專利名稱：：He4與其它生化標(biāo)記物在評(píng)估子宮內(nèi)膜癌和子宮癌中的應(yīng)用的制作方法HE4與其它生化標(biāo)記物在評(píng)估子宮內(nèi)膜癌和子宮癌中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
：本公開一般性涉及癌癥的診斷、分級(jí)、分期和預(yù)后領(lǐng)域。更具體來說，本公開涉及了子宮內(nèi)膜癌和子宮癌領(lǐng)域。本公開還涉及了使用蛋白表達(dá)進(jìn)行診斷、分級(jí)、分期和預(yù)后的領(lǐng)域。癌癥包括范圍廣泛的疾病，在世界范圍內(nèi)大約每4個(gè)人中就有1個(gè)人受到影響。癌癥的負(fù)面影響的嚴(yán)重性是深刻的，普遍影響到了醫(yī)療保險(xiǎn)和程序以及社會(huì)。由于多種類型的癌癥標(biāo)志是惡性細(xì)胞的快速和不受調(diào)控的增殖，因此改善針對(duì)癌癥的方法的一個(gè)決定性難題是對(duì)早期檢測和診斷的需求。早期檢測被廣泛認(rèn)為是降低癌癥死亡率的最好方法。相應(yīng)地，已經(jīng)做了許多嘗試以開發(fā)出準(zhǔn)確而可靠的診斷惡性病癥存在的標(biāo)準(zhǔn)。具體來說，已經(jīng)針對(duì)被稱為腫瘤相關(guān)抗原的血清學(xué)定義的抗原性標(biāo)記物的應(yīng)用進(jìn)行了研究，這些腫瘤相關(guān)抗原或者僅由癌癥細(xì)胞表達(dá)，或者以明顯較高的水平存在于患有惡性病癥的對(duì)象中。然而，由于腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的高度異質(zhì)性，例如癌抗原的極端多樣性，因此對(duì)癌癥診斷中有用的其它腫瘤標(biāo)記物存在著需求。已知有許多與癌相關(guān)抗原具有反應(yīng)性的單克隆抗體。這些單克隆抗體結(jié)合多種不同的癌相關(guān)抗原，包括糖蛋白、糖脂和粘蛋白。許多這類單克隆抗體識(shí)別在來源于給定的細(xì)胞譜系或組織類型的某些腫瘤但不是其它腫瘤上表現(xiàn)出受限表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。表現(xiàn)出可用于鑒定特定類型的惡性腫瘤的腫瘤相關(guān)抗原的例子相對(duì)較少。例如單克隆抗體B72.3，特異性地結(jié)合一種高分子量(〉106Da)的腫瘤相關(guān)粘蛋白抗原，該抗原選擇性地表達(dá)于許多不同的癌上，包括即便不是所有也是大部分的卵巢癌、絕大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌。然而，在外科切除腫瘤后檢測細(xì)胞相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物，例如被B72.3所識(shí)別的粘蛋白抗原，對(duì)于診斷篩查來說可能用途有限，在診斷篩査中在實(shí)體腫瘤塊積累以前對(duì)惡性病癥的早期檢測是優(yōu)選的。通過篩査外科切除的樣本的腫瘤相關(guān)抗原對(duì)特定類型的癌癥進(jìn)行診斷時(shí)，通常只有在檢測到積累的腫瘤塊后才進(jìn)行有創(chuàng)手術(shù)，這種診斷方法的替代方法是提供可用于在得自無創(chuàng)或微創(chuàng)術(shù)對(duì)象的樣本中檢測此類抗原的組合物和方法。例如，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和其它癌癥中，目前有許多可溶性腫瘤相關(guān)抗原，它們可在易獲得的生物流體樣品例如血清或粘膜分泌物中檢出。一種此類標(biāo)記物是CA125,其為一種也散落于血流中的癌相關(guān)抗原，可在血清中檢出(例如Bast等，1983N.Eng.J.Med.309:883;Lloyd等，1997Int.J.Cane.71:842)。血清和其它生物流體中的CA125水平同其它標(biāo)記物的水平一起被測量，如癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)、組織多肽特異性抗原(TPS)、唾液酸化TN粘蛋白(STN)和胎盤堿性磷酸酶(PLAP)，以試圖提供卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和其它癌的診斷和/或預(yù)后情況(例如Sarandakou等，1997ActaOncol.36:755;Sarandakou等，1998Eur.J.Gynaecol.Oncol.19:73;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2945;Kudoh等，1999Gynecol.Obstet.Invest.47:52;Ind等，1997Br.J.Obstet.Gynaecol.104:1024;Bell等，1998Br.J.Obstet.Gynaecol.105:1136;Cioffi等，1997Tumori83:594;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2949;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):3019)。但是，升高的血清CA125水平單獨(dú)或與其它已知指標(biāo)相結(jié)合，并不能提供對(duì)惡性腫瘤或特定惡性腫瘤如卵巢癌或子宮內(nèi)膜癌的確定診斷。例如，相對(duì)于宮頸癌和生殖道癌癥來說，陰道液和血清中CA125、CEA和SCC升高與良性婦科疾病中的炎癥最密切相關(guān)(例如Moore等，1998Infect.Dis.Obstet.Gynecol.6:182;Sarandakou等，1997ActaOncol.36:755)。血清CA125升高也可伴有神經(jīng)母細(xì)胞瘤，而CEA和SCC水7平升高可伴有結(jié)腸直腸癌。另一種標(biāo)記物，分化抗原間皮素，表達(dá)于正常間皮細(xì)胞表面還有某些癌細(xì)胞上，包括上皮性卵巢腫瘤和間皮瘤。與間皮素(Chang等，1992Cane.Res.52:181;Chang等，1992Int.J.Cane.50:373;Chang等，1992Int.J.Cane.51:548;Chang等，1996Proc.Nat.Acad.Sci.USA93:136;Chowdhury等，1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:669;Yamaguchi等，1994J.Biol.Chem.269:805;Kojima等，1995J.Biol.Chem.270:21984)和結(jié)構(gòu)相關(guān)的間皮素相關(guān)抗原(MRA;參見例如Scholler等，1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA96:11531)有關(guān)的組合物和方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)是已知的，包括如在WO00/50900和美國申請系列號(hào)No.09/513,597中描述的在癌癥檢測和治療中的應(yīng)用。對(duì)于可用于多標(biāo)記物診斷篩查的其它標(biāo)記物存在著迫切的需求。發(fā)明簡述本公開的主題包括評(píng)估患者是否患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品(如實(shí)體組織樣品、體液樣品或與患者身體的相關(guān)部位接觸過的流體樣品)中HE4的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。HE4表達(dá)升高是患者患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的指征。如果需要，可以將HE4表達(dá)的水平與參比值進(jìn)行比較，例如對(duì)應(yīng)于未患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者中HE4表達(dá)的參比值?；蛘?，樣品中HE4的表達(dá)可以與在較早時(shí)間從患者獲得的較早樣品中HE4的表達(dá)進(jìn)行比較。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法還包括評(píng)估樣品中第二個(gè)標(biāo)記物(例如CA125和/或SMRP)的表達(dá)。第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明了患者患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。本公開還涉及了評(píng)估患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者對(duì)治療的反應(yīng)的方法。該方法包括評(píng)估治療過程中不同時(shí)間從患者獲得的樣品中HE4的表達(dá)。在后來的時(shí)間HE4的表達(dá)降低(或表達(dá)隨時(shí)間降低)表明患者對(duì)治療有反應(yīng)。樣品中第二個(gè)標(biāo)記物(例如CA125和/或SMRP)的表達(dá)也可以被評(píng)估。第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)降低進(jìn)一步表明了患者對(duì)治療有反應(yīng)。本公開還涉及了在已經(jīng)進(jìn)行了子宮內(nèi)膜癌或子宮癌治療的患者中評(píng)估復(fù)發(fā)的方法。該方法包括在從治療后的患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，單獨(dú)評(píng)估或與一種或多種第二種標(biāo)記物組合評(píng)估。HE4的表達(dá)升高表明在患者中子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)了，第二種標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明了患者子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)。HE4的表達(dá)可以在例如治療后進(jìn)行多次評(píng)估。HE4的表達(dá)隨時(shí)間增加表明了患者子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開涉及了對(duì)患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的可能性進(jìn)行評(píng)估的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，單獨(dú)評(píng)估或與一種或多種第二種標(biāo)記物組合評(píng)估。HE4的表達(dá)升高與患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的可能性增加相關(guān)，第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明了患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了在患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者中對(duì)腫瘤進(jìn)行分期和/或分級(jí)的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4單獨(dú)或與一種或多種第二標(biāo)記物組合的表達(dá)。HE4(以及第二標(biāo)記物，如果評(píng)估的話)的表達(dá)升高表明了更晚期的癌癥階段和/或更高的癌癥等級(jí)。本文公開的主題的還有一個(gè)方面涉及評(píng)估被診斷患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者對(duì)于治療性干預(yù)(例如化療)的需要的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4單獨(dú)或與一種或多種第二標(biāo)記物組合的表達(dá)。HE4(以及第二標(biāo)記物，如果評(píng)估的話)的表達(dá)升高表明患者需要治療性干預(yù)。幾個(gè)表的簡述9表1是本文實(shí)施例1中描述的實(shí)驗(yàn)獲得的ROC(接受者操作特征，ReceiverOperatingCharacteristic)曲線數(shù)據(jù)的曲線下面積(AUC)分析的概述。表2是實(shí)施例2中描述的血清腫瘤標(biāo)記物的平均值和對(duì)于由每個(gè)被分析的標(biāo)記物進(jìn)行分組的每組值所確定的分期。表3是對(duì)于實(shí)施例2中描述的每個(gè)腫瘤標(biāo)記物計(jì)算出的ROC-AUC。表4是對(duì)實(shí)施例2中提出的組合中每個(gè)腫瘤標(biāo)記物獨(dú)立地在特異性為90%時(shí)的對(duì)數(shù)回歸分析。表5是對(duì)實(shí)施例2中提出的組合中每個(gè)腫瘤標(biāo)記物獨(dú)立地在特異性為95%時(shí)的對(duì)數(shù)回歸分析。表6是對(duì)實(shí)施例2中提出的組合中每個(gè)腫瘤標(biāo)記物獨(dú)立地在特異性為98%時(shí)的對(duì)數(shù)回歸分析。發(fā)明具體內(nèi)容本公開涉及這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即HE4a抗原是子宮內(nèi)膜癌和子宮("子宮體")癌存在等級(jí)和階段的指標(biāo)。本發(fā)明的主題總的來說涉及使用HE4標(biāo)記物或HE4與其它生物標(biāo)記物的組合評(píng)估婦女的子宮內(nèi)膜癌和子宮癌。評(píng)估HE4與子宮內(nèi)膜癌和子宮癌的一種或多種其它標(biāo)記物(特別是標(biāo)記物CA125和SMRP)可用于診斷這類癌癥在人類患者中的發(fā)生，以及評(píng)估這些癌癥對(duì)于各種類型治療的反應(yīng)。此外，對(duì)這些標(biāo)記物的評(píng)估可用于監(jiān)測這些癌癥在患者中的復(fù)發(fā)，或用于評(píng)估患者將發(fā)展這些癌癥的可能性。在美國，每年診斷出大約40，880例子宮癌新病例，導(dǎo)致7,310人死亡。對(duì)子宮癌進(jìn)行的外科分期表明75%患者患有I期疾病(Kottmeier，H丄.，Int.J.Gynaecol.Obstet.1971;9:172)。被診斷患有I期疾病的具有中度到高度風(fēng)險(xiǎn)因子的患者的復(fù)發(fā)率為20%到30%(Keys等，2004，Gynecol.O歸l.;92(3):744-751;Creutzberg等，2003，Gynecol.O腳l.,89(2):201-209)。在患有晚期III期和IV期疾病的患者中大約75%有血清CA125水平升高，而患有早期I期和II期疾病的患者只有17%升高(Niloff等，1984，Am.J.Obstet.Gynecol"148(8):1057-1058;Berchuck等，1989,CancerRes"49(8):2091-2095;OIt等，1990,Obstet.Gynecol.Surv.，45:570-577)。血清CA125水平升高已經(jīng)與子宮內(nèi)膜癌的階段和腫瘤向?qū)m頸、淋巴結(jié)和腹膜表面的擴(kuò)散相關(guān)聯(lián)(Ginath等，2002，Int.J.Gynecol.Cancer,12(4):372-375;Vuento等，1997，Gynecol.Oncol"64(1):141-146;Sood等，1997，Obstet.Gynecol.卯(3):441-447;Hsieh等，2002，Gynecol,Oncol"86(1):28-33;Powell等，2005,J.Reprod.Med"50(8):585-590)。目前CA125是最有用的檢測復(fù)發(fā)疾病的血清腫瘤標(biāo)記物。但是，CA125在檢測復(fù)發(fā)疾病中的用途充其量來說也是有限的。僅僅10%到20%患有早期疾病的患者和25%患有無癥狀復(fù)發(fā)疾病的患者有CA125升高(Niloff等，2002;Duk等，1986,Am.J.Obstet.Gynecol.，155(5):1097-1102)。已經(jīng)對(duì)許多新的血清腫瘤標(biāo)記物在子宮內(nèi)膜癌中的臨床用途進(jìn)行了研究，包括CA15.3、CA19.9、CA72.4、CEA、OVX1和M-CSF(Cherchi等，1999,Eur.J.Gynaecol.Oncol"20(4):315-317;Takeshima等，1994，GynecolOncol1994;54(3):321-326;Hareyama等，1996，J.Clin.Pathol"49(12):967-970;Olt等1996，Am.J.Obstet.Gynecol.，174(4):1316-1319;Beck等，1997，Gynecol.Oncol"65(2):291-296)。最近已經(jīng)使用了蛋白質(zhì)組學(xué)分析來鑒定子宮內(nèi)膜癌的新標(biāo)記物，例如蛋白伴侶10(Yang等，2004，J.ProteomeRes.，3(3):636-643)。在子宮內(nèi)膜癌的應(yīng)用中利用了多標(biāo)記物分析策略的研究很少。在本文描述的方法公開之前，到目前為止用于檢測復(fù)發(fā)疾病的最有希望的組合是CA125與CA19.9(Lo等，1999，CancerDetect.Prev.23(5):397-400)。11定義本文中使用的術(shù)語"樣品"是指可以與患者特異地相關(guān)聯(lián)的材料，從其中可以確定、計(jì)算或推斷出與患者有關(guān)的特定信息。樣品可以全部或部分由來自患者的生物材料構(gòu)成。樣品也可以是以某種方式與患者接觸過的材料，這種接觸方式使得對(duì)樣品進(jìn)行的測試可以提供與患者有關(guān)的信息。樣品也可以是已經(jīng)與其它材料接觸過的材料，這種其它材料不是患者的，但是能夠使第一材料隨后被測試以確定與患者有關(guān)的信息，例如樣品可以是探針或解剖刀的清洗液。樣品可以接觸患者之外的生物材料源，只要本
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的專業(yè)人員仍然能夠從樣品確定與患者有關(guān)的信息就行。還可以理解的是，不是樣品的外來材料或信息也可用于將患者與樣品結(jié)論性地聯(lián)系在一起。舉一個(gè)非限制性的例子，雙盲實(shí)驗(yàn)需要圖表或數(shù)據(jù)庫以將樣品與患者相匹配。本文中使用的術(shù)語"患者"是指作為分析對(duì)象以確定與生物體有關(guān)的信息的生物體。盡管在本文公開的方法的大部分實(shí)施方案中患者是人類，但所述方法不限于用于人類個(gè)體?；颊呖梢允且唤M人類?；颊咭部梢允侨说囊徊糠帧＿@種實(shí)施方案的一個(gè)非限制性的例子是，患者可以是與人體不相連的組織樣品，或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。在某些實(shí)施方案中，患者也可以是非人類的生物體。本文中使用的術(shù)語"參比值"是指當(dāng)與分析結(jié)果相比時(shí)與特定結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，參比值是根據(jù)對(duì)比較HE4a的表達(dá)與已知的臨床結(jié)果的研究進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來確定的。在本文的實(shí)施例部分中顯示了一些這樣的研究。但是，來自文獻(xiàn)的研究和本文公開的方法的用戶經(jīng)驗(yàn)也可用于產(chǎn)生或調(diào)整參比值。參比值也可以通過考慮與患者的醫(yī)療史、遺傳學(xué)、年齡和其它因素特別相關(guān)的情況和結(jié)果來確定。本文使用的術(shù)語"體液"是指從患者獲得的稠度基本為流體的材料，但是可以有固體或顆粒物質(zhì)與其相連。體液也可以含有不是來自于患者的材料和部分。例如體液可以用水稀釋，或可以含有防腐劑例如EDTA。體液的非限制性例子是血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、腦脊液、唾液、分泌組織和器官的粘膜分泌液、陰道分泌物、乳汁、眼淚、以及腹水液例如與非實(shí)體腫瘤有關(guān)的腹水液。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體等。生物流體還可以包括與對(duì)象或生物源接觸的液體溶液，例如細(xì)胞和器官培養(yǎng)基，包括細(xì)胞或器官條件培養(yǎng)基、灌洗液等。如果樣品是在治療性組合物或方法的施用前、施用時(shí)或施用后或在其后進(jìn)行的隨診階段過程中獲得的，那么樣品是"在治療過程中"從患者獲得的。該術(shù)語的使用明確地包含了樣品在進(jìn)行治療之前和之后(即為了評(píng)估治療的有效性或復(fù)發(fā))獲得的情況，以及在長期治療過程中間斷地獲取多個(gè)樣品的情況。具體說明本文公開的方法涉及HE4a，是本文描述的"四個(gè)二硫鍵核心"蛋白家族的成員。"四個(gè)二硫鍵核心"蛋白家族包含了功能多樣的酸和熱穩(wěn)定的小分子的異質(zhì)群組，其包括人類附睪四個(gè)二硫鍵核心蛋白、或"HE4a"(Kirchhoff等，1991Biol.R印rod.45:350-357;Wang等，1999Gene229:101;Schummer等，1999Gene238:375)。HE4cDNA首先從人類附睪中分離(Kirchhoff等，1991Biol.Reprod.45:350-357)，隨后HE4cDNA在從卵巢癌構(gòu)建的cDNA文庫中被高頻率檢出(Wang等，1999Gene229:101;Sclmmmer等，1999Gene238:375)。HE4a，"四個(gè)二硫鍵核心"蛋白家族的新成員，被描述在美國專利申請公布號(hào)No.2003/0108965Al和美國專利申請No.10/233,150中，在此引為參考，它包括了在本公開中使用的SEQIDNO名稱。HE4a顯示出與HE4高度相似但有所不同的序列。13對(duì)于本發(fā)明的目的來說，HE4或HE4a的檢測被認(rèn)為是同義的，其任一分子的檢測都可以用于本文描述的方法中。HE4a是否是與HE4不同的分子、或HE4a的序列是否只是代表了對(duì)已經(jīng)發(fā)表的HE4序列的校正，并不重要。本文公開的方法還部分涉及了用于對(duì)在對(duì)象中天然存在的細(xì)胞表面和/或可溶形式的HE4a、包括在患有某些癌癥(例如子宮內(nèi)膜癌)的對(duì)象中這類多肽的水平升高進(jìn)行檢測的組合物和方法。因此，本公開提供了通過特異性檢測這些細(xì)胞表面和/或可溶HE4a多肽而用于檢測和診斷對(duì)象的惡性腫瘤病癥的有用組合物和方法。按照本文公開的方法，可以在來自對(duì)象或生物來源的生物樣品中檢測可溶性人類HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)。生物樣品可以通過從對(duì)象或生物來源獲得血液樣品、活檢樣本、組織外植體、器官培養(yǎng)物、生物流體或任何其它的組織或細(xì)胞制備物來提供。對(duì)象或生物來源可以是人類或非人類的動(dòng)物、原代細(xì)胞培養(yǎng)物或改造的培養(yǎng)物細(xì)胞系，包括但不限于可以含有染色體整合的或游離的重組核酸序列的遺傳工程細(xì)胞系、永生化的或可以永生化的細(xì)胞系、體細(xì)胞雜交細(xì)胞系、分化的或可以分化的細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系等。在本文公開的方法的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)象或生物來源可以懷疑患有惡性腫瘤病癥或有惡性腫瘤病癥的風(fēng)險(xiǎn)，該病癥在某些其他的優(yōu)選實(shí)施方案中可以是子宮內(nèi)膜癌癥例如子宮內(nèi)膜癌，在本文公開的方法的某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)象或生物來源可以已知沒有這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)或存在。在某些實(shí)施方案中，生物樣品包括至少一種來自對(duì)象或生物來源的細(xì)胞，在其它某些優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是含有另一種腫瘤標(biāo)記物例如CA-125或可溶性人類間皮素相關(guān)抗原多肽的生物流體。生物流體典型為生理溫度下的液體，可以包括在對(duì)象或生物來源中存在、從中抽取、表達(dá)或以其他方式從中提取的天然存在的流體。某些生物流體源于特定的組織、器官或定位的區(qū)域，而某些其它的生物流體可以更為整體或全身地存在于對(duì)象中。生物流體的非限制性例子包括血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、腦脊液、唾液、分泌組織和器官的粘膜分泌液、陰道分泌物、乳汁、眼淚、以及腹水液例如與非實(shí)體腫瘤有關(guān)的腹水液。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體等。生物流體還可以包括與對(duì)象或生物源接觸的液體溶液，例如細(xì)胞和器官培養(yǎng)基包括細(xì)胞或器官條件培養(yǎng)基、灌洗液等。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是無細(xì)胞的液體溶液，例如血清、血漿或離心的尿液的上清液。在某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品含有完整的細(xì)胞，在某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品包含了含核酸序列的細(xì)胞提取物，該核酸序列編碼具有SEQIDNOS:11或13中顯示的氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段或變異體。在本文公開的方法的其它實(shí)施方案中，需要在進(jìn)行分析以前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行物理或化學(xué)的破碎或裂解，以提供分析用細(xì)胞內(nèi)容物。樣品中的"以可溶形式天然存在的分子"可以是可溶性蛋白、多肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂類、脂肪酸或類似物、或其衍生物；碳水化合物、糖或類似物、或其衍生物；核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相關(guān)的分子、或其衍生物等；或其任何組合，例如糖蛋白、糖脂、脂蛋白、蛋白脂或任何其它的可溶性生物分子或本文提供的生物樣品的無細(xì)胞組分。"以可溶形式天然存在的分子"也指溶液中或存在于生物樣品、包括本文提供的生物流體中的分子，并且它們不與完整細(xì)胞的表面結(jié)合。例如，以可溶形式天然存在的分子包括但不是必須限于溶質(zhì)；大分子復(fù)合物的成分；從細(xì)胞脫落、分泌或輸出的物質(zhì)；膠體；微?；蚣{米粒子或其它細(xì)的懸浮顆粒等。對(duì)象中惡性腫瘤病癥的存在是指對(duì)象中存在發(fā)育異常的、癌性的和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括例如贅生的、腫瘤的、非接觸性抑制的或致癌轉(zhuǎn)化的細(xì)胞等。出于說明而不是限制，在本文公開的方法中，惡性腫瘤病癥還可以是指對(duì)象中存在能夠分泌、脫落、輸出或釋放HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的癌細(xì)胞，以至于在來自對(duì)象的生物樣品中可以檢測到這種多肽的水平升高。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的癌細(xì)胞是惡性上皮細(xì)胞例如癌細(xì)胞，在特別優(yōu)選實(shí)施方案中這樣的癌細(xì)胞是惡性間皮瘤細(xì)胞，它們是在例如內(nèi)胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔中發(fā)現(xiàn)的鱗狀上皮或間皮細(xì)胞的變異體。在本文公開的方法的大多數(shù)優(yōu)選實(shí)施方案中，其存在意味著存在惡性腫瘤病癥的腫瘤細(xì)胞是子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，包括原發(fā)和轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。將惡性腫瘤分類為子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)準(zhǔn)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，來自原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤的人類子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的建立和表征也是同樣。在其它實(shí)施方案中，惡性腫瘤病癥可以是間皮瘤、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌或其它形式的癌癥，包括任何各種癌癥例如鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，也包括肉瘤和血液惡性腫瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。這些以及其它惡性腫瘤病癥的分類對(duì)于熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人來說是已知的，本公開提供了在這樣的惡性腫瘤病癥中無需過多試驗(yàn)就確定HE4a多肽的存在的方法。在本文包含的實(shí)施例中提供了參比值。這些值適合于本文公開的方法的實(shí)踐。但是應(yīng)該注意的是，本文公開的方法的使用并不限于那些參比值或數(shù)據(jù)。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員可以根據(jù)他們的具體需要獲得參比值。這樣的參比值可以在患者因?yàn)橐伤茞盒阅[瘤的子宮或子宮內(nèi)膜腫塊而進(jìn)行組織活檢程序時(shí)，通過分析患者的HE4a表達(dá)來獲得。獲得這類參比值的方法被包含在本文中并在實(shí)施例中提供。本文公開的方法的使用者可能希望獲得不同于本文所提供的參比值，以致力于特定的患者類型?？梢灶A(yù)見到這樣的類型可以包括年齡、遺傳背景、癌癥風(fēng)險(xiǎn)、醫(yī)療史、血型、生理特征例如體重，以及其它的類型。本文提供的用于在對(duì)象中篩查惡性腫瘤病癥的存在的方法，其特征可以是使用特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體或特異性針對(duì)HE4a多16肽的抗體。特異性針對(duì)HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的抗體容易產(chǎn)生為單克隆抗體或多克隆抗血清，或可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的方法產(chǎn)生為被設(shè)計(jì)成具有所需性質(zhì)的遺傳工程免疫球蛋白(Ig)。例如，作為說明而不是限制，抗體可以包括重組IgG、具有來自免疫球蛋白的序列的嵌合融合蛋白或"人源化的"抗體(參見例如美國專利Nos.5,693,762、5,585,089、4,816,567、5,225,539、5,530,101，在此引為參考)，它們都可以用于按照本文公開的方法檢測人類HE4a多肽。這樣的抗體可以按照本文提供的方法制備，包括下面描述的用HE4a多肽進(jìn)行免疫。例如，如本文所提供，公開了編碼HE4a多肽的核酸序列，因此本
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的專業(yè)人員可以常規(guī)制備這些多肽用作免疫原。例如將在下面更詳細(xì)描述的單克隆抗體如2H5、3D8和4H4，可用于實(shí)踐在本文公開的方法中的某些方法。術(shù)語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、其片段例如F(ab')2和Fab片段、以及作為與HE4a多肽特異性結(jié)合的分子的任何天然存在或重組產(chǎn)生的結(jié)合配偶體?？贵w，如果能夠以Ka大于或等于大約104M"、優(yōu)選大于或等于大約10SM'1、更優(yōu)選大于或等于大約106M"、更加優(yōu)選大于或等于大約1(^M"與HE4a多肽結(jié)合，就被定義為是"免疫特異性的"或特異性地結(jié)合。結(jié)合配偶體或抗體的親和性可以使用常規(guī)技術(shù)容易地確定，例如在Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660(1949)中描述的那些技術(shù)。其它蛋白作為HE4a多肽配偶體的確定，可以使用許多已知的用于鑒定和獲得與其它蛋白或多肽特異性相互作用的蛋白的任何方法來進(jìn)行，例如酵母雙雜交篩選系統(tǒng)，如在美國專利No.5,283,173和美國專利No.5,468,614中描述的那些，或其等同物。本文公開的方法也包括使用HE4a多肽和基于HE4a多肽的氨基酸序列的肽來制備與HE4a多肽特異性結(jié)合的結(jié)合配偶體和抗體?？贵w一般可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員所熟知的各種不同技術(shù)17中的任何一種來制備(參見例如Harlow和Lane,《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。在一種這樣的技術(shù)中，首先將含有HE4a多肽的免疫原，例如在表面上具有HE4a多肽的細(xì)胞或分離的HE4a多肽，注射到適當(dāng)?shù)膭?dòng)物中(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)，優(yōu)選按照預(yù)定的計(jì)劃加入一次或多次增強(qiáng)免疫，然后定期從動(dòng)物取血。然后可以從這些抗血清中通過例如使用與適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锱悸?lián)的多肽的親和層析方法，純化出特異性針對(duì)HE4a多肽的多克隆抗體。特異性針對(duì)HE4a多肽或其變異體的單克隆抗體可以使用例如Kohler和Milstein的技術(shù)(1976Eur.J.Immunol.6:511-519)以及對(duì)它進(jìn)行的改進(jìn)來制備。簡單來說，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需特異性(即與目的間皮多肽具有反應(yīng)性)的抗體的永生的細(xì)胞系。這樣的細(xì)胞系可以例如從上述免疫的動(dòng)物獲得的脾細(xì)胞來產(chǎn)生。然后通過例如與骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶、優(yōu)選為與被免疫的動(dòng)物同種同源者進(jìn)行融合，來使脾細(xì)胞永生化。例如，可以使用膜融合促進(jìn)劑例如聚乙二醇或非離子去污劑將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合幾分鐘，然后以低密度接種在支持雜交細(xì)胞生長但不支持骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇性培養(yǎng)基上。優(yōu)選的篩選技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺噴啶)進(jìn)行篩選。經(jīng)過足夠的時(shí)間，通常為大約1到2周之后，觀察到雜交體的集落。挑選單個(gè)集落并測試與多肽的結(jié)合活性。具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤是優(yōu)選的。本文公開的方法考慮到了產(chǎn)生與HE4a多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤。單克隆抗體可以從生長的雜交瘤集落的上清液中分離。此外，各種不同的技術(shù)可以用于增加產(chǎn)率，例如將雜交瘤細(xì)胞系注射到適合的脊椎動(dòng)物宿主例如小鼠或其它適合的宿主的腹膜腔中。然后可以從腹水液或血液中收獲單克隆抗體。污染物可以通過常規(guī)的技術(shù)例如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提從抗體中除去。例如，抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過在固定蛋白G或蛋白A上進(jìn)行層析來純化。在某些實(shí)施方案中，使用抗體的抗原結(jié)合片段可能是優(yōu)選的。這樣的片段包括Fab片段，它可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備(例如通過用木瓜蛋白酶消化來產(chǎn)生Fab和Fc片段)。Fab和Fc片段可以通過親和層析(例如在固定蛋白A柱上)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離。這樣的技術(shù)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，參見例如Weir，D.M.,《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》HandbookofExperimentalImmunology,1986，BlackwellScientific,Bostorio利用與編碼各種不同效應(yīng)蛋白的序列按閱讀框架連接的DNA序列編碼的免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域而對(duì)于預(yù)先選定的抗原具有特異結(jié)合親和性的的多功能融合蛋白，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的，例如公開于EP-B1-0318554、美國專利No.5,132,405、美國專利No.5,091,513和美國專利No.5,476,786。這樣的效應(yīng)蛋白包括多肽結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員熟悉的各種技術(shù)中的任何一種用來檢測融合蛋白的結(jié)合，這些技術(shù)包括但不限于生物素模擬序列(參見例如Luo等，1998J.Biotechnol.65:225，在此引為參考)、用可檢測的標(biāo)記部分進(jìn)行的直接共價(jià)修飾、與特異性標(biāo)記的報(bào)告分子的非共價(jià)結(jié)合、可檢測的底物的酶法修飾或固定在(共價(jià)或非共價(jià)地)固相支持物上。用于本文公開的方法的單鏈抗體也可以通過例如噬菌體展示這樣的方法來產(chǎn)生和篩選(參見例如美國專利No.5,223,409;Schlebusch等1997Hybridoma16:47;在此引為參考)。簡單來說，在該方法中，DNA序列被插入到絲狀噬菌體例如M13的基因m或基因VIII基因中。已經(jīng)開發(fā)了幾種帶有多克隆位點(diǎn)的載體用于插入(McLafferty等，Gene128:29-36，1993;Scott禾口Smith,Science249:386-390，1990;Smith禾口Scott,MethodsEnzymol.217:228-257，1993)。插入的DNA序列可以隨機(jī)產(chǎn)生，或可以是結(jié)合HE4a多肽的已知結(jié)合結(jié)構(gòu)域的變異體。使用這種方法可容易地產(chǎn)生單鏈抗體。一般來說，插入片段編碼6到20個(gè)氨基酸。插入序列編碼的肽展示在噬菌體表面上。表達(dá)了HE4a多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體通過與固定的HE4a多肽的結(jié)合來進(jìn)行篩選，例如使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的方法和本文公開的核酸編碼序列制備的重組多肽。未結(jié)合的噬菌體通過清洗液除去，清洗液一般含有10mMTris、1mMEDTA，并且不含鹽或含有低濃度鹽。結(jié)合的噬菌體用例如含有鹽的緩沖液洗脫。NaCl的濃度逐步增加，直到所有的噬菌體都被洗脫。一般來說，以較高親和力結(jié)合的噬菌體將被較高的鹽濃度所釋出。將洗脫的噬菌體在細(xì)菌宿主中繁殖?？梢赃M(jìn)行附加輪次的篩選以選出幾個(gè)高親和力結(jié)合的噬菌體。然后測定結(jié)合的噬菌體中插入片段的DNA序列。一旦知道了結(jié)合的肽的預(yù)測的氨基酸序列，就可以通過重組手段或合成方法制備足夠的肽，在本文中用作特異性針對(duì)HE4a多肽的抗體。當(dāng)抗體作為融合蛋白產(chǎn)生時(shí)，使用重組的方法。肽也可以被產(chǎn)生成兩個(gè)或多個(gè)相似的或不相似肽的串聯(lián)排列，以最大化親和力或結(jié)合。為了檢測與特異性針對(duì)HE4a多肽的抗體反應(yīng)的抗原決定簇，檢測試劑一般為抗體，它可以按照本文的描述制備。對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員來說，使用抗體檢測樣品中的多肽已知有各種不同的分析方式，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫熒光、免疫沉淀、平衡透析、免疫擴(kuò)散以及其它的技術(shù)。參見，例如Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988;Weir,D.M.，《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》HandbookofExperimentalImmunology,1986,BlackwellScientific,Boston。例如，分析可以以Western印跡的方式進(jìn)行，其中將來自生物樣品的蛋白制備物進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪ど喜⑹蛊渑c抗體反應(yīng)。然后可以使用適合的檢測試劑來檢測膜上抗體的存在，這是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的并將在下面描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析包括使用固定在固相支持物上的抗體來結(jié)合耙HE4a多肽并將其從其余的樣品中取出。然后可以使用與不同的HE4a多肽抗原性決定簇反應(yīng)的第二抗體來檢測結(jié)合的HE4a多肽，20例如含有可檢測的報(bào)告部分的試劑。作為非限制性的例子，根據(jù)本實(shí)施方案，識(shí)別不同抗原性決定簇的固定抗體和第二抗體可以是本文描述的選自單克隆抗體2H5、3D8和4H4的任何兩個(gè)單克隆抗體?；蛘?，可以使用競爭性分析，其中HE4a多肽用可檢測的報(bào)告部分標(biāo)記，并在將固定抗體與樣品孵育之后允許其與固定的HE4a多肽特異性抗體結(jié)合。樣品的成分對(duì)標(biāo)記的多肽與抗體結(jié)合的抑制程度表明了樣品與固定抗體的反應(yīng)性，因此表明了樣品中HE4a的水平。固相支持物可以是本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員已知的可以結(jié)合抗體的任何材料，例如微量滴定板中的測試孔、硝酸纖維素濾膜或其它適合的膜?；蛘?，支持物可以是珠子或圓盤，例如玻璃、纖維玻璃、膠乳或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯?？贵w可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的各種不同的技術(shù)固定在固相支持物上，這些技術(shù)在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有充分的描述。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測樣品中HE4a抗原多肽的分析方法是雙抗體夾心分析。該分析可以如下進(jìn)行，首先將固定在固相支持物、通常為微量滴定板的孔上的HE4a多肽特異性抗體(例如單克隆抗體如2H5、3D8或4H4)與生物樣品進(jìn)行接觸，使得樣品中天然存在的并具有與抗體反應(yīng)的抗原性決定簇的可溶性分子能夠與固定抗體結(jié)合(例如在室溫下30分鐘的孵育時(shí)間一般就足夠了)，以形成抗原-抗體復(fù)合物或免疫復(fù)合物。然后從固定的免疫復(fù)合物中除去未結(jié)合的樣品組分。接下來，加入特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的第二抗體，其中第二抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不會(huì)競爭性地抑制固定的第一抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與HE4a多肽的結(jié)合(例如，與固定在固相支持物上的單克隆抗體不同的單克隆抗體例如2H5、3D8或4H4)。第二抗體可以按照本文提供的方法可檢測地標(biāo)記，以便它可以被直接檢測。或者，第二抗體可以通過使用可檢測地標(biāo)記的第二(或"第二階段")抗-抗體、或通過使用本文提供的特異性檢測試劑而間接檢測。本文提供的方法不限于任何特定的檢測程序，因?yàn)槭煜っ庖叻治龇椒ǖ娜藛T將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在雙抗體夾心免疫分析中有大量的試劑和安排可用于免疫學(xué)檢測特定的抗原(例如間皮素多肽)。在使用上面描述的雙抗體夾心分析的本文公開的方法的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的固定抗體是多克隆抗體，第二種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體是多克隆抗體。任何非競爭性HE4a抗體的組合都可以與本文公開的方法一起使用。包括單克隆抗體、多克隆抗體及其組合。在本文公開的方法的某些其它實(shí)施方案中，第一種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的固定抗體是單克隆抗體，第二種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體是多克隆抗體。在本文公開的方法的某些其它的實(shí)施方案中，第一種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的固定抗體是多克隆抗體，第二種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體是單克隆抗體。在本文公開的方法的某些其它高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的固定抗體是單克隆抗體，第二種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體是單克隆抗體。例如，在這些實(shí)施方案中，應(yīng)該注意的是本文提供的單克隆抗體2H5、3D8和4H4識(shí)別HE4a多肽上不同的和非競爭性的抗原性決定簇(例如表位)，因此這些單克隆抗體的任何成對(duì)組合都可以使用。在本文公開的方法的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的固定抗體和/或第二種特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體可以是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的和本文提到的任何種類的抗體，例如，作為說明而非限制，是Fab片段、F(ab')2片段、免疫球蛋白V區(qū)融合蛋白或單鏈抗體。熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本文公開的方法包含了在本文公開和要求權(quán)利的方法中使用其它的抗體形式、片段、衍生物等。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗體可以含有可檢測的報(bào)告部分或標(biāo)記例如酶、染料、放射性核素、發(fā)光部分、熒光部分或生物素等。任何報(bào)告部分或標(biāo)記都可以與本文公開的方法一起使用，只要其信號(hào)與清洗后保留在支持物上的抗體的量直接相關(guān)或成比例就行。然后使用適合于特定的可檢測的報(bào)告部分或標(biāo)記的方法，確定仍然結(jié)合在固相支持物上的第二抗體的量。對(duì)于放射活性基團(tuán)來說，閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影方法通常是適合的?？梢允褂酶鞣N偶聯(lián)技術(shù)來制備抗體-酶偶聯(lián)物(綜述參見，例如Scouten,W.H.，MethodsinEnzymology135:30-65,1987)。光譜方法可用于檢測染料(包括，例如，酶反應(yīng)的可比色產(chǎn)物)、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。生物素可以使用與不同的報(bào)告基團(tuán)(通常為放射活性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)的親和素或鏈親和素來檢測。酶報(bào)告基團(tuán)一般可以通過加入底物(一般進(jìn)行特定的時(shí)間段)，然后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分光鏡、分光光度法或其它分析來檢測。標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)添加物可用于使用眾所周知的技術(shù)確定樣品中抗原的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的方法考慮到了使用本文提供的HE4a抗原多肽，通過檢測來自生物來源或?qū)ο蟮纳飿悠分忻庖咛禺愋缘姆磻?yīng)性抗體來篩査惡性腫瘤病癥的存在。根據(jù)本實(shí)施方案，HE4a抗原多肽(或其包含本文提供的截短的HE4a抗原多肽的片段或變異體)被可檢測地標(biāo)記，并與生物樣品相接觸，以檢測樣品中以可溶形式天然存在的抗體與HE4a抗原多肽的結(jié)合。例如，可以使用本文公開的序列配合眾所周知的方法例如在體外翻譯過程中摻入易于檢測的(例如放射性標(biāo)記的)氨基酸、或者通過使用其它可檢測的報(bào)告部分例如在上面描述的那些，以生物合成來標(biāo)記HE4a抗原多肽。不希望受到理論的束縛，本文公開的方法的本實(shí)施方案考慮到了本文公開的某些HE4a多肽例如HE4a融合多肽，可以提供具有特定免疫原性的肽，因此產(chǎn)生了特異性的和可檢測的抗體。例如，根據(jù)該理論，某些HE4a融合多肽可以代表能夠喚起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)的"非自身"抗原，而缺少融合結(jié)構(gòu)域的HE4a多肽可能被免疫系統(tǒng)視為更類似"自身的"抗原，不容易引發(fā)體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。正如上面注意到的那樣，本文公開的方法部分涉及令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即可溶形式的HE4a抗原多肽在對(duì)象中天然存在，包括在患有某些癌癥的對(duì)象中這類可溶性HE4a多肽的水平升高了。23根據(jù)本文公開的方法，篩查惡性腫瘤病癥的存在的方法可以通過在來自對(duì)象的生物樣品中對(duì)一個(gè)以上腫瘤相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行檢測來進(jìn)一步加強(qiáng)。因此，本文公開的方法的某些實(shí)施方案提供了篩查的方法，該方法除了檢測天然存在的可溶性樣品成分與特異性針對(duì)HE4a抗原多肽的抗體的反應(yīng)性之外，還包括使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的和本文提供的已建立的方法檢測至少一種惡性腫瘤病癥的其它溶性標(biāo)記物。正如前面注意到的那樣，目前有許多可溶性腫瘤相關(guān)抗原可以在容易獲得的生物流體樣品中檢測到。例如，本文公開的方法的某些實(shí)施方案涉及人類間皮素多肽，其包括了例如新的可溶的間皮素相關(guān)抗原(MRA)多肽這樣的多肽，它們被描述在Scholler等(1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA96:11531)中以及還描述于美國專利No.6,770,445中。正如本文提供的那樣，"間皮素多肽"是可溶性的多肽，具有含有下面的肽的氨基酸序列1EVEKTACPSGKKAREIDESSEQIDNO:14并還具有至少一個(gè)與至少一種具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體具有反應(yīng)性的抗原性決定簇，該抗體競爭性地抑制MAbK-l(Chang等1996Proc.Nat.Acad.Sci.USA93:136;MAbK-1可以從例如SignetLaboratories,Inc.,Dedham,Mass.獲得)或在美國專利No.6,770,445中提供的單克隆抗體OV569、4H3、3G3或1A6的免疫特異性結(jié)合。因此，這些根據(jù)本文公開的方法使用的其它可溶性腫瘤相關(guān)抗原可以包括但不必限于間皮素和間皮素相關(guān)抗原、CEA、CA125、唾液酸化TN、SCC、TPS和PLAP(參見，例如Bast等，1983N.Eng.J.Med.309:883;Lloyd等，1997Int.J.Cane.71:842;Sarandakou等，1997ActaOncol.36:755;Sarandakou等，1998Eur.J.Gynaecol.Oncol.19:73;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2945;Kudoh等，1999Gynecol.Obstet.Invest.47:52;Ind等，1997Br.J.Obstet.Gynaecol.104:1024;Bell等，1998Br.J.Obstet.Gynaecol.105:1136;Cioffi等，1997Tumori83:594;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2949;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):3019)，并還可以包括任何已知的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物在生物樣品中的存在可以與本文提供的至少一種惡性腫瘤病癥的存在相關(guān)聯(lián)。或者，編碼HE4a多肽的核酸序列可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和/或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來檢測。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員可以根據(jù)本文提供的HE4acDNA序列來設(shè)計(jì)適合的探針和引物。分析一般來說可以使用從生物來源獲得的多種樣品中的任何一種來進(jìn)行，這些生物來源例如真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、從這些生物體制備的提取物以及在活生物體中發(fā)現(xiàn)的流體。實(shí)施例一般方法在實(shí)施例中使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，描述在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist的《基因融合實(shí)驗(yàn)》ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)以及Ausubel,F.M.等的《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)中?？s寫的意義如下"h"表示小時(shí)，"min"表示分鐘，"sec"表示秒，"d"表示天，"mL"表示毫升，"L"表示升，"U"表示單位，"pM"表示皮摩爾，"ROC"表示接受者操作特征，"AUC"表示曲線下的面積，"StDev"表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，"Min"表示最小值，"Max"表示最大值，"p"表示p-值?，F(xiàn)在將參考下面的實(shí)施例對(duì)本公開的主題進(jìn)行描述。提供這些實(shí)施例的目的僅僅是為了說明，而主題不限于這些實(shí)施例，而是應(yīng)該包括所有明顯是本文提供的指導(dǎo)的結(jié)果的變體。實(shí)施例1新的血清腫瘤標(biāo)記物HE4相對(duì)于CA-125在患有子宮內(nèi)膜癌的患者中的應(yīng)用在美國，每年診斷出大約40,880例子宮癌新病例，導(dǎo)致7，310人死亡。對(duì)子宮癌進(jìn)行的外科分期表明75。/。的患者患有I期疾病。在患有晚期疾病的患者中，75。/。的血清CA-125水平升高，而在患有早期疾病的患者中僅為17%。CA-125在檢測復(fù)發(fā)疾病中的用途充其量來說也是有限的。僅僅25。/?；加袩o癥狀復(fù)發(fā)疾病的患者的CA-125升高。指示早期復(fù)發(fā)疾病的更好標(biāo)記物是需要的。本研究的目的是考査新的血清腫瘤標(biāo)記物HE4的值，并將它與CA-125作為子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)記物進(jìn)行比較?，F(xiàn)在描述在本實(shí)施例中使用的方法。這是一項(xiàng)IRB批準(zhǔn)的前瞻性研究，比較了在因?yàn)榱夹约膊』蜃訉m癌而將要經(jīng)歷切除子宮和卵巢的外科手術(shù)的患者的HE4和CA-125。從所有的患者獲得了知情同意書。在手術(shù)前抽取血液樣品，在抽取后4小時(shí)內(nèi)收集血清并冷凍到-80。C。使用FujirebioDiagnosticsInc.的分析方法測定HE4和CA-125水平。然后將外科病理結(jié)果與腫瘤標(biāo)記物水平進(jìn)行比較。對(duì)于每種腫瘤標(biāo)記物建立ROC曲線?，F(xiàn)在描述本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在方案中總共征集了221位患者，128例良性和93例子宮內(nèi)膜癌。子宮內(nèi)膜癌患者具有下列的外科階段I期62例、1I期4例、III期19例、IV期8例。子宮內(nèi)膜癌患者的平均HE4是161pM(15到1052)，而良性疾病患者為49.3pM(14到254)。子宮內(nèi)膜癌患者的平均CA-125是52U/ml(3到1427)，良性疾病患者是46U/ml(3到773)。對(duì)于26每個(gè)類型計(jì)算了HE4和CA-125的ROC曲線的AUC，并進(jìn)行了比較(表1)。表1ROC曲線的AUCHE4a(AUC)CA-125(AUC)p-值良性對(duì)子宮內(nèi)膜癌79%54%<0駕良性對(duì)I期76%48%<0週良性對(duì)II期88%69%0.253良性對(duì)III期86%66%0.002良性對(duì)IV期86%66%0馬根據(jù)本文提供的信息，可以得出結(jié)論，在子宮內(nèi)膜癌的所有階段中HE4都升高了，并且與CA-125相比在檢測所有階段的子宮內(nèi)膜癌中都具有較高的靈敏度。HE4可以用在子宮內(nèi)膜癌患者中作為早期復(fù)發(fā)疾病的標(biāo)記物。實(shí)施例2現(xiàn)在描述在本實(shí)施例中使用的方法。從婦幼醫(yī)院/布朗大學(xué)(WomenandInfantsHospital/BrownUniversity)征集進(jìn)入IRB批準(zhǔn)的前瞻性方案的患者中以及從德克薩斯大學(xué)MDAnderson癌癥中心(TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter)的IRB批準(zhǔn)的血清庫中獲得血清樣品。在收集研究用的血液樣品之前，所有進(jìn)入方案的患者都簽署了知情同意書。所有的血液樣品在馬上進(jìn)行手術(shù)前收集并離心，在收集后4小時(shí)內(nèi)取出血清并冷凍到-80。C。隨后所有的患者經(jīng)歷了外科手術(shù)，手術(shù)由探測性剖腹術(shù)以及子宮切除術(shù)與雙側(cè)卵巢輸卵管切除術(shù)以及全外科分級(jí)包括清洗、以及骨盆和主動(dòng)脈周圍的淋巴結(jié)清除術(shù)組成。從婦幼醫(yī)院獲得的血清樣品在FujirebioDiagnosticsInc的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。從MDAnderson癌癥中心獲得的樣品就地分析。正常的對(duì)照樣品從健康患者獲得。使用FujirebioDiagnosticInc的分析方法測定了CA125、HE4、CA72.4和SMRP的腫瘤標(biāo)記物血清水平和尿SMRP水平。對(duì)于每種腫瘤標(biāo)記物建立了ROC曲線，在特異性設(shè)置為95%的情況下確定了敏感性?，F(xiàn)在描述本實(shí)施例的結(jié)果。從患有外科分期的子宮內(nèi)膜癌患者獲得了233份血清樣品，從健康對(duì)照者獲得了156份血清樣品。在患有外科分期的子宮內(nèi)膜癌患者的組中，有151例I期、21例II期、47例III期和14例IV期。對(duì)于健康對(duì)照者、外科I期患者和外科II到IV期患者計(jì)算了每個(gè)被分析的標(biāo)記物的平均血清腫瘤標(biāo)記物水平，顯示在(表2)中。對(duì)于每種標(biāo)記物確定了CA125、HE4、CA72.4、SMRP和尿SMRP水平的ROC曲線下面積(ROC-AUC)(表3)。使用對(duì)數(shù)回歸分析，在特異性設(shè)置為90%、95%和98%下，獨(dú)立地和在各種不同組合中對(duì)子宮內(nèi)膜癌樣品和對(duì)照的每種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行了比較(表4、5和6)。對(duì)于個(gè)體標(biāo)記物區(qū)分對(duì)照和子宮內(nèi)膜癌的靈敏度表明HE4表現(xiàn)得最好。當(dāng)特異性設(shè)置為95%時(shí)，對(duì)于所有階段的子宮內(nèi)膜癌來說HE4的靈敏度為44.9%，相比之下CA125為25.2%(p=0.0001)。對(duì)于I期病例來說，HE4與單獨(dú)的CA125相比，表現(xiàn)出靈敏度高出20.5%(37.1%對(duì)16.6%，p=0.0001)(表3)。對(duì)于患有II到IV期疾病的患者來說，當(dāng)特異性設(shè)置為95%時(shí)，HE4的靈敏度上升到59.8%，比CA125高18.3%(p=0,0001)。當(dāng)分析任何兩種標(biāo)記物的組合時(shí)，HE4和CA125或HE4和尿SMRP的組合對(duì)于所有階段的子宮內(nèi)膜癌來說將靈敏度分別提高到了48.7和49.6。在患有II到IV期疾病的患者中對(duì)HE4和CA125組合的分析表明，當(dāng)特異性設(shè)置為95%時(shí)，靈敏度為69.5%。這表示靈敏度與單獨(dú)使用CA125相比增加了24.4%(p=0.0001)。HE4、CA125和尿28SMRP的組合在所有的子宮內(nèi)膜癌患者中產(chǎn)生了最大的靈敏度增加，比單獨(dú)的CA125增加了26.1%。但是，這只比HE4禾BCA125的組合的靈敏度增加了2.6%，沒有顯著意義。也發(fā)現(xiàn)了在患有I期子宮內(nèi)膜癌的患者中HE4比CA125具有更高的靈敏度，靈敏度分別為37.1%對(duì)16.6G/。。HE4和CA-125的組合也將靈敏度增加到了39.1%，超過CA125。但是，HE4、CA125和尿SMRP的組合在患有I期疾病的患者中表現(xiàn)最好，靈敏度為44.7%，將靈敏度增加到超過單獨(dú)使用CA125的靈敏度28.1%(p=0.0001)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表4正常VS.所有子宮內(nèi)膜癌靈敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6正常VS.所有子宮內(nèi)膜癌(II-IV期)靈敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在本文中引用的每個(gè)專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。盡管已經(jīng)參考具體的實(shí)施方案公開了本發(fā)明的主題，但是顯然本
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的其它專業(yè)人員可以設(shè)計(jì)出其它的實(shí)施方案和修改，而不背離本文描述的主題的真實(shí)精神和范圍。隨附的權(quán)利要求包含了所有這樣的實(shí)施方案和等同修改。權(quán)利要求1.評(píng)估患者是否患子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的方法，該方法包括在從患者獲得的樣本中評(píng)估HE4的表達(dá)，其中HE4的表達(dá)升高表明患者患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品為實(shí)體組織樣品。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品是從患者獲得的體液。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述體液選自血液、血清、腹膜液和陰道液。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品是與患者接觸過的流體。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述流體選自腹膜沖洗液和陰道灌洗液。7.權(quán)利要求1的方法，其中樣品中HE4的表達(dá)與參比值進(jìn)行比較。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述參比值對(duì)應(yīng)于未患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者中HE4的表達(dá)。9.權(quán)利要求1的方法，其中樣品中HE4的表達(dá)與在早期從該患者獲得的早期樣品中HE4的表達(dá)進(jìn)行比較。10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣本中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。11.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中CA125和SMRP的表達(dá)，其中CA125和SMRP任一種的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。12.評(píng)估患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者對(duì)治療的反應(yīng)的方法，該方法包括評(píng)估在治療中不同時(shí)間從患者獲得的樣本中HE4的表達(dá)，其中在較晚時(shí)間HE4的表達(dá)降低表明患者對(duì)治療有反應(yīng)。13.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)降低進(jìn)一步表明患者對(duì)治療有反應(yīng)。14.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中CA125和SMRP的表達(dá)，其中CA125和SMRP任一種的表達(dá)降低進(jìn)一步表明患者對(duì)治療有反應(yīng)。15.對(duì)已經(jīng)進(jìn)行了子宮內(nèi)膜癌或子宮癌治療的患者的復(fù)發(fā)進(jìn)行評(píng)估的方法，該方法包括在從治療后的患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，其中HE4的表達(dá)升高表明患者的子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)。16.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者的子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)。17.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中CA125和SMRP的表達(dá)，其中CA125和SMRP任一種的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者的子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)。18.權(quán)利要求15的方法，其中在治療后多次評(píng)估HE4的表達(dá)，并且其中逐漸升高的HE4表達(dá)表明患者的子宮內(nèi)膜癌或子宮癌復(fù)發(fā)。19.對(duì)患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的可能性進(jìn)行評(píng)估的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，其中HE4的表達(dá)升高與患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的可能性增加相關(guān)。20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。21.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中CA125禾QSMRP的表達(dá)，其中CA125和SMRP任一種的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者將發(fā)展子宮內(nèi)膜癌或子宮癌。22.在患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者中對(duì)腫瘤進(jìn)行分期方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，其中逐漸升高的HE4表達(dá)表明更晚期的癌癥。23.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明更晚期的癌癥。24.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中CA125和SMRP的表達(dá)，其中CA125和SMRP任一種的表達(dá)升高進(jìn)一步表明更晚期的癌癥o25.在患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者中對(duì)腫瘤進(jìn)行分級(jí)方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，其中逐漸升高的HE4表達(dá)表明更高等級(jí)的癌癥。26.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明更高等級(jí)的癌癥。27.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中CA125和SMRP的表達(dá)，其中CA125和SMRP任一種的表達(dá)升高進(jìn)一步表明更高等級(jí)的癌癥。28.評(píng)估被診斷患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者對(duì)治療性干預(yù)的需要的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評(píng)估HE4的表達(dá)，其中HE4的表達(dá)升高表明患者需要治療性干預(yù)。29.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估樣品中選自CA125和SMRP的第二個(gè)標(biāo)記鉤的表達(dá)，其中第二個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)升高進(jìn)一步表明患者需要治療性干預(yù)。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述治療性干預(yù)為化療。全文摘要本發(fā)明涉及HE4/HE4a標(biāo)記物在評(píng)估患者的子宮內(nèi)膜癌和子宮癌中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及將腫瘤標(biāo)記物用于子宮內(nèi)膜癌和子宮癌的診斷、分級(jí)和分期。本發(fā)明還涉及了對(duì)被診斷患有子宮內(nèi)膜癌或子宮癌的患者的預(yù)后和治療有效性的確定。文檔編號(hào)C12Q1/25GK101473041SQ200780007052公開日2009年7月1日申請日期2007年1月4日優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日發(fā)明者伊麗莎白·薩默斯,杰弗里·W·阿拉德,理查德·摩爾申請人:富士瑞必歐美國公司