專利名稱：：改進的頭孢菌素生產的制作方法改進的頭孢菌素生產本發(fā)明涉及在微生物中對頭孢菌素的發(fā)酵生產。有絲真菌尸em'd仏'wmc/zowgemw2是/5-內酰胺抗生素(例如青霉素G)的天然生產者。過去數(shù)十年中，青霉素G的生產能力被經典菌株改進方法大大提高，產生了強大的工業(yè)生產菌株。近來，通過代謝途徑工程改造，將用于頭孢菌素生產的若干途徑成功整合進了青霉素生產菌株，特別是尸em'cz'〃/wmcAo^ogewwm。在EP-A-0532341中，已用編碼擴展酶的iSV,ep/cw7C^yc/avw//gerwjc^/E"基因)(寸尸e"zW〃/wwc力A3Ay0ge"ww進《亍了轉"f七，這使得在存在前體己二酸的情況下培養(yǎng)經轉化的菌株時，所述菌株能生產己二酰-7-ADCA(己二酰-7-氨基-3-甲基-3-頭孢(cephem)-4-羧酸)。在EP-A-0540210中，除了&re/tom>;c&yc^vw/z'gen^ce/E基因之外，還用羥化酶基因對尸em'd仏wmc/jo^oge肌m進行了轉化，該基因的表達產物將己二酰-7-ADCA的3-甲基側鏈轉化為3-羥甲基，產生己二酰-7-氨基去乙酰頭孢烷酸(己二酰-7-ADAC);在EP-A-0540210的另一實施例中，用乙酰轉移酶基因對已經過編碼擴展酶和羥化酶的基因轉化的尸em'a7/^mc/zo^ge做m再進一步轉化，該乙酰轉移酶基因的表達產物將3-羥甲基側鏈轉化為3-乙酰氧甲基側鏈，產生己二酰-7-ACA。在WO2004/106347中，用編碼擴展酶、羥化酶和O-氨基甲酰轉移酶的基因對Pem'"7//MmcAo^oge"薩進行了轉化，產生己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-頭孢烷酸。選用尸em'cz'〃/wmc/o^^e"Mm的工業(yè)菌株是因為它們能生產和向培養(yǎng)基中分泌大量的多種/3-內酰胺化合物，特別是青霉素G和青霉素V。很多證據(jù)表明，0-內酰胺分泌是主動的過程，其可能通過轉運蛋白進行。在此類發(fā)酵工藝的靠后階段，在工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)了極高的^-內酰胺效價。WO01/32904公開了涉及青霉素G分泌的若干種ABC轉運蛋白多肽。增強ABC轉運蛋白活性導致/3-內酰胺化合物的分泌增強。前文所討論的在天然非頭孢菌素重組生產宿主(例如尸^&7//"附菌株)中對頭孢菌素分子進行的生產仍有若干問題。例如，想要的化合物的分泌水平仍相對較低，其應當被提高，以在技術和經濟上都更有吸引力。由于青霉素轉運蛋白，即ABC轉運蛋白多肽對于頭孢菌素化合物具有低的親和性，因此在尸.cAo^oge"wm中生產的頭孢菌素的生產率(productionrate)受到限制。在WO01/32904中建議，這可能通過使用編碼WO01/32904中公開的ABC轉運蛋白的多核苷酸，從天然頭孢菌素生產者(例如^crewom'wmcA^soge做m)中克隆一種或多禾中同源ABC轉運蛋白多肽來克服。有絲真菌爿cre附om'w附c/z3^oge"w附是頭孢菌素(例如頭包菌素C)的天然生產者。近來已在該真菌的特定菌株爿c"mom'wmc/z^50ge"w肌C10中鑒定出了CefT基因，該基因編碼可能的流出泵(effluxpump)蛋白，同時還顯著增加頭孢菌素C生產(Ulldnetal.(2002)Mol.Genet.Genomics,267,673-683;LirasandMartin(2006)InternationalMicrobiology2,9-19)。CefT基因的核苷酸序列已被保藏于NationalCenterforBiotechnologyInformation的核苷酸數(shù)據(jù)庫，編號(位置)為AJ487683。NCBS可通過互聯(lián)網進入(www.ncbi.nlm.nih.gov)，CefT基因核苷酸序列可從http:〃www.ncbi.nkn.nih.gov/entrez/viewer,fcgidb=nucleotide&val=21214008獲得。從CefT編碼的蛋白的氨基酸序列推斷出這是跨膜蛋白，因為其具有12個跨膜片斷(TMS)，并且含有具有主要易化子(facilitator)超家族的Drug:H反向轉運蛋白12TMS組特性的基元A、B、C、D2和G。CefT蛋白賦予對一些毒性有機酸(包括異戊酸和苯乙酸)的抗性，這可從下述事實推斷出這些酸對其中CefT被失活的Jcwmom'wm菌株有毒性。同源CefT基因的過量表達導致在Jcrewom'wmc/zo^oge"ww中頭孢菌素C的生產提高。而當使用CefT基因的截短形式時卻并非如此。但是，對CefT基因的靶向失活不會影響到Jcremom'wwc/o^ogemw2中的頭包菌素C生產，這暗示，有冗余的系統(tǒng)參與v4cremom'wnc/zo^oge"wn中的頭孢菌素輸出。來自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>的CefT蛋白不屬于ABC轉運蛋白家族。對來自Jcremom'wwC10的CefT蛋白氨基酸序列(UMnetal(2002))與WO01/32904中公開的ABC轉運蛋白的氨基酸序列中的任何序列進行的比較揭示，CefT蛋白與ABC轉運蛋白不具有任何同源性(即，<25%)。術語"CefT基因"涉及編碼CefT蛋白(即，參與將頭孢菌素化合物從頭孢菌素生產微生物中轉運到頭孢菌素生產微生物外的蛋白)的基因。來自菌株Jc^mom'wmdzowge"wmCIO的此類CefT基因的一個例子可在UMnetal(2002)中找到，其中還公開了CefT基因編碼的CefT蛋白的氨基酸序列。術語"異源CefT基因"表示CefT基因可從任何合適的宿主微生物獲得，并且被用于轉化頭孢菌素生產微生物，前提是從中獲得CefT基因的合適的宿主微生物與用所述CefT基因轉化的頭孢菌素生產微生物并非同一物種。術語"同源CefT基因"表示CefT基因從任何合適的宿主微生物獲得，并被用于轉化頭孢菌素生產微生物，前提是從中獲得CefT基因的合適的宿主微生物與用所述CefT基因轉化的頭孢菌素生產微生物是同一物種。用來自同樣的菌株Jco^om'wmc/zo^oge做mCIO的同源CefT基因對菌株爿cowom'wmc/2^y0gem^mCIO進行的轉化已被Ulldnetal.(2002)描述過。"同源性"指第一基因、蛋白或酶與第二基因、蛋白或酶序列的同一性。在本說明書中，同源性的程度被表示為與參照基因、蛋白或酶的同一性百分比。對這些同源性的測定可通過技術人員已知的方法來進行，例如，使用參照蛋白的蛋白序列作為"查詢序列"，以針對公眾數(shù)據(jù)庫進行檢索，以鑒定出其它家族成員或相關序列。此類檢索可使用BLAST程序(版本2.2)，使用各程序的缺省參數(shù)來進行。見，例如http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在第一個方面，本發(fā)明提供了頭孢菌素生產微生物，其特征在于，其已經經過了異源Ce/T基因的轉化，并且，由此，經轉化的微生物較之未經異源CefT基因轉化的微生物而言具有提高的頭孢菌素生產能力。提高的頭孢菌素生產能力在本文中被定義為經轉化的微生物的頭孢菌素生產能力與未用異源CefT基因轉化的微生物的頭孢菌素生產能力之比為至少1.2，更優(yōu)選地，至少1.4，更優(yōu)選地，至少1.6，更優(yōu)選地，至少1.8，更優(yōu)選地，至少2.0，更優(yōu)選地，至少2.1，更優(yōu)選地，至少2.3，更優(yōu)選地，至少2.5，更優(yōu)選地，至少3.0，更優(yōu)選地，至少5.0，更優(yōu)選地，至少10。頭孢菌素生產微生物優(yōu)選是天然能生產i8-內酰胺化合物(例如青霉素和頭孢菌素)的微生物，其可選自尸em'cz7/z'wm、A;ergz'〃^、^^ptomycw和^cremo"/wm構成的組。在該組中，若干種微生物天然具有生產頭孢菌素的能力，例如5Vw;tom;;c"和Jcrewem'wm，或者天然具有生產青霉素的能力，例如尸em'c遊wm和J5;^g/〃w。其它微生物，例如前文公開的尸em'd/^m，可通過遺傳工程獲得生產頭孢菌素的能力，例如，對尸6"^7//"^cAo^oge""w進行遺傳改造，在用編碼擴展酶的基因對其進行轉化之后，其能生產7-ADCA的N-乙?；苌?，或者進一步用羥化酶、用羥化酶和乙酰轉移酶、或用羥化酶和乙酰轉移酶和O-氨基甲酰轉移酶對其進行轉化后，其能分別生產7-ADAC、7-ACA和7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙?；苌?。優(yōu)選地，異源Ce/T基因可源自任何合適的頭孢菌素生產微生物，但是其1尤選源自Jcrewowz'wm，更優(yōu)選源自爿cre附om'wwc/z/3^oge"twz，最優(yōu)選源自Ull紐etal(2002)公開的爿cremo"z'wmc/o^oge"wwC10。就本發(fā)明的目的而言，還可以使用合適的異源Ce/T基因的同源物，例如，如下的CefT基因，其編碼與Ull&netal(2002)公開的來自爿c"wom'wwc/zo^oge"M/wC10的CefT蛋白相比基于蛋白基礎具有超過30%同源性，優(yōu)選超過40%同源性，優(yōu)選超過50%同源性，優(yōu)選超過60%同源性，優(yōu)選超過70%同源性，優(yōu)選超過80%同源性，優(yōu)選超過90%同源性的CefT蛋白。本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式是Pem'd//^m菌株，優(yōu)選地，Pem'cz7/,MmWo^oge"wm，其已通過遺傳工程改造獲得了生產N-取代的7-ADCA衍生物的能力，這是用編碼擴展酶的基因(例如EP-A-0532341中公開的)對其進行轉化的結果，并且，除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地，來自白勺CefT基因，更"[尤選i也，來自爿cre附om'wwc/z^ysogewwm白勺CefT基因，最優(yōu)選的是來自A^mwz/wmc/zo^oge肌mC10的Ce汀基因，其編碼具有U114netal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉化。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方式是尸em'a'〃/wm菌株，優(yōu)選地，尸6"/"7//"附cAowge"wm，其已通過遺傳工程改造獲得了生產N-乙酰化的7-ADAC衍生物的能力，這是用編碼擴展酶和羥化酶的基因(EP-A-0540210中公開的)對其進行轉化的結果，并且，除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地，來自Jcr綴om'wm的CefT基因，更優(yōu)選地，來自爿c廠emom'wmc/zo^oge"wm的CefT基因，最j尤選的是來自」crewom'w/wc/o^oge"wmC10的CefT基因，其編碼具有UMnetal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉化。本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方式是尸e"/c"/Z簡菌株，優(yōu)選地，Pem.c朋謹c/z，oge"畫，其已通過遺傳工程改造獲得了生產N-乙酰化的7-ACA衍生物的能力，這是用編碼擴展酶和羥化酶和乙酰轉移酶的基因(EP-A-0540210中公開的)對其進行轉化的結果，并且，除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地，來自Aremow'wm的Ce汀基因，更優(yōu)選地，來自Jc"mo"z'wmc/o^oge肌m的CefT基因，最優(yōu)選的是來自Jcremom'wmc/o^oge肌mC10的CefT基因，其編碼具有UMnetal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉化。本發(fā)明的另一優(yōu)選白勺實方但方式是尸em.c/〃&m菌牛朱,^f尤選i也，尸ewz'cz'〃z'wmc/z^3^oge"wm，其已通過遺傳工程改造獲得了生產N-乙?；?-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸衍生物的能力，這是用編碼擴展酶、羥化酶和O-氨基甲酰轉移酶的基因(WO2004/106347中公開的)對其進行轉化的結果，并且，除此之外還用異源CefT基因(優(yōu)選地，來自^remow^m的CefT基因，更優(yōu)選地，來自Jc"mom'wmcA^soge""w的CefT基因，最優(yōu)選的是來自爿crewom'wmc/z/">wogewwmC10白勺CefT基因，其纟扁石馬具有Ull&netal(2002)公開的氨基酸序列的CefT蛋白)對其進行了轉化。在第二個方面，本發(fā)明提供了用于構建根據(jù)本發(fā)明的頭孢菌素生產微生物的方法，所述方法包括下述步驟:從合適的宿主微生物分離異源Ce/T基因，用分離的CefT基因轉化頭孢菌素生產微生物，前提是所述宿主微生物與頭孢菌素生產微生物并非同一物種。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了用分離的CefT基因構建根據(jù)本發(fā)明的頭孢菌素生產微生物的方^去，所述方^去包f舌下述步l聚從JcT6wom'wm，優(yōu)選從爿crewow'wmsogew訓，最優(yōu)選從UMnetal(2002灘述的爿cre腳m'臓sogew謂C10分離異源Ce/T基因，對經過編碼擴展酶的基因以及任選地編碼羥化酶、乙酰轉移酶和O-氨基甲酰轉移酶的基因中的一種或多種轉化過的頭孢菌素生產微生物(優(yōu)選地Pem'a7/z'ww，更優(yōu)選地，Pem'cz7/山mc/o^oge"wm)進行轉化，由此提供具有生產前文所述的7-ADCA、7-ADAC、7-ACA和N-乙?；?-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的能力的尸em'c/〃z'wm菌株。在第三個方面，本發(fā)明提供了生產頭孢菌素的工藝，所述工藝包括根據(jù)本領域已知的方法來培養(yǎng)本發(fā)明的相應的頭孢菌素生產微生物。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式是生產7-ADCA、7-ACA、7-ADCA禾H7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙酰化衍生物的工藝。本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式是使用EP-A-0532341、EP-A-0540210和WO2004/106347公開的發(fā)酵工藝來生產7-ADCA、7-ACA、7-ADCA或7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的己二酰衍生物的工藝。實施例一般材料和方法按照Sambrook,J."a/.(1989)，Molecularcloning:alaboratorymanual,2ndEd"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork所述按照標準流程來進行。使用校正聚合酶Turbo-Pfu-Polymerase或Herculase(Stratagene，荷蘭)按照廠商方案來擴增DNA，同時使用Taq聚合酶來驗證構建的菌株和質粒。限制性酶來自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。對于常規(guī)克隆而言，使用五sc/zen'c/n'aco/!'菌株ToplO和DH10B(Invitrogen)。對構建的質粒的驗證通過限制性分析和隨后的測序(SeqlabGmbH,Goettingen，德國)來進行。有絲真菌Pem'cz.〃/wmc力o^oge"wmWisconsin54-1255(ATCC28089)被用作為遺傳修飾和生產菌株構建的宿主。實施例1構建Ce/T表達盒用于在尸em'cz7/^wc/;r^oge肌w中的轉化^c/^n'c/^cc^DH5a被用作為宿主菌株，用于高頻率轉化、質粒DNA擴增(Sambrook,1989)和質粒構建，其中使用Invitrogen的MultisiteGatewayThree-FragmentVectorConstructionKit禾口不同的載體。載體pDONRTMP4-P1R被用于克隆pcbC基因上游920bp的啟動子區(qū)域。使用引物attB4-F-IPNS通過聚合酶鏈式反應(PCR)添加attB4F位點，使用引物attBl-R-IPNS添加attBlR位點。使用BP克隆酶，將擴增出的PCR產物克隆進pDONRP4-P1R，產生pDONRP4-P1R-IPNS啟動子。用載體pDONR201門(gateway)載體來克隆爿cr簡麵'簡s，"畫的CVT基因(acCefT)。使用引物attBlF-AcCefT通過PCR添加attBlF位點，使用attB2R-AcCefT-minus-Stop添力口attB2R位點。使用BP克隆酶，將擴增出的AcCEfT基因克隆進pDONR201，產生pDONR201-AcCefT。除去AcCefT的終止密碼子，從而在基因的羧基末端位點與His標簽或GFP標簽融合。為向penDE基因下游551bp的終止子區(qū)域添加attB2F位點以便用于在pDONRP2R-P3中克隆，使用attB2F-His8x-Tat引物。終止子區(qū)域與引物attB3R-Tat—起被克隆，添加具有終止密碼子的HIS標簽，產生載體pDONRP2-P3R-HIS-Tat。為獲得與GFP的羧基末端融合，使用引物attB2R-GFP禾nattB3R-Tat來產生載體pDONRP2-P3R-GFP-Tat。在MultisiteGatewayThree-FragmentVectorConstructionKit的LR反應中，將這些pDONRTM載體組合于pDESTTMR4-R3中，制造出分別具有PcbC啟動子、AcCefT基因、His或GFP標簽和PenDE基因終止子的目標載體。表l:用于0^,&7@克隆的引物。粗體顯示的核苷酸代表Gateway⑤系統(tǒng)的att重組位點，斜體代表保持了HIS標簽、GFP標簽和AcCefT基因之間的框的核苷酸，下劃線的核苷酸代表HIS標簽的8個氨基酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2用實施例1中設計的Cg/T表達盒轉化尸em'cz'〃/wmc/zn^oge做mATCC28089Ce伍/Cg/F/CmcH(構建被描述于WO2004106347中)為進行對尸em'c/肌wmc/io^oge肌mATCC28089Ce/E/C^/F/Cmc//的轉化實驗，使用生產大約0.3g/L己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的菌株。制造并分離原生質體，通過具有pcbC啟動子、Ce/T基因和penDE終止子的pDESTTMP4-R3載體的共轉化來進行轉化(Alvarez,1987)，在用乙酰胺作為唯一氮源的平板上用AMDS基因作為選擇標記。使用Trizol(Iiwitrogen)來分離轉化子的總RNA，使用AcCefT特異性引物(AcCefTFl;5，-TCGATTCGTACCAGCACCAGGC-3，)禾口attB2-HIS標簽引物(5，-TGGTGATGGTGATGGTGGACCACTT-3，)，用RT-PCR珠(Amersham)來測定陽性轉化子，獲得384bp的PCR片段。實施例3培養(yǎng)尸em'd〃/MmcArvwgg做mATCC28089Ce伍/Cg/F/Cmc//Cg/T并測量己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的分泌將5個CefT轉化子的菌絲體接種進50mL搖瓶中的礦物質培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有(g/L):葡萄糖(5);乳糖(80);尿素(4.5);(NH4)2S04(1.1);Na2SO"2.9);KH2P04(5.2);K2HP04(4.8)和10mL/L微量元素溶液A，其中含有檸檬酸(150);FeS04.7H20(15);MgS04.7H20(150);H3B03(0.0075);CuS04.5H20(0.24);CoS04.7H20(0.375);ZnS04.7H20(5);MnS04.H20(2.28);CaCl2.2H20(0.99);3g/L己二酸;在滅菌前的pH為6.5。在25。C，280rpm下生長7天后，沉淀出細胞，使用NMR分析上清液來測量頭孢菌素的形成。結果見表2。數(shù)據(jù)清楚顯示了CefT基因在尸.dz^wge"wm基因組中整合對于頭孢菌素生產的積極影響。表2:Pem'cz7/z.wmcAo^oge肌mATCC28089(^/27(^/F/Cwc//的CefT基因轉化子的搖瓶培養(yǎng)物中己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1.一種頭孢菌素生產微生物，其特征在于，其經過異源CefT基因的轉化，并且，由此，用所述異源CefT基因轉化過的所述微生物的頭孢菌素生產能力與未用所述異源CefT基因轉化過的微生物的頭孢菌素生產能力的比例為至少1.2。2.根據(jù)權利要求1的頭孢菌素生產微生物，其特征在于，所述異源C"e/T基因源自^cre附o"z'wm，"f尤選i也,源自v4cremowfw附c/1/7soge"wm，最優(yōu)選地，源自Jc"mom'wmc/o^ogem/mCIO，或是所述CeyT基因的同源物，所述同源物編碼與來自爿cremom'wnc/o^ge肌mC10的CefT蛋白相比基于蛋白基礎具有超過30%同源性的Ce汀蛋白。3.根據(jù)權利要求1或2的頭孢菌素生產微生物，其中，所述微生物天然能生產頭孢菌素，或者通過遺傳工程改造獲得了生產所述頭孢菌素的能力。4.根據(jù)權利要求3的頭孢菌素生產微生物，其中，所述微生物可選自尸em'a7/z.wm、^y/erg7'〃ws、5V;-eptom;/c&s"禾口JcremomYwz豐勾成的纟且。5.根據(jù)權利要求4的頭孢菌素生產微生物，其中，尸訓'"7//"附菌株，優(yōu)選地，Pem'c""wmc/o^ge做m，在用編碼擴展酶的基因轉化以及任選地編碼羥化酶、羥化酶和乙酰轉移酶或者羥化酶和乙酰轉移酶和O-氨基甲酰轉移酶的基因進一步轉化后獲得了生產頭孢菌素的能力，所述Penicillimn分別能生產7-ADCA、7-ADAC、7-ACA和7-氨基-3-氨基甲酰-氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙?；苌?。6.用于構建根據(jù)權利要求1-5中任意一項所述的微生物的方法，所述方法包括下述步驟a.從合適的宿主分離CeZr基因；以及b.用步驟a中分離的所述CefT基因轉化所述頭孢菌素生產微生物，前提是所述宿主和所述頭孢菌素生產微生物并非同一生物。7.—種生產頭孢菌素的工藝，所述工藝包括培養(yǎng)根據(jù)權利要求1-5中任意一項所述的頭孢菌素生產微生物。8.根據(jù)權利要求7的工藝，其中，所述頭孢菌素選自7-ADCA、7-ACA、7-ACCA和7-氨基-3-氨基甲酰-氧甲基-3-頭孢-4-羧酸的N-乙?；苌飿嫵傻慕M。全文摘要本發(fā)明涉及頭孢菌素生產微生物，其特征在于，其經過異源CefT基因的轉化，并且，由此，用異源CefT基因轉化過的微生物的頭孢菌素生產能力與未用異源CefT基因轉化過的微生物的頭孢菌素生產能力的比例為至少1.2。此外，本發(fā)明提供了生產頭孢菌素生產微生物的方法以及使用頭孢菌素生產微生物來發(fā)酵生產頭孢菌素的工藝。文檔編號C12R1/645GK101389635SQ200780006569公開日2009年3月18日申請日期2007年2月23日優(yōu)先權日2006年2月23日發(fā)明者耶羅恩·赫爾本·尼蘭德,阿諾德·雅各布·馬蒂歐·德里森,馬爾科·亞歷山大·范德勃戈,馬庫斯·漢斯,魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司