專利名稱：生產(chǎn)頭孢菌素c的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其編碼一種來自產(chǎn)黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)的新蛋白質(zhì)，涉及包含此核酸分子的載體，涉及已用此載體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞，還涉及使用此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)頭孢菌素C的方法。
背景技術(shù)：
頭孢菌素C為通過絲狀真菌產(chǎn)黃支頂孢(以下稱為A.chrysogenum)工業(yè)規(guī)模發(fā)酵得到的天然代謝物。該物質(zhì)是多種半合成的頭孢菌素抗生素的重要前體。頭孢菌素類物質(zhì)具有治療學(xué)上的重要性。工業(yè)頭孢菌素發(fā)酵產(chǎn)量的增加除了工藝技術(shù)的改進(jìn)外主要依賴于持續(xù)的遺傳菌株的改進(jìn)。現(xiàn)代方法中所述的菌株改進(jìn)越來越前沿的是用具有增加產(chǎn)量潛力的特定基因轉(zhuǎn)化生產(chǎn)菌株。通過對頭孢菌素生物合成生化關(guān)系的了解，一小部分已知的頭孢菌素生物合成基因被懷疑具有菌株改進(jìn)的潛力。擴(kuò)增，即，增加此類已知基因的拷貝數(shù)量，確實(shí)表現(xiàn)出在實(shí)驗(yàn)上部分地顯著提高生產(chǎn)生物的生產(chǎn)力。然而，可通過科學(xué)可信度評估預(yù)測出具有菌株改進(jìn)潛力的此類已知基因非常少。然而除了這些已知的生物合成基因之外，猜想還有未知數(shù)量的其他基因同樣能夠通過擴(kuò)增的方式造成增加產(chǎn)量的潛力。通常此類基因的功能是未知的，因?yàn)槟壳皩τ绊戭^孢菌素生物合成的全部細(xì)胞過程了解很少。因此鑒別其他具有增加產(chǎn)量潛力的基因的策略非常重要。
這樣本發(fā)明的一個(gè)中心目的就是發(fā)現(xiàn)這些其他迄今未知的基因。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供編碼來自產(chǎn)黃支頂孢的新蛋白的核酸和載體，該核酸和載體能用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞以便此宿主細(xì)胞能以好的產(chǎn)量提供頭孢菌素C。本發(fā)明的另一目的是提供這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。最后，本發(fā)明的另一目的是提供使用所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生產(chǎn)頭孢菌素C的方法。


圖1展示了一種新的產(chǎn)黃支頂孢蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO 1＝序列標(biāo)識(shí)號(hào)1)，其由本發(fā)明的核酸分子(根據(jù)圖2或4的核酸序列)推出。序列按N端到C端的方向展示。
圖2(SEQ ID NO 2)展示了基因組DNA序列，包括本發(fā)明框架內(nèi)發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)黃支頂孢基因的基因組克隆編碼區(qū)中的3個(gè)內(nèi)含子，其從翻譯起始密碼子(ATG)到最后的編碼密碼子(TGG)。下劃線部分為內(nèi)含子。序列按5’到3’的方向以單鏈形式描述。
圖3(SEQ ID NO 3)從翻譯起始密碼子(ATG)到最后的編碼密碼子(TTG)展示了新基因編碼區(qū)的cDNA序列；序列按5’到3’的方向以單鏈形式描述。
圖4(SEQ ID NO 4)展示了新基因的基因組克隆BamHI/EcoRI片段的基因組DNA序列(序列按5’到3’的方向以單鏈形式描述)。下劃線且粗體部分描述的是編碼區(qū)的翻譯起始密碼子(ATG)和翻譯終止密碼子(TAA)。下劃線部分描述的是內(nèi)含子。
圖5(SEQ ID NO 5)展示了通過SnaB1和Bfr1切割位點(diǎn)標(biāo)記的大約16kb區(qū)域的產(chǎn)黃支頂孢基因組DNA序列，其包含生物合成基因pcbC(1366位到350位，反向排列)和pcbAB(2598位到13517位)。序列按5’到3’的方向以單鏈形式描述。下劃線且粗體部分描述的是相應(yīng)編碼區(qū)的特定翻譯起始密碼子和特定翻譯終止密碼子。下劃線部分描述的是所述的切割位點(diǎn)。
圖6(SEQ ID NO 6)展示了通過EcoRV和BamHI切割位點(diǎn)標(biāo)記的約5.8kb區(qū)域的產(chǎn)黃支頂孢基因組DNA序列，其包含生物合成基因cefD1(2372位到180位，反向排列)和cefD2(3888位到5133位)。序列按5’到3’的方向以單鏈形式描述。下劃線且粗體部分描述的是相應(yīng)編碼區(qū)的特定翻譯起始密碼子和特定翻譯終止密碼子。下劃線部分描述的是cefD2中的內(nèi)含子和所述的切割位點(diǎn)。
圖7(SEQ ID NO 7)展示了通過XbaI和SgrAI切割位點(diǎn)標(biāo)記的約4.6kb區(qū)域的產(chǎn)黃支頂孢基因組DNA序列，其包含生物合成基因cefEF(1118位到122位，反向排列)和cefG(2058位到3534位)。序列按5’到3’的方向以單鏈形式描述。下劃線且粗體部分描述的是相應(yīng)編碼區(qū)的特定翻譯起始密碼子和特定翻譯終止密碼子。下劃線部分描述的是cefG中的兩個(gè)內(nèi)含子和所述的切割位點(diǎn)。
發(fā)明詳述本發(fā)明在產(chǎn)黃支頂孢中發(fā)現(xiàn)一新基因，其編碼產(chǎn)黃支頂孢中目前未知的蛋白質(zhì)。此新基因在天然狀態(tài)下與已知的產(chǎn)黃支頂孢cefEF基因(S.E.Samson等.，Biotechnology 5(1987)，1207-1214)在產(chǎn)黃支頂孢基因組中的同一染色體上，并位于cefEF基因下游(按翻譯方向閱讀)約5.5kb(千堿基(kilo bases))處。
此新基因發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)黃支頂孢ATCC48272菌株中(該菌株用此號(hào)碼可從ATCC美國典型培養(yǎng)物收藏中心，PO Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)獲得)。
已經(jīng)詳細(xì)的闡明了此菌株的特征，例如作為頭孢菌素的生產(chǎn)者，尤其是頭孢菌素C的生產(chǎn)者(L.H.Malmberg和W.S.Hu，Appl.Microbiol.Biotechnol.38(1992)，122-128；Y.Q.Shen等，Bio-Technology 4(1986)，61-64)；異青霉素N合成酶的生產(chǎn)者(I.J.Hollander等，Science 224(1984)，610-612；J.M.Luengo等Bio-Technology 4(1986)，44-47)；去乙酰氧基頭孢菌素C合成酶的生產(chǎn)者(Y.Q.Shen等，Enzyme Microb.Technol.6(1984)，402-404)；和ACV合成酶的生產(chǎn)者(J.Zhang等Curr.Microbiol.18(1989)，361-367；J.Zhang和A.L.Demain，Arch.Microbiol.158(1992)，364-369)。
然而此新基因也能在其他產(chǎn)黃支頂孢菌株中發(fā)現(xiàn)并從中分離。作為一種選擇，在此給出的核酸和氨基酸序列或分子可以合成，尤其是化學(xué)合成。
此基因編碼長度為526個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(見圖1，SEQ ID NO 1)。圖1中描述了其氨基酸序列。如圖2和圖4中所展示，基因的編碼區(qū)被3個(gè)內(nèi)含子打斷。
這樣本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(見圖1)。
這樣此類型的核酸分子可以編碼，例如，除了所列氨基酸序列(SEQ IDNO 1)之外還包含其他氨基酸的蛋白質(zhì)，例如，融合蛋白。例如，如果需要以分離形式制備新蛋白，此類融合蛋白可能有一定的作用。例如，融合的部分可以提高穩(wěn)定性或?yàn)榧兓^程提供便利。
在本發(fā)明的框架之內(nèi)，優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子只編碼或?qū)Ｒ痪幋aSEQID NO 1的氨基酸序列。此類型的核酸分子可有利地用于生產(chǎn)頭孢菌素C的目的，這在以下有描述。這樣本發(fā)明還涉及這樣的本發(fā)明核酸分子，其編碼由根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選地是DNA分子，尤其是分離的基因組DNA分子或相應(yīng)的cDNA分子。cDNA分子可以例如，通過反轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA分子或通過合成制備。作為一種選擇，核酸分子可以為RNA分子，尤其是mRNA分子。
本發(fā)明的DNA分子可以例如，通過建立所述產(chǎn)黃支頂孢ATCC48272菌株基因組的基因組DNA文庫來制備。鑒定這樣的基因組克隆，其含有已知的產(chǎn)黃支頂孢cefEF基因并還含有cefEF基因下游至少約10kb的序列。這可以通過用同源探針篩選進(jìn)行，探針的結(jié)構(gòu)可從已知的cefEF基因核酸序列推出(S.E.Samson等，見上)。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)可以從文獻(xiàn)獲知(例如T.Maniatis等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，1982，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)。需要的DNA分子位于這類克隆的大約2.5kb的EcoRl/BamHI片段上，此片段可用經(jīng)典的技術(shù)分離或制備。圖4描述了這樣的片段。這樣本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及本發(fā)明的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 4的堿基序列或僅由于遺傳密碼的簡并性與SEQ ID NO 4序列不同的堿基序列。也就是說，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還涉及那些核酸分子，其序列與具體列出的序列由于一個(gè)或多個(gè)所列密碼子為一個(gè)或多個(gè)其他密碼子所替代而不同，但這種替代不改變所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)。這也適用于以下描述的其他核酸分子。SEQ ID NO 4的核酸分子包含調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子和終止密碼子)并可以有利地，尤其在載體中，用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃支頂孢和用于生產(chǎn)頭孢菌素C。
所述的2.5kb的EcoRI/BamHI片段尤其包含新基因的編碼部分。這部分在圖2中描述并包含3個(gè)內(nèi)含子。這樣本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 2的堿基序列或如上討論的僅由于遺傳密碼簡并性而與SEQ ID NO 2的序列不同的堿基序列。這樣此類型的核酸分子與新基因編碼部分的基因組DNA序列相對應(yīng)。本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案是由于缺失一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)內(nèi)含子而與SEQ ID NO 2不同的核酸分子。
因此，本發(fā)明還優(yōu)選這樣的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 3的堿基序列或如上討論的由于遺傳密碼簡并性而與根據(jù)SEQ ID NO 3的序列不同的堿基序列。此類型的核酸分子不再包含任何所述的內(nèi)含子并因而可以等同于相應(yīng)的cDNA序列。
本發(fā)明的核酸分子(包括所述的cDNA分子)還可以，例如，全部或部分地合成。本發(fā)明的RNA分子或mRNA分子可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從微生物產(chǎn)黃支頂孢中分離或可以通過合成生產(chǎn)。可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從適當(dāng)?shù)膍RNA制備相應(yīng)的cDNA分子。
雖然所述的核酸分子完全可以包含其他堿基序列(例如為了編碼融合蛋白)，但優(yōu)選的實(shí)施方案涉及這樣的本發(fā)明核酸分子，其專一或僅僅由選自堿基序列SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4及如上討論的僅僅由于遺傳密碼簡并性而與任何所述的序列不同的堿基序列的堿基序列組成。
在另一實(shí)施方案中本發(fā)明的核酸分子還包含直接位于編碼區(qū)末端(與編碼的蛋白質(zhì)的C末端相對應(yīng))之后的一個(gè)或多個(gè)終止密碼子。優(yōu)選自然存在的已鑒定為TAA的終止密碼子。然而也可使用其他終止密碼子。
由于與其他已知蛋白質(zhì)序列的相似性，本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 1)可以表征為水解酶，尤其是乙酰輔酶A水解酶，但這并不應(yīng)解釋為限制性的。然而本發(fā)明主要關(guān)注的不是新蛋白功能的描述，而關(guān)注的尤其是編碼新蛋白的新基因的用途或本發(fā)明核酸分子的用途，其用于轉(zhuǎn)化，優(yōu)選地轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃支頂孢宿主菌株，尤其是為生產(chǎn)頭孢菌素C的目的，這在以下更詳細(xì)的進(jìn)行了描述。
本發(fā)明還涉及包含任何所述的本發(fā)明核酸分子的載體。優(yōu)選地，這樣的載體適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞尤其是微生物，尤其是產(chǎn)黃支頂孢。這樣的載體可以是例如質(zhì)粒的形式，并在必要時(shí)還包含本發(fā)明核酸分子之外的其它序列，例如，復(fù)制起點(diǎn)和其他調(diào)節(jié)元件(啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、翻譯起始信號(hào)、翻譯終止信號(hào)等)，以便進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后本發(fā)明核酸分子可以表達(dá)。進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后，本發(fā)明的核酸分子以及其他載體元件可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，相當(dāng)于新基因編碼部分的擴(kuò)增。本發(fā)明的載體有利地包含這樣的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 4的堿基序列。這樣的堿基序列與所述的EcoRI/BamHI片段相對應(yīng)并已經(jīng)包含調(diào)節(jié)序列，例如，相應(yīng)的啟動(dòng)子。
此類型的載體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過把本發(fā)明核酸分子克隆到適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)載體上來產(chǎn)生。
除了所描述的來源于新發(fā)現(xiàn)基因的核酸分子外，本發(fā)明的載體可尤其含有一個(gè)或多個(gè)來源于參與產(chǎn)黃支頂孢中頭孢菌素生物合成的其他已知基因的核酸分子，尤其是pcbAB(S.Gutierrez，J.Bacteriol.173(1991)，2354-2365頁)、pcbC(S.Gutierrez，J.Bacteriol.173(1991)，2354-2365頁)、cef D1(R.V.Ullan等，J.Biol.Chem.277(2002)46216-46225頁)、cefD2(R.V.Ullan等，J.Biol.Chem.277(2002)46216-46225頁)、cefEF(S.Gutierrez，J.Bacteriol.174(1992)，3056-3064頁)和cefG(S.Gutierrez，J.Bacteriol.174(1992)，3056-3064頁)。
這樣在另一實(shí)施方案中，如上所述的本發(fā)明的載體還包含至少一個(gè)其他的核酸分子，其編碼從下列產(chǎn)黃支頂孢基因pcbAB、pcbC、cefD1、cefD2、cefEF和cefG編碼的蛋白質(zhì)中選擇的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地還包含兩個(gè)其他的核酸分子，其相應(yīng)地編碼分別由產(chǎn)黃支頂孢基因pcbAB和pcbC編碼的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明的載體優(yōu)選還包含兩個(gè)其他的核酸分子，其相應(yīng)地編碼分別由產(chǎn)黃支頂孢基因cefD1和cefD2編碼的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明的載體優(yōu)選還包含兩個(gè)其他的核酸分子，其相應(yīng)地編碼分別由產(chǎn)黃支頂孢基因cefEF和cefG編碼的蛋白質(zhì)。
所使用的pcbAB序列優(yōu)選地與圖5中的核苷酸序列相對應(yīng)。所使用的pcbC序列優(yōu)選地與同樣能在圖5中找到的核苷酸序列相對應(yīng)。所使用的cefD1序列優(yōu)選地與圖6中的核苷酸序列相對應(yīng)。所使用的cefD2序列優(yōu)選地與同樣能在圖6中找到的核苷酸序列相對應(yīng)。所使用的cefEF序列優(yōu)選地與圖7中的核苷酸序列相對應(yīng)。所使用的cefG序列優(yōu)選地與同樣能在圖7中找到的核苷酸序列相對應(yīng)。
本發(fā)明還涉及這樣的宿主細(xì)胞，其已經(jīng)用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化，此載體包含本發(fā)明的新核酸分子并且還如上所述在適當(dāng)時(shí)包含其他核酸分子。宿主細(xì)胞優(yōu)選地是微生物，尤其是產(chǎn)黃支頂孢。
此類型的宿主細(xì)胞，尤其是產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化。例如，C.Nowak和U.Kuck，Curr.Genet.25(1994)，34-40頁中描述了這樣的方法。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞可以有利地用于生產(chǎn)頭孢菌素C。這樣本發(fā)明也涉及生產(chǎn)頭孢菌素C的方法，其包括在適于宿主細(xì)胞生產(chǎn)頭孢菌素C的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞。
適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)/發(fā)酵技術(shù)，例如尤其是用于產(chǎn)黃支頂孢的技術(shù)，是抗生素領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的并已經(jīng)應(yīng)用于頭孢菌素C的生產(chǎn)很長時(shí)間了。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中還包括分離生產(chǎn)的頭孢菌素C。本發(fā)明轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞生產(chǎn)的頭孢菌素C通常由微生物分泌并可以用已知的技術(shù)，例如層析技術(shù)，從培養(yǎng)物上清中純化或分離。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的頭孢菌素C可以優(yōu)選地通過反應(yīng)形成具有抗生素性質(zhì)的衍生物。
本發(fā)明的可選擇應(yīng)用涉及包含根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列的分離蛋白質(zhì)。如所述的，這樣的蛋白質(zhì)也包括相應(yīng)融合蛋白，在需要時(shí)可通過切割由此融合蛋白產(chǎn)生具有根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列的成熟蛋白質(zhì)。
本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)專一或僅僅由根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過在導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧怂拗骷?xì)胞生產(chǎn)，其中所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的適宜表達(dá)載體，此載體包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子。蛋白質(zhì)可用常見技術(shù)純化和分離。適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞的例子，尤其是當(dāng)使用本發(fā)明的cDNA時(shí)，是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)；適當(dāng)?shù)恼婧怂拗骷?xì)胞的例子是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO或BHK細(xì)胞。
本發(fā)明這樣的蛋白質(zhì)可以以分離的形式用于例如頭孢菌素C或其衍生物的合成或半合成。常見的實(shí)施方式的例子是在合成柱上固定，反應(yīng)在柱上發(fā)生。
本文中的參考文獻(xiàn)在此全部引用作為參考。
以下的實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明但并不局限于此。實(shí)施例尤其涉及本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。
實(shí)施例在此提及的材料和試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的，可商業(yè)購買或方便地獲得并可根據(jù)制造廠商的說明書使用。
實(shí)施例1鑒定A.chrysogenum的新基因和新蛋白質(zhì)頭孢菌素生物合成基因的DNA序列及側(cè)翼序列可在λ克隆的輔助下構(gòu)建。這樣的λ克隆可從含有A.chrysogenum ATCC48272菌株的DNA插入片段的λ基因庫中分離。例如在T.Maniatis等(見上文)中描述了λ基因庫的建立及用λ噬菌斑雜交的方法篩選λ基因庫。篩選需要的有關(guān)產(chǎn)黃支頂孢頭孢菌素生物合成基因的DNA序列信息可通過數(shù)據(jù)庫搜索的方法獲得(如GENBANK)。適于此數(shù)據(jù)庫檢索的搜索術(shù)語的例子為適當(dāng)?shù)纳锖铣苫虻拿Q(cefEF)，其中該基因?qū)⒊霈F(xiàn)在所搜索的克隆上。克隆本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因可以從使用cefEF基因序列信息通過噬菌斑雜交的方法鑒定的λ克隆開始，只要該克隆含有cefEF基因終止密碼子下游至少大約10kb DNA序列的DNA插入片段即可。完全包括本發(fā)明基因，尤其是本發(fā)明根據(jù)SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4的本發(fā)明核酸分子的約2.5kb的BamHI/EcoRI限制片段是隨后克隆所必需的。此片段可以，例如，通過使用下列序列限定的PCR1f和PCR1r引物以PCR方法鑒定引物PCR1f 5′-TTT GGG CGA GTG GGC TAA TA(SEQ ID NO 8)引物PCR1r 5′-CAA CAA CGC CTC TCC CGT CT(SEQ ID NO 9)為克隆新發(fā)現(xiàn)的基因或本發(fā)明的核酸分子，將約2.5kb的BamHI/EcoRI限制片段克隆到pCN3載體(在Nowak和Kuck中描述，見上文)中。此載體的特點(diǎn)在于具有允許選擇Acremonium轉(zhuǎn)化體的修飾的微管蛋白抗性基因(Nowak和kück，見上)。pCN3上單一的EcoRI切割位點(diǎn)被用來克隆。通過三步進(jìn)行連接反應(yīng)1)通過匹配的EcoRI切割位點(diǎn)連接兩個(gè)DNA分子；2)用Klenow酶修補(bǔ)突出的末端；3)通過進(jìn)一步連接反應(yīng)連接修飾的末端。
用連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(如DH5α菌株)并在其中生產(chǎn)足夠用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)化步驟的量并純化。由于構(gòu)建的方法的原因，也可能獲得含有反向核酸分子的質(zhì)粒；然而在原則上這些結(jié)構(gòu)具有相同的功能。含有所需質(zhì)粒的大腸桿菌克隆可通過使用所述PCR引物PCR1f和PCR1r進(jìn)行PCR鑒定；得到的PCR產(chǎn)物長度為2.5kb。這些PCR分析可用RocheApplied Science的Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)根據(jù)同時(shí)提供的PCR反應(yīng)說明書進(jìn)行。隨后的測序和評估得到圖2(SEQ ID NO 2)和圖4(SEQID NO 4)中描述的核酸序列。然后從中可以推出根據(jù)圖3(SEQ ID NO 3)的cDNA序列還有根據(jù)圖1(SEQ ID NO 1)的編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在原則上，可以通過測序和與圖2和圖4描述的DNA序列進(jìn)行序列比對最終確認(rèn)克隆產(chǎn)物。攜帶EcoRl/BamHI片段的質(zhì)粒在以下稱為質(zhì)粒1并使用。
實(shí)施例2A.chrysogenum的轉(zhuǎn)化通過標(biāo)準(zhǔn)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒1轉(zhuǎn)入產(chǎn)黃支頂孢ATCC48272(見上文)。例如在Nowak和Kück(見上引文)中描述了這些方法并包括在含有苯菌靈的營養(yǎng)瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇轉(zhuǎn)化體所需要的含有苯菌靈(benomyl)的營養(yǎng)瓊脂，以及用于此選擇的pCN3或質(zhì)粒1上改進(jìn)的微管蛋白基因CA-Tubulin(Tyr)的性質(zhì)，在Nowak和Kuck(見上引文)中均進(jìn)行了描述。從這種類型實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)化體可以進(jìn)行鑒定以確定質(zhì)粒1必需部分的存在，例如通過PCR方法鑒定。以下的PCR引物允許進(jìn)行這樣的鑒定引物PCR2f 5′-GCA GAG CGC AGA TAC CAA(SEQ ID NO 10)引物PCR2r 5′-CGT GGA CTC CAA CGT CAA(SEQ ID NO 11)得到的PCR產(chǎn)物長度為8,279bp。PCR分析可通過，例如，用RocheApplied Science的Expand Long Template PCR系統(tǒng)根據(jù)同時(shí)提供的PCR反應(yīng)說明書進(jìn)行。
適宜的是，除了帶有質(zhì)粒1的轉(zhuǎn)化體群體，還提供帶有pCN3的轉(zhuǎn)化體群體作為對照。這些轉(zhuǎn)化體可使用下列PCR引物在PCR反應(yīng)混合物中進(jìn)行分析引物PCR3f 5′-TTC CAT CCA GCA CCT CAC(SEQ ID NO 12)引物PCR3r 5′-CTT AAT GCG CCG CTA CAG(SEQ ID NO 13)得到的PCR產(chǎn)物長度為2,290bp。
實(shí)施例3頭孢菌素C的生產(chǎn)和分離實(shí)施例2產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢測頭孢菌素產(chǎn)量。適宜地，在每一種情況下，大約相同大小的約500個(gè)帶有質(zhì)粒1的轉(zhuǎn)化體群體和帶有pCN3的對照轉(zhuǎn)化體群體進(jìn)行平行比較。為此，搖瓶發(fā)酵的上清用HPLC分析的方法進(jìn)行評價(jià)。例如在L.Karaffa等，Appl.Microbiol.Biotechnol.51(1999)，633-638中描述了包括伴行分析的相應(yīng)方法。為了獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)數(shù)量的數(shù)據(jù)，這些分析重復(fù)多次(如6次)，每一個(gè)重復(fù)均包括每一菌株的多次單獨(dú)進(jìn)行檢測的(如4次)平行搖瓶發(fā)酵。這表明可以以這種方式鑒定出來源于帶有質(zhì)粒1的轉(zhuǎn)化體、與pCN3對照轉(zhuǎn)化體群體比較可重復(fù)地具有明顯較高頭孢菌素產(chǎn)量的菌株。
所述分析中使用的HPLC柱也可用于生產(chǎn)的頭孢菌素C的純化和分離。
實(shí)施例4包含產(chǎn)黃支頂孢基因cefD1和cefD2的質(zhì)粒2的構(gòu)建實(shí)施例1的質(zhì)粒1隨后用兩個(gè)頭孢菌素生物合成基因cefD1和cefD2擴(kuò)大。R.V.Ullan，J.Biol.Chem.277(2002)，46216-46225頁中描述了這些基因。兩個(gè)基因緊密相鄰都位于5.8kb的EcoRV/BamHI片段上并在合適的λ克隆輔助下提供。這樣的λ克隆從含有產(chǎn)黃支頂孢ATCC48272的DNA插入片段的λ基因庫中分離。例如在T.Maniatis等(見上引文)中，提到了λ基因庫的構(gòu)建以及通過λ噬菌斑雜交的方法篩選λ基因庫。篩選需要的生物合成基因cefD1和cefD2的DNA序列信息可通過如數(shù)據(jù)庫(如GENBANK)搜索的方法獲得。適合此數(shù)據(jù)庫搜索的檢索術(shù)語的例子為兩個(gè)生物合成基因(cefD1、cefD2)的名稱。兩個(gè)生物合成基因的克隆可以從λ克隆開始，所述λ克隆使用cefD1和cefD2基因序列信息通過噬菌斑雜交的方法鑒定，其含有至少6kb的DNA插入片段。包含兩個(gè)全長生物合成基因cefD1和cefD2的約5.8kb的BamHI/EcoRV限制片段是隨后克隆所必需的。這個(gè)片段可使用下列序列描述的PCR4f和PCR4r引物通過PCR進(jìn)行鑒定引物PCR4f 5′-ATC TGA GTG GTT GTT CCG CG(SEQ ID NO14)引物PCR4r 5′-CGA GGA TGA AGA CGG TGA AA(SEQ ID NO15)實(shí)施例1的質(zhì)粒1通過將根據(jù)SEQ ID NO 6的約5.8kb的BamHI/EcoRV限制片段克隆到質(zhì)粒1中擴(kuò)大，其中所述片段含有cefD1和cefD2兩個(gè)生物合成基因。使用質(zhì)粒1上單一的SmaI切割位點(diǎn)進(jìn)行克隆。5.8kb的BamHI/EcoRV限制片段的兩個(gè)突出末端用Klenow酶修補(bǔ)并與SmaI切割的質(zhì)粒1連接。
連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(如DH5α菌株)并生產(chǎn)以達(dá)到足夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化步驟的量并純化。由于構(gòu)建的方法的原因，也可能獲得含有反向核酸分子的質(zhì)粒；然而在原則上這些結(jié)構(gòu)具有相同的功能。含有所需質(zhì)粒的大腸桿菌克隆可通過使用所述的PCR引物PCR4f和PCR4r進(jìn)行PCR鑒定；得到的PCR產(chǎn)物長度為5.5kb。這些PCR分析可用RocheApplied Science的Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)根據(jù)同時(shí)提供的PCR反應(yīng)說明書進(jìn)行。在原則上，可以通過測序和與圖6描述的DNA序列進(jìn)行序列比對最終確認(rèn)克隆產(chǎn)物。攜帶BamHI/EcoRV片段的質(zhì)粒在以下稱為質(zhì)粒2并使用。
實(shí)施例5包含產(chǎn)黃支頂孢基因pcbAB和pcbC的質(zhì)粒3的構(gòu)建實(shí)施例1的質(zhì)粒1隨后由兩個(gè)頭孢菌素生物合成基因pcbAB和pcbC擴(kuò)大得到質(zhì)粒3。天然情況下，pcbAB和pcbC基因作為生物合成基因簇I以遺傳學(xué)上緊密連接的形式存在并在S.Gutierrez，J Bacteriol.173(1991)，2354-2365頁中描述。兩個(gè)基因緊密靠近都位于約16kb的SnaBI/BfrI片段上并在合適的λ克隆輔助下提供。這樣的λ克隆從含有產(chǎn)黃支頂孢ATCC48272的DNA插入片段的λ基因庫中分離。例如在T.Maniatis等(見上引文)中提到了λ基因庫的構(gòu)建以及通過λ噬菌斑雜交的方法篩選λ基因庫。篩選需要的生物合成基因pcbAB和pcbC的DNA序列信息可通過如數(shù)據(jù)庫(如GENBANK)搜索的方法獲得。適合此數(shù)據(jù)庫搜索的檢索術(shù)語的例子為兩個(gè)生物合成基因(pcbAB、pcbC)的名稱。兩個(gè)生物合成基因的克隆可以從λ克隆開始，所述的λ克隆使用pcbAB和pcbC基因序列信息通過噬菌斑雜交的方法鑒定，其含有至少16kb的DNA插入片段。約16kb的SnaBI/BfrI限制片段是隨后克隆所必需的，其包含兩個(gè)全長生物合成基因pcbAB和pcbC。這個(gè)片段可使用下列序列描述的PCR5f和PCR5r引物通過PCR進(jìn)行鑒定引物PCR5f 5′-AGG AGA GGC CGA AGA CGT CCC AGT A(SEQID NO 16)引物PCR5r 5′-TTT CGC TTA GGG CTC GGA CGC T(SEQ IDNO 17)實(shí)施例1的質(zhì)粒1通過將根據(jù)SEQ ID NO 5的約16kb的SnaBI/BfrI限制片段克隆到質(zhì)粒1中擴(kuò)大，其中所述限制片段含有pcbAB和pcbC兩個(gè)生物合成基因。質(zhì)粒1上單一的SmaI切割位點(diǎn)用來克隆。約16kb的SnaBI/BfrI限制片段的兩個(gè)突出末端用Klenow酶修補(bǔ)并與SmaI切割的質(zhì)粒1連接。
連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(如DH5α菌株)并生產(chǎn)以達(dá)到足夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化步驟的量并純化。由于構(gòu)建的方法的原因，也可能獲得含有反向核酸分子的質(zhì)粒；然而在原則上這些結(jié)構(gòu)具有相同的功能。含有所需質(zhì)粒的大腸桿菌克隆可通過使用所述PCR引物PCR5f和PCR5r進(jìn)行PCR鑒定；得到的PCR產(chǎn)物長度為10.5kb。這些PCR分析可用Roche AppliedScience的Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)根據(jù)同時(shí)提供的PCR反應(yīng)說明書進(jìn)行。在原則上，可以通過測序和與圖5描述的DNA序列進(jìn)行序列比對最終確認(rèn)克隆產(chǎn)物。攜帶SnaBI/BfrI片段的質(zhì)粒在以下稱為質(zhì)粒3并使用。
實(shí)施例6含有A.chrysogenum基因cefEF和cefG的質(zhì)粒4的構(gòu)建實(shí)施例1的質(zhì)粒1隨后用兩個(gè)頭孢菌素生物合成基因cefEF和cefG擴(kuò)大得到質(zhì)粒4。天然情況下，cefEF和cefG基因作為生物合成基因簇II以遺傳學(xué)上緊密連接的形式存在并在S.Gutierrez，J Bacteriol.174(1992)，3056-3064頁中描述。兩個(gè)基因緊密靠近都位于約4.6kb的XbaI/SgrAI片段上并在合適的λ克隆輔助下提供。這樣的λ克隆從含有產(chǎn)黃支頂孢ATCC48272的DNA插入片段的λ基因庫中分離。例如在T.Maniatis等(見上文)中提到了λ基因庫的構(gòu)建以及通過λ噬菌斑雜交的方法篩選λ基因庫。篩選需要的生物合成基因cefEF和cefG的DNA序列信息可通過如數(shù)據(jù)庫搜索的方法獲得(如GENBANK)。適合此數(shù)據(jù)庫搜索的檢索術(shù)語的例子為兩個(gè)生物合成基因(cefEF，cefG)的名稱。兩個(gè)生物合成基因的克隆可以從λ克隆開始，其中所述λ克隆使用cefEF和cefG基因序列信息通過噬菌斑雜交的方法鑒定，其含有至少4.6kb的DNA插入片段。約4.6kb的XbaI/SgrAI限制片段是隨后克隆所必需的，其包含兩個(gè)全長生物合成基因cefEF和cefG。這個(gè)片段可使用下列序列描述的PCR6f和PCR6r引物通過PCR進(jìn)行鑒定引物PCR6f 5′-TCG GGA GGT GGA GGAATT CT(SEQ ID NO 18)引物rPCR6r 5′-ATC TTG CGC GCT GTT TCG AG(SEQ ID NO19)實(shí)施例1的質(zhì)粒1通過將含有cefEF和cefG兩個(gè)生物合成基因的約4.6kb的XbaI/SgrAI限制片段克隆到質(zhì)粒1中擴(kuò)大。質(zhì)粒1上單一的SmaI切割位點(diǎn)用來克隆。4.6kb的XbaI/SnaBI限制片段的兩個(gè)突出末端用Klenow酶修補(bǔ)并與SmaI切割的質(zhì)粒1連接。
連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(如DH5α菌株)并生產(chǎn)以達(dá)到足夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化步驟的量并純化。由于構(gòu)建的方法的原因，也可能獲得含有反向核酸分子的質(zhì)粒；然而在原則上這些結(jié)構(gòu)具有相同的功能。含有所需質(zhì)粒的大腸桿菌克隆可通過使用所述PCR引物PCR6f和PCR6r進(jìn)行PCR鑒定；得到的PCR產(chǎn)物長度為2.5kb。這些PCR分析可用Roche AppliedScience的Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)根據(jù)同時(shí)提供的PCR反應(yīng)說明書進(jìn)行。在原則上，可以通過測序和與圖7描述的DNA序列進(jìn)行序列比對最終確認(rèn)克隆產(chǎn)物。攜帶XbaI/SgrAI片段的質(zhì)粒在以下稱為質(zhì)粒4并使用。
實(shí)施例7用質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃支頂孢以下描述了質(zhì)粒2的轉(zhuǎn)化過程；然而也可以相應(yīng)地用質(zhì)粒3和質(zhì)粒4并獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(實(shí)施例9和10)。
通過標(biāo)準(zhǔn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化入產(chǎn)黃支頂孢菌株(CEF-67605)中，其也可以使用可得的產(chǎn)黃支頂孢菌株如ATCC48272(見上文)作為替代。例如在Nowak和Kück中描述了這些方法(見上文)并包括在含有苯菌靈的營養(yǎng)瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。Nowak和Kuck(見上)描述了質(zhì)粒1及相應(yīng)地pCN3上用于選擇的改進(jìn)的微管蛋白基因CA-Tubulin(Tyr)的性質(zhì)，還描述了篩選所需要的含有苯菌靈的營養(yǎng)瓊脂。從此實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)化體可以通過PCR方法進(jìn)行鑒定以確定質(zhì)粒2必需部分的存在。以下的PCR引物允許進(jìn)行這樣的鑒定引物PCR7f 5′-GGG GCG GAG CCT ATG GAA AA(SEQ ID NO 20)引物PCR7r 5′-TCC AGC TCA CCT TGC TCC AG(SEQ ID NO 21)得到的PCR產(chǎn)物長度為9,001bp。PCR分析可通過，例如，用RocheApplied Science的Expand Long Template PCR系統(tǒng)，根據(jù)同時(shí)提供的PCR反應(yīng)說明書進(jìn)行。
適宜地，除了帶有質(zhì)粒2的轉(zhuǎn)化體群體還提供帶有pCN3的轉(zhuǎn)化體群體作為對照。這些轉(zhuǎn)化體可使用下列PCR引物在PCR混合物中進(jìn)行分析引物PCR3f 5′-TTC CAT CCA GCA CCT CAC(SEQ ID NO 12)引物PCR3r 5′-CTT AAT GCG CCG CTA CAG(SEQ ID NO 13)得到的PCR產(chǎn)物長度為2,290bp。
實(shí)施例8從根據(jù)實(shí)施例7的轉(zhuǎn)化的菌株生產(chǎn)和分離頭孢菌素C實(shí)施例7產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例3中所述進(jìn)行分析并從而純化頭孢菌素C。
在分析的550個(gè)轉(zhuǎn)化體中，發(fā)現(xiàn)7個(gè)菌株(如菌株CET-98118)，其頭孢菌素C滴度與未轉(zhuǎn)化的起始菌析相比增加多達(dá)10％。這樣的菌株可用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的目的。
實(shí)施例9用質(zhì)粒3轉(zhuǎn)化A.chrysogenum和隨后的頭孢菌素C生產(chǎn)和分離與實(shí)施例7類似，產(chǎn)黃支頂孢菌株(CEF-67605)用質(zhì)粒3轉(zhuǎn)化，其也可以使用可得的產(chǎn)黃支頂孢菌株如ATCC48272作為替代。
這種方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例3描述的進(jìn)行鑒定并從而純化頭孢菌素C。與未轉(zhuǎn)化的起始菌株比較頭孢菌素C滴度增加的菌株可用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的目的。
實(shí)施例10用質(zhì)粒4轉(zhuǎn)化A.chrysogenum和隨后的頭孢菌素C生產(chǎn)和分離與實(shí)施例7類似，產(chǎn)黃支頂孢菌株(CEF-67605)用質(zhì)粒4轉(zhuǎn)化，其也可以使用可得的產(chǎn)黃支頂孢菌株如ATCC48272(見上)作為替代。
這種方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體如實(shí)施例3描述的進(jìn)行鑒定并從而純化頭孢菌素C。與未轉(zhuǎn)化起始菌株比較頭孢菌素C滴度增加的菌株可用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的目的。
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其編碼專一由根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸分子，其為DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 2的堿基序列或僅由于遺傳密碼的簡并性而與根據(jù)SEQ ID NO 2的序列不同的堿基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 3的堿基序列或僅由于遺傳密碼的簡并性而與根據(jù)SEQ ID NO 3的序列不同的堿基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，其包含根據(jù)SEQ ID NO 4的堿基序列或僅由于遺傳密碼的簡并性而與根據(jù)SEQ ID NO 4的序列不同的堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，其專一地由從堿基序列SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和僅由于遺傳密碼的簡并性而與任何所述的堿基序列不同的堿基序列中選擇的堿基序列組成。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求1-7之任何一項(xiàng)的核酸分子的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，還包含至少一個(gè)其他的核酸分子，其編碼從下列產(chǎn)黃支頂孢基因pcbAB、pcbC、cefD1、cefD2、cefEF和cefG編碼的蛋白質(zhì)中選擇的蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，還包含兩個(gè)其他的核酸分子，其分別編碼由產(chǎn)黃支頂孢基因pcbAB和pcbC編碼的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，還包含兩個(gè)其他的核酸分子，其分別編碼由產(chǎn)黃支頂孢基因cefD1和cefD2編碼的蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，還包含兩個(gè)其他的核酸分子，其分別編碼由產(chǎn)黃支頂孢基因cefEF和cefG編碼的蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12之任何一項(xiàng)的載體，其適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的載體，其中宿主細(xì)胞為微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的載體，其中微生物為產(chǎn)黃支頂孢。
16.已用根據(jù)權(quán)利要求8-15之任何一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其為微生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中的微生物為產(chǎn)黃支頂孢。
19.生產(chǎn)頭孢菌素C的方法，包括在適于根據(jù)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞生產(chǎn)頭孢菌素C的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，還包括分離生產(chǎn)的頭孢菌素C。
21.包含根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的蛋白質(zhì)，其專一地由根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其編碼產(chǎn)黃支頂孢中一種新蛋白質(zhì)，涉及包含此核酸分子的載體，涉及已用此載體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)黃支頂孢宿主細(xì)胞，還涉及使用此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)頭孢菌素C的方法。
文檔編號(hào)C12P35/00GK1681841SQ03822136
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月17日
發(fā)明者H·庫爾恩施泰納, E·弗里德林 申請人:桑多斯股份公司