于500μ1不含抗生素的培養(yǎng)基，接種至 24孔培養(yǎng)板。
[0124] 2、轉染當天細胞密度應達80%-90%，準備以下復合物Α:將lyg質粒DNA稀釋于無 血清培養(yǎng)基中，輕輕混勾；復合物B:取4μ1 Lipofectamine2000稀釋于無血清培養(yǎng)基中，混 勻。
[0125] 3、將復合物A和B混合，輕輕混勻，室溫孵育。
[0126] 4、將100μ1脂質體復合體加入腫瘤細胞中，上下左右輕輕混勻，將細胞放入37°C含 5 % C02培養(yǎng)箱孵育5-7小時。
[0127] 5、加 lml含有2倍正常血清和抗生素濃度的生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞18-24小時。
[0128] 3、利用QPCR實驗檢測pcDNA3.1-SPARCL1的過表達情況
[0129] 3.1提取細胞總RNA利用常規(guī)方法進行操作。
[0130] 3.2逆轉錄
[0131] 步驟同實施例2。
[0132] 3.3QPCR
[0133] 步驟同實施例2。
[0134] 3.4 結果
[0135] 結果顯示，pcDNA3.1-SPARCL1能夠成功過表達，相對表達量為5.94 ± 0.78，差異具 有統(tǒng)計學意義(P〈〇.〇5)。
[0136] 3、Western blot實驗檢測pcDNA3 · 1-SPARCL1 過表達情況
[0137] 步驟同實施例2。
[0138] 結果如圖2所示，與轉染pcDNA3. 1組相比，轉染pcDNA3. 1-SPARCL1的細胞中 SPARCL1蛋白的含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。
[0139] 實施例4 SPARCL1基因的表達對子宮內膜癌細胞增殖能力的測定
[0140] 1、步驟：
[0141] 應用5-溴-2'脫氧尿嘧啶(Brd U)標記及檢測試劑盒。參照試劑盒使用說明，細胞 轉染(轉染步驟同實施例3)48小時后，吸棄培養(yǎng)基，加入Brd U標記培養(yǎng)基，37°C，5 %⑶2培 養(yǎng)箱中培育60min。棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗后，以70 %乙醇固定，過夜。用一抗為小鼠的抗Brd U抗體，二抗為帶FITC的抗小鼠的熒光抗體，進行免疫反應。然后進行流式細胞學檢測。
[0142] 2、Brd U摻入結果：
[0143] 結果顯示：轉染pcDNA3 · 1細胞組摻入率平均為：（28 · 59 ± 1 · 37) % ; pcDNA3 · 1-SPARCL1細胞組摻入率平均為（11.64 ±0.53) %，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。上述實驗 結果表明，SPARCL1基因表達抑制了子宮內膜癌細胞的增殖。
[0144] 實施例7 Transwell實驗檢測SPARCL1基因表達對細胞迀移的影響
[0145] 步驟：
[0146] 1、從-80 °C的冰箱中取出凍存的Matr i ge 1物，然后在4 °C溫度條件下過夜，使其變 成液體。
[0147] 2、取出200μ1無血清細胞培養(yǎng)基，加入50μ1的Matrigel試劑，在低溫條件，最好是 在冰面上操作將其混和均勻，然后各加入1〇〇μ1，放在37°C，二氧化碳的培養(yǎng)箱中培育5h，此 間常觀察液體情況，當液體變成稍白色時，說明其已變?yōu)槟虘B(tài)。
[0148] 3、將轉染過的細胞(按照實施例3步驟操作）用胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基清 洗3次，然后計數(shù)，再將其配成細胞懸浮液。
[0149] 4、用無血清的培養(yǎng)基將凝膠輕輕洗1次，然后將2*105細胞懸浮于100μΙ RPMI 1640中，再接種于transwell上室。
[0150] 5、下室加600μ1 10%FBS RPMI 1640。
[0151] 6、37 °C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h后，取出transwe 11小室，每組均重復4個樣本。
[0152] 7、其中1個小室棄去培養(yǎng)基，用無鈣的roS洗3遍，4%多聚甲酵固定lOmin，棉簽擦 掉上層未迀移的細胞，PBS洗3遍，結晶紫染色或Giemsa染色，在顯微鏡下觀察。剩余3個小室 將其下層迀移細胞用0.25%膜蛋白酶消化，計算迀移細胞數(shù)。
[0153] 結果：
[0154] 迀移實驗結果顯示，轉染pcDNA3. 1細胞組細胞迀移個數(shù)平均為242個，轉染 pcDNA3.1-SPARCL1細胞組細胞迀移個數(shù)平均為147個，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。
[0155] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的產品在制備診斷子宮內膜癌或預測子宮內膜癌 預后的工具中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的產 品包括檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的表達水平的產品。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述產品包括能夠結合SPARCL1基因的 核酸或者能夠結合SPARCL1蛋白的物質；所述核酸能夠檢測SPARCL1基因的表達水平;所述 物質能夠檢測SPARCL1蛋白的表達水平。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述核酸是實時定量PCR中使用的特異擴 增SPARCL1基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。5. -種診斷子宮內膜癌或預測子宮內膜癌預后的工具，其特征在于，所述工具包括能 夠檢測SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的表達水平的工具。6. 根據(jù)權利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能夠結合SPARCL1基因的核 酸或者能夠結合SPARCL1蛋白的物質；所述核酸能夠檢測SPARCL1基因的表達水平;所述物 質能夠檢測SPARCL1蛋白的表達水平。7. 根據(jù)權利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是實時定量PCR中使用的特異擴 增SPARCL1基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。8. -種治療子宮內膜癌的藥物，其特征在于，所述藥物包含SPARCL1基因或SPARCL1蛋 白的激活劑。9. 根據(jù)權利要求8所述的藥物，其特征在于，所述激活劑能夠促進或增強SPARCL1或涉 及SPARCL1上游或下游途徑的物質的表達或活性。10. 權利要求8或9所述的激活劑在制備治療子宮內膜癌的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105907879SQ201610491574
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】楊承剛, 任靜
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司