專(zhuān)利名稱(chēng)：：評(píng)估類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的制作方法評(píng)估類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)本發(fā)明涉及幫助進(jìn)一步評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的體外方法。該方法特別用于評(píng)價(jià)RA患者是否處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中。該方法例如通過(guò)分析生化標(biāo)記物實(shí)施，包括測(cè)定樣品中至少c-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6的濃度并將測(cè)定的濃度與RA潛在的快速進(jìn)展形式的可能性相關(guān)聯(lián)。處于快速進(jìn)展疾病的高風(fēng)險(xiǎn)中的患者可以是需要治療或者如果已經(jīng)治療還需要不同的和更有效治療的患者。本發(fā)明還涉及包含C-反應(yīng)蛋白和白介素的標(biāo)記物組在評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中的用途，以及教導(dǎo)了分別用于實(shí)施本發(fā)明方法的蛋白陣列裝置和試劑盒。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎("RA")是慢性、炎性、全身性疾病，其最突出的表現(xiàn)產(chǎn)生于受侵襲的關(guān)節(jié)，特別是手和腳的關(guān)節(jié)。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病可以緩慢發(fā)生，從數(shù)周到數(shù)月，或者癥狀可以急性方式快速顯現(xiàn)。RA具有世界性的分布并且涉及所有的種族群體。雖然疾病可以發(fā)生于任何年齡，但患病率隨著年齡增加并且發(fā)病率高峰在40歲到60歲之間。北美人口患病率估計(jì)從0.3%到1.5%不等。如今，僅在美國(guó)超過(guò)2,500,000個(gè)體被診斷患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，某些統(tǒng)計(jì)顯示650萬(wàn)到800萬(wàn)的人可能患有該疾病。通常受侵襲的女性比男性多2-3倍。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期癥狀主要是關(guān)節(jié)特異性的，例如伴有關(guān)節(jié)肺脹或壓痛的疼痛的關(guān)節(jié)，但也可以包括諸如僵硬、發(fā)熱、皮下結(jié)節(jié)和疲勞的非特異性表現(xiàn)。非常的特征是關(guān)節(jié)的對(duì)稱(chēng)性受累。最常受侵襲的是手、腳、膝和腕的關(guān)節(jié)，最終累及髖、肘和肩。隨著疾病的進(jìn)展，任何類(lèi)型的運(yùn)動(dòng)都變得非常疼痛和困難，最終導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)的功能的喪失。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎更嚴(yán)重的情況會(huì)導(dǎo)致劇烈疼痛和關(guān)節(jié)破壞。為了緩解疼痛和與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的關(guān)節(jié)破壞導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)喪失每年實(shí)施300,000例骨和關(guān)節(jié)置換術(shù)。最廣泛使用的分類(lèi)RA的體系是美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)于1987年修訂的用于RA分類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)(Arnett,F.C.,等，ArthritisRheum.31(1988)315-324)。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)(稱(chēng)為ARA標(biāo)準(zhǔn))，如果患者滿足下列七個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的至少四個(gè)，其中標(biāo)準(zhǔn)1-4必須存在至少6周，則患者被診斷為患有RA:l)晨僵至少一小時(shí)，2)3個(gè)或更多關(guān)節(jié)部位的關(guān)節(jié)炎，3)手關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎，4)對(duì)稱(chēng)性關(guān)節(jié)炎，5)類(lèi)風(fēng)濕性結(jié)節(jié)，6)血清類(lèi)風(fēng)濕因子("RF"),和7)放射學(xué)改變。這些標(biāo)準(zhǔn)具有大約90%的靈敏度和特異性。RA的組織學(xué)改變不是疾病特異性的，但主要取決于所涉及的器官。初期的炎性關(guān)節(jié)損傷累及滑膜。如通過(guò)電鏡法證實(shí)的，最早期的改變是滑液的微脈管系統(tǒng)損傷，伴有內(nèi)腔閉塞、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹以及內(nèi)皮細(xì)胞間隙。這個(gè)階段通常伴有表皮襯細(xì)胞層的輕度增殖。兩種細(xì)胞類(lèi)型構(gòu)成滑膜襯里骨髓衍生型A滑膜細(xì)胞，其具有巨噬細(xì)胞特性，和間質(zhì)型B滑膜細(xì)胞。兩種細(xì)胞類(lèi)型均導(dǎo)致滑膜增生，暗示這兩種細(xì)胞類(lèi)型之間的旁分泌相互作用。這個(gè)階段的炎癥與充血、水胂和纖維蛋白滲出有關(guān)。細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生于早期疾病并且開(kāi)始主要由T林巴細(xì)胞組成。由于炎癥，滑膜因血管和滑液成纖維細(xì)胞增殖和滑液襯層的增加和增大而變得肥大。肉芽組織延伸至軟骨稱(chēng)為血管翳。該組織在滑膜和骨的邊緣積極地侵襲并破壞關(guān)節(jié)周?chē)墓呛蛙浌?，稱(chēng)為侵蝕性RA。RA的關(guān)節(jié)表現(xiàn)可以分為兩類(lèi)與炎性滑膜炎有關(guān)的可逆的征兆和癥狀以及滑膜炎引起的不可逆的結(jié)構(gòu)性損傷。這種概念不僅對(duì)疾病分期和決定預(yù)后是有用的，對(duì)選擇藥物和手術(shù)治療也是有用的。典型的患者中的結(jié)構(gòu)性損傷通常開(kāi)始于疾病第一年和第二年間的某些時(shí)間(麗derHeijde,D.M.，等，Br.J.Rheumatol.34,S叩pl.2(1995)74-78)。雖然滑膜炎往往遵循波動(dòng)的方式，但結(jié)構(gòu)性損傷隨著在先滑膜炎的量的線性函數(shù)進(jìn)展。RA中早期癥狀的病因?qū)W仍然難以確定。如今自身免疫部分已被廣泛接受但其它因素仍然存在爭(zhēng)議。已經(jīng)極力推行了細(xì)菌或病毒感染的可能性。所有通過(guò)分離、電鏡法或分子生物學(xué)將傳染原與RA相聯(lián)系的努力都失敗了?？赡軟](méi)有RA單一的原發(fā)性誘因，不同的機(jī)制會(huì)導(dǎo)致初期的組織損傷并促成滑膜炎癥?；ぱ椎呐R床征兆可以是敏感并且常常是主觀的。發(fā)熱的、腫脹的、明顯發(fā)炎的關(guān)節(jié)通常只能在炎性滑膜炎最活躍的階段觀察到。軟骨損傷和關(guān)節(jié)周?chē)堑那治g是結(jié)構(gòu)性損傷的特征。與結(jié)構(gòu)性損傷相關(guān)的臨床特征的標(biāo)志為功能上和解剖上的進(jìn)行性退化。關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)性損傷是不可逆的和累加的?？v向臨床和流行病學(xué)研究的數(shù)據(jù)為治療提供了指導(dǎo)。這些研究強(qiáng)調(diào)l)需要早期診斷，2)預(yù)后因素的鑒別，以及3)早期有力地治療。更早的診斷和治療，優(yōu)選在癥狀出現(xiàn)后的前幾個(gè)月，可以幫助預(yù)防不可逆的關(guān)節(jié)損傷。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效治療通常包括藥物的組合、運(yùn)動(dòng)、休息和適當(dāng)?shù)年P(guān)節(jié)保護(hù)治療。非甾體抗炎藥、皮質(zhì)激素、金鹽、曱氨喋呤和全身性免疫抑制劑被廣泛地用于減少炎癥和關(guān)節(jié)破壞。但是，類(lèi)固醇和免疫抑制劑的應(yīng)用在毒性和對(duì)可能的致命癥狀的易損性方面具有顯著的風(fēng)險(xiǎn)和副作用。最近基于"生物制劑"的治療引入到RA治療中。這種療法，例如，是對(duì)抗顯著減少炎癥的TNF-a的可溶性受體或抗體。雖然非常具有前景，但由于高昂的成本生物制劑仍處于有限的使用中。建立診斷或評(píng)估疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的理想方案是單一事件或病變會(huì)引起各自的疾病的情況，例如在感染性疾病中。在其他所有情況中正確的診斷是非常困難的，尤其是當(dāng)疾病的病因?qū)W沒(méi)有被完全理解的時(shí)候，如針對(duì)RA的情形。因此在RA中，通常不同的臨床癥狀和生物學(xué)標(biāo)記物會(huì)一起考慮用于RA的診斷或評(píng)估疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。用于幫助RA診斷的第一種生化標(biāo)記物并且唯一廣泛接受的標(biāo)記物(參見(jiàn)上述ARA-標(biāo)準(zhǔn))是血清中檢測(cè)到的類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)。最近已經(jīng)引入新的稱(chēng)為抗-CCP的標(biāo)記物。已經(jīng)證實(shí)在許多獨(dú)立的研究中環(huán)瓜氨酸肽的自身抗體(抗-CCP)代表了用于RA的診斷的高敏感性和特異性標(biāo)記物。在過(guò)去的幾年中幾組研究人員對(duì)抗-CCP進(jìn)行了深入的研究(參考，例如，WO98/08946;WO98/22503;WO99/28344;WO99/35167;WO01/46222;和WO03/050542)。最近Schdlekens和同事(Schellekens，G.A.，ArthritisRheum.43(2000)155-163)報(bào)道與使用線性肽的相同測(cè)定相比，基于特異性環(huán)瓜氨酸肽(CCP)的ELISA-試驗(yàn)對(duì)于RA診斷準(zhǔn)確度顯示優(yōu)越的性能特性。對(duì)抗CCP的自身抗體，即最可能與患者血清中的瓜氨酸多肽循環(huán)反應(yīng)的和在體外測(cè)定中結(jié)合CCP的抗體稱(chēng)為"抗-CCP"。VanVenroji等的專(zhuān)利申請(qǐng)(WO98/22503)描述了某些瓜氨酸肽并證實(shí)環(huán)化導(dǎo)致自身抗體對(duì)這些肽提高的反應(yīng)性。與相應(yīng)的線性肽的36%相比，通過(guò)使用改善的CCPs作為抗原用于檢測(cè)抗-CCP抗體，靈敏度可以提高到63%。98/22503中建議了肽的組合以進(jìn)一步改善測(cè)定。許多研究小組近來(lái)顯示并證實(shí)與RF相比，抗-CCP是建立RA診斷更敏感和特異性的標(biāo)記物?？?CCP自身抗體對(duì)RA是高度特異性的(約97%特異性)，具有可與RF(65-80%)相比的靈敏度(Lee,D.M.和Schur,P.H.,Ann.Rheum.Dis.62(2003)870-874;Pruijn,G丄M.,等，Curr.Rheumatol.Rev.l(2005)1-7;Vallbracht,I.，等，Ann.Rheum.Dis.63(2004)1079-1084)。此外具有額外診斷價(jià)值的是抗-CCP可以在顯著比例的血清反應(yīng)陰性的RA患者中檢測(cè)到(vanPaassen,P.,等，BestPract.Res.Clin.Rheumatol.17(2003)475-494;Vallbracht,I.,等,Ann.Rheum.Dis.63(2004)1079-1084;Schellekens,G.A.，等，ArthritisandRheumatism43(2000)155-163)。這意味著抗-CCP自身抗體存在于顯著比例的對(duì)RF(血清)陰性的患者中。如上文討論的，建立RA診斷和決定最佳的治療選擇不是容易的任務(wù)。個(gè)體RA患者中病程顯著不同。迄今為止對(duì)RA中差結(jié)果沒(méi)有唯一的和廣泛接受的指標(biāo)。與預(yù)后不良有關(guān)的指標(biāo)包括，例如累積關(guān)節(jié)炎癥、高ESR或CRP水平、RF陽(yáng)性、早期放射學(xué)侵蝕、更差的功能分?jǐn)?shù)和不利的社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況。使情況更加復(fù)雜的是，評(píng)估RA的預(yù)后還缺乏清楚的和廣泛接受的疾病進(jìn)展的定義。為了評(píng)估RA中的治療反應(yīng)開(kāi)發(fā)了一些評(píng)分-根據(jù)臨床癥狀、影像改變或者身體功能。但是，大多數(shù)評(píng)分僅用于臨床試驗(yàn)設(shè)置，而很少或完全不用于風(fēng)濕病學(xué)實(shí)踐中。實(shí)例是美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)和歐洲防治風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)設(shè)計(jì)的不同反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(Felson，D.T.,等，ArthritisandRheumatism38(1995)727-735;vanGestel,A.M.,等，ArthritisandRheumatism39(1996)34-40)。ACR改善標(biāo)準(zhǔn)和EULAR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)都廣泛地用于臨床試驗(yàn)設(shè)置，但沒(méi)有用于臨床實(shí)踐中。對(duì)用于根據(jù)Sharp或Larsen及其迄今可得到的一些變體的放射學(xué)改變的評(píng)估的評(píng)分系統(tǒng)情況也是如此。雖然X-射線被用于每隔一定間隔監(jiān)測(cè)放射學(xué)疾病進(jìn)展，它們只是與以前的X-射線比較但不評(píng)分。此外，在歐洲D(zhuǎn)AS(疾病活性評(píng)分)及其簡(jiǎn)化版(DAS28、SDAI、CDAI)廣泛地用于處于治療中的疾病監(jiān)測(cè)。DAS包括觸痛和肺脹的關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)、ESR或CRP和疾病活性的整體評(píng)估(使用VAS-直觀類(lèi)比標(biāo)度)。在很小的程度上軀體功能的評(píng)估在疾病狀態(tài)的監(jiān)測(cè)中也起作用。這些是基于不同患者的問(wèn)巻調(diào)查-RA中最廣泛使用的是HAQ(健康評(píng)估問(wèn)巻)(Bruce，B.和Fries,J.F.,HealthQualLifeOutcomes1(2003)20)和SF-36(簡(jiǎn)表36)(Talamo,J.，等，BriU.Rheumato1.36(1997)463-469)。但是，上文提及的工具遠(yuǎn)不是最佳的。它們費(fèi)時(shí)并且受到主觀評(píng)定的影響，例如，在HAQ或觸痛/腫脹的關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)的情況中。最近，已經(jīng)進(jìn)行了嘗試通過(guò)在這種評(píng)估中包括更多的生化標(biāo)記物以進(jìn)一步評(píng)估RA不同的方面，或者甚至將這種評(píng)估基于生化標(biāo)記物。Coste,J.等(TheJournalofRheumatology24(1997)28-34)研究了二十個(gè)臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)預(yù)測(cè)RA中關(guān)節(jié)破壞的能力。發(fā)現(xiàn)鐵、CRP、ESR和al-酸糖蛋白與疾病進(jìn)展的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。但是，相關(guān)性不是非常強(qiáng)并且只存在于隨訪的前6個(gè)月。Aman，S,等Rheumatology39(2000)1009-1013研究了RA中疾病進(jìn)展是否可以通過(guò)標(biāo)記物IC丁P、RF和CRP預(yù)測(cè)。他們發(fā)現(xiàn)對(duì)于個(gè)體標(biāo)記物優(yōu)勢(shì)比為2.6-3.9,最好的標(biāo)記物比率具有9.1的優(yōu)勢(shì)比。該優(yōu)勢(shì)比在77%的靈敏度下轉(zhuǎn)化為71%的特異性。但是，71%的特異性是相當(dāng)?shù)偷?，因?yàn)樵谂R床常規(guī)中需要至少80%,或優(yōu)選甚至至少90%的特異性。Vissse，H，等ArthritisandRheumatism46(2002)357-365，提出了"持續(xù)性(侵蝕)關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)模型"。他們的模型由包含7個(gè)變量的發(fā)展預(yù)測(cè)模型組成初診時(shí)癥狀持續(xù)時(shí)間、晨僵^1小時(shí)、23處關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎、跖趾關(guān)節(jié)兩側(cè)壓迫性疼痛、類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體陽(yáng)性以及侵蝕(手/腳)的存在。可見(jiàn)兩種生化標(biāo)記物，RF和抗-CCP，形成他們的算法一部分。最近,Meyer,O,等(ArthritisResearchandTherapy8/2(2006)R40),提出在隨訪五年后使用抗-CCP自身抗體的系列測(cè)定來(lái)預(yù)測(cè)放射學(xué)結(jié)果。他們證實(shí)在基線處抗-CCP測(cè)定不是疾病進(jìn)展的充分預(yù)測(cè)因子。但是，在基線處進(jìn)展預(yù)測(cè)中的幫助正是從業(yè)醫(yī)生所需要的。然而RF和抗-CCP都是建立RA診斷的重要工具，它們似乎不是7預(yù)測(cè)未來(lái)病程中的有力幫助。已經(jīng)提出了許多標(biāo)記物或許多組標(biāo)記物，但是迄今所獲得的優(yōu)勢(shì)比還不充分或者基于太多種類(lèi)的生化和臨床參數(shù)而不能滿足臨床常規(guī)需要。因此，存在對(duì)特別是基于生化參數(shù)，幫助評(píng)估RA患者是否處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的方法的巨大的需要?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)CRP和白介素-6兩種標(biāo)記物互相補(bǔ)充并因此導(dǎo)致在患者經(jīng)歷更嚴(yán)重RA病程的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的改善。通過(guò)提供體外評(píng)估RA患者是否處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的方法和試劑，預(yù)期本發(fā)明至少部分克服評(píng)估RA患者是否處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的領(lǐng)域中存在的問(wèn)題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及幫助評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括獲得液體樣品、測(cè)定所述樣品中C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6以及4壬選的一種或多種其^f也標(biāo)記物的濃度、以及將測(cè)定的CRP和白介素-6以及任選的一種或多種其他標(biāo)記物的濃度與疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的步驟。還/>開(kāi)了包括至少CRP和白介素6的標(biāo)記物組在評(píng)估患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的用途。進(jìn)一步地本發(fā)明涉及實(shí)施幫助評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的方法的試劑盒，如本發(fā)明公開(kāi)的這種試劑盒包括分別特異性測(cè)定CRP和白介素-6所需的試劑，以及任選的實(shí)施測(cè)定的輔助試劑。還公開(kāi)了用于評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的，包括至少合適的用于CRP和白介素-6測(cè)定的特異性結(jié)合配偶體(partner)以及任選的合適的一種或多種其他標(biāo)記物的特異性結(jié)合配偶體的蛋白陣列裝置。發(fā)明詳述在第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明涉及幫助評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括步驟a)獲得液體樣品，b)測(cè)定所述樣品中C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6以及任選的一種或多種其他標(biāo)記物的濃度，和c)將步驟(b)中測(cè)定的濃度與疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。如本文使用的，每一個(gè)下列術(shù)語(yǔ)具有在本部分中與其相關(guān)的含義。本文使用的冠詞"一種(個(gè))"是指一種(個(gè))或多于一種(個(gè))(即至少一種(個(gè)))該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。例如，"一種標(biāo)記物"是指一種標(biāo)記物或多于一種標(biāo)記物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"是指生化以及臨床標(biāo)記物。術(shù)語(yǔ)標(biāo)記物和參數(shù)可以互換使用。本文使用的"生化標(biāo)記物"或"生物標(biāo)記物"是指作為目標(biāo)用于分析患者測(cè)試樣品的生物分子。這種分子目標(biāo)的實(shí)例是核酸、蛋白或多肽本身以及存在于樣品中的抗體。在本發(fā)明的意義上"臨床標(biāo)記物"是指RA患者的標(biāo)準(zhǔn)化臨床評(píng)估。優(yōu)選的臨床標(biāo)記物是例如疾病活性評(píng)分和/或放射學(xué)評(píng)分的評(píng)分。在本發(fā)明中用作標(biāo)記物的蛋白或多肽是意在包括所述蛋白的任何變體以及所述蛋白或所述變體的碎片，特別地，患者體液中存在的免疫可檢測(cè)的碎片。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到細(xì)胞釋放的或者存在于受損的細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白，例如，在炎癥期間，可以降解或者裂解成這種碎片。以非活性形式合成某些標(biāo)記物，其隨后通過(guò)蛋白水解作用被活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，蛋白或其碎片也可以作為復(fù)合物的一部分存在。在本發(fā)明的意義上這種復(fù)合物也可以用作標(biāo)記物。標(biāo)記物多肽的變體可以通過(guò)相同的基因編碼，但它們的PI或MW不同，或者兩個(gè)都不同(例如，選擇性mRNA或mRNA前體加工的結(jié)果，例如，可變剪接或有限蛋白酶解)，此外，或者可選擇的，可以來(lái)源于差異翻譯后修飾(例如，糖基化、酰化和/或磷酸化)。如上文所示，本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)標(biāo)記物也涉及存在于樣品中的抗體。在本案中，即，在RA中，這些抗體是自身抗體。自身抗體是患者樣品中的抗體，其結(jié)合于存在于患者自身細(xì)胞內(nèi)、或細(xì)胞上，或由患者自身細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"樣品，，是指為了體外評(píng)估而獲得生物樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或患者的樣品優(yōu)選可以包括任何體液。優(yōu)選的測(cè)試樣品包括血液、血清、血漿、尿、唾液和滑液。優(yōu)選的樣品是全血、血清、血漿或滑液，血漿或血清是最優(yōu)選的。樣品僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，剩余的樣品材料不會(huì)轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。一旦分析完成即丟棄樣品。術(shù)語(yǔ)"幫助"評(píng)估疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)是指本發(fā)明的方法(與其他變量一起，例如，臨床參數(shù)或從屬權(quán)利中公開(kāi)的參數(shù))會(huì)幫助醫(yī)生評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明涉及評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，該方法包括a)獲得液體樣品，b)測(cè)定所述樣品中C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6和任選的一種或多種其他標(biāo)記物的濃度，以及c)將步驟(b)中測(cè)定的濃度與疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的步驟。該方法將會(huì)成為醫(yī)生考慮的一個(gè)組成部分從而幫助即幫助他評(píng)估疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)語(yǔ)"評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)"或"評(píng)估可能性"，例如，疾病進(jìn)展的，是指當(dāng)實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，結(jié)果總是顯示進(jìn)行性RA的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性或相對(duì)可能性。結(jié)果越高，RA患者經(jīng)歷進(jìn)行性病程的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性也越高。在本發(fā)明的意義上"疾病進(jìn)展"是通過(guò)Sharp-Genant-評(píng)分評(píng)估的。進(jìn)展率每年>5的患者(在1或2年后Sharp-Genant-評(píng)分從基線的改變)被分類(lèi)為具有疾病進(jìn)展的RA患者。所有其他患者被分類(lèi)為無(wú)疾病進(jìn)展。"患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者"是滿足美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分類(lèi)而制定的修訂標(biāo)準(zhǔn)的患者(Arnett,F.C.,等，ArthritisRheum.31(1988)315-324)。這些標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)定義了兩種亞群的RA患者，顯示疾病進(jìn)展的患者以及顯示無(wú)疾病進(jìn)展的RA對(duì)照人群或亞群，研究了基于這些患者群生化標(biāo)記物預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的可能性。令人驚奇地，能夠發(fā)現(xiàn)并確定在臨床需要的高特異性下CRP力口白介素-6的標(biāo)記物組合對(duì)改善RA患者的病程預(yù)測(cè)的靈敏度是重要的。在本發(fā)明的方法中至少分別測(cè)定生物標(biāo)記物CRP和IL-6的濃度，并將該標(biāo)記物組合與診斷患有RA的患者的疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解將標(biāo)記物水平與某種可能性或風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的步驟可以以不同的方式實(shí)施和完成。優(yōu)選地標(biāo)記物CRP和IL-6測(cè)定的值進(jìn)行數(shù)學(xué)組合，將組合的值與潛在的診斷問(wèn)題相關(guān)聯(lián)。標(biāo)記物值可以通過(guò)任何合適的現(xiàn)有技術(shù)的數(shù)學(xué)方法進(jìn)行組合。優(yōu)選用于標(biāo)記物組合的數(shù)學(xué)算法是邏輯函數(shù)。運(yùn)用這種數(shù)學(xué)算法或這種邏輯函數(shù)的的結(jié)果優(yōu)選是單一值。該值可以容易地與RA疾病進(jìn)10展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。在一種優(yōu)選的方式中，這種邏輯函數(shù)是通過(guò)a)將RA患者分為經(jīng)歷疾病進(jìn)展的患者組和沒(méi)有經(jīng)歷疾病進(jìn)展的患者組，b)通過(guò)單變量分析鑒定這些組之間差異顯著的標(biāo)記物，c)邏輯回歸分析以評(píng)估用于評(píng)估RA疾病進(jìn)展的標(biāo)記物的獨(dú)立區(qū)別值，以及d)建立邏輯函數(shù)以組合獨(dú)立區(qū)別值而獲得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于組合CRP和IL-6值的邏輯函數(shù)是通過(guò)a)將RA患者分別分為經(jīng)歷疾病進(jìn)展的患者組和沒(méi)有經(jīng)歷疾病進(jìn)展的患者組，b)建立CRP和白介素-6的值，c)進(jìn)行邏輯回歸分析以及d)建立邏輯函數(shù)以組合CRP和IL-6標(biāo)記物的值而獲得的。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于將CRP和IL-6的測(cè)定與一種或多種其它標(biāo)記物的值組合的邏輯函數(shù)是通過(guò)a)將RA患者分為經(jīng)歷疾病進(jìn)展的患者組和沒(méi)有經(jīng)歷疾病進(jìn)展的患者組，b)通過(guò)單變量分析鑒定這些組之間差異顯著的一種或多種其它的標(biāo)記物，c)進(jìn)行邏輯回歸分析以評(píng)估所述的標(biāo)記物在評(píng)估RA疾病進(jìn)展中對(duì)CRP和白介素-6的組合是否具有附加區(qū)別值以及d)建立邏輯函數(shù)以組合CRP、白介素-6以及一種或多種其它標(biāo)記物的測(cè)定值而獲得的。用于將標(biāo)記物組合與疾病相關(guān)聯(lián)的邏輯函數(shù)優(yōu)選釆用通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法開(kāi)發(fā)和獲得的算法，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法例如判別分析(DA)(即線性的-、二次的-、規(guī)則化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非參數(shù)方法(即k-最近鄰分類(lèi)法)、PLS(偏最小二乘法)、基于樹(shù)的方法(即邏輯回歸、CART、隨機(jī)森林方法、Boosting/Bagging方法)、廣義線性模型(即邏輯回歸)、基于主組分的方法(即SIMCA)、廣義相加模型、基于模糊邏輯的方法、基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)毫無(wú)問(wèn)題地選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)評(píng)估本發(fā)明的標(biāo)記物組合并因此獲得合適的數(shù)學(xué)算法。優(yōu)選獲得用于將本發(fā)明的標(biāo)記物組合與RA疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)算法的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選自DA(即線性的、二次的、規(guī)則化的判別分析)、Kernel方法(即SVM)、非參數(shù)方法(即k-最近鄰分類(lèi)法)、PLS(偏最小二乘法)、基于樹(shù)的方法(即邏輯回歸、CART、隨才幾森林方法、Boosting方法)或廣義相加模型(即邏輯回歸)。關(guān)于這些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的細(xì)節(jié)可以參見(jiàn)下列參考文獻(xiàn)Ruczinski,L,等,J.ofComputationalandGraphicalStatistics12(2003)475-511;Friedman,J.H.，丄oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175;Hastie,T.,等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerVerlag(2001);Breiman,L.，等，Classificationandregressiontrees,California,Wadsworth(1984);Breiman,L.,RandomForests,MachineLearning45(2001)5-32;Pepe，M.S.,TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries,28(2003);和Duda,R.O.,等,PatternClassification,WileyInterscience,第2版(2001)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是使用生物學(xué)標(biāo)記物的潛在組合的最優(yōu)化的多變量臨界值(cut-off)并分別區(qū)分狀態(tài)A和狀態(tài)B,例如，RA疾病進(jìn)展和非RA疾病進(jìn)展。在這種類(lèi)型的分析中標(biāo)記物不再是獨(dú)立的而是形成標(biāo)記物組。能夠確定組合CRP和IL-6的測(cè)定結(jié)果的確顯著改善評(píng)估患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的診斷準(zhǔn)確度。在多變量分析中，CRP、IL-6和其它一些標(biāo)記物具有約0.7-約0.8的曲線下面積(AUC)。CRP和IL-6均為炎癥標(biāo)記物并且它們彼此高度相關(guān)。因此，很意外地觀察到CRP和IL-6可以組合并且作為個(gè)體標(biāo)記物在相同的特異性水平下在靈敏度方面顯示巨大的改善。AUC是診斷過(guò)程的性能或準(zhǔn)確度的指標(biāo)。診斷方法的準(zhǔn)確度最好通過(guò)其受試者操作特性(ROC)描述(參見(jiàn)特別是Zweig，M.H.,和Campbell,G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲線圖是在整個(gè)觀察的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)由連續(xù)變化決定閾值(decisionthresh-hold)得到的所有靈敏性/特異性對(duì)的曲線。ROC曲線下的面積稱(chēng)為AUC。實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的臨床性能取決于其診斷準(zhǔn)確度，或?qū)⑹茉囌哒_分類(lèi)為臨床上相關(guān)亞群的能力。診斷準(zhǔn)確度測(cè)定正確區(qū)分被研究的受試者兩種不同癥狀的試-瞼的能力。這種癥狀是例如健康和疾病或疾病進(jìn)展對(duì)沒(méi)有疾病進(jìn)展。在每個(gè)病例中，ROC曲線通過(guò)在決定閾值的全部范圍將靈敏性對(duì)l-特異性作圖，描述了兩種分布之間的重疊。在y軸上是靈敏度，或真陽(yáng)性率[定義為(真陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果數(shù))/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性測(cè)試結(jié)果數(shù))]。這也是指疾病或癥狀存在下的確定性。它由受影響的亞群?jiǎn)为?dú)計(jì)算。在x軸上是假陽(yáng)性率或l-特異性[定義為(假陽(yáng)性結(jié)果數(shù))/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果數(shù))]。它是特異性的指數(shù)，并完全地由未受影響的亞群計(jì)算。因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同亞群的試驗(yàn)結(jié)果，完全獨(dú)立地計(jì)算真和々i陽(yáng)性率，所以ROC曲線不依賴(lài)于樣品中疾病的患病率。ROC曲線上的每個(gè)點(diǎn)代表對(duì)應(yīng)于特定決定閾值的靈敏性/l-特異性對(duì)。具有完美辨別力的試驗(yàn)(在結(jié)果的兩個(gè)分布中沒(méi)有重疊)具有通過(guò)左上角的ROC曲線，在左上角，真陽(yáng)性率是l.O，或100%(完美的靈敏度)，并且假陽(yáng)性率是0(完美的特異性)。無(wú)辨別力的試驗(yàn)的理論曲線(兩組結(jié)果相同的分布)是從左下角至右上角的45°對(duì)角線。大多數(shù)曲線落在這兩個(gè)極端之間(如果ROC曲線完全落在45°對(duì)角線下，可以容易地通過(guò)將"確定性，，的標(biāo)準(zhǔn)從"高于"反轉(zhuǎn)為"低于"進(jìn)行校正，反之亦然)。定性地，曲線越接近左上角，試驗(yàn)的總準(zhǔn)確率也就越高。定量實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的診斷準(zhǔn)確度的一個(gè)方便的目的是通過(guò)單獨(dú)的數(shù)字表示其性能。最普通的總體測(cè)定是ROC曲線下面積(AUC)。按照慣例，該面積總是^).5(如果不是，可以反轉(zhuǎn)決定規(guī)則使其這樣)。值在1.0(兩組試驗(yàn)值的完美分離)和0.5(兩組試驗(yàn)值之間沒(méi)有明顯的分布差異)之間。該面積不僅取決于曲線特定的部分，例如最接近對(duì)角線的點(diǎn)或90%特異性的靈敏度，也取決于整個(gè)曲線。這是ROC曲線如何接近于完美ROC曲線(面積=1.0)的定量、描述性表述?？偟臏y(cè)定靈敏度將取決于實(shí)施本文公開(kāi)的方法所需的特異性。在某種優(yōu)選的情況中，75%的特異性可能是足夠的，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和所得算法可以基于這種特異性需要。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于評(píng)估患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的方法基于80%、85%或者特別優(yōu)選90%或95%的特異性。由實(shí)施例部分可以明顯看出，在90%的特異性下使用CRP和IL-6的標(biāo)記物組合具有大約50%的良好的靈敏度。這相當(dāng)于大約20%的總誤差，并且比單獨(dú)基于個(gè)體生化標(biāo)記物使用現(xiàn)有技術(shù)的方法獲得的總誤差要更好。使用給定的測(cè)定方法測(cè)量并確定了實(shí)施例部分中CRP和IL-6給定的水平。應(yīng)當(dāng)理解不同的測(cè)定會(huì)導(dǎo)致不同的臨界值。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)毫無(wú)問(wèn)題的按照本發(fā)明描述的方法確定這種供應(yīng)商依賴(lài)性(supplierdependent)臨界值。白介素-6(IL-6)是具有大量生物學(xué)活性的21kDa的分泌性蛋白，是i、性期反應(yīng)物，刺激多種蛋白的合成，包^粘附分子。其主要功能是介導(dǎo)肝臟蛋白的急性期生成，并且其合成是通過(guò)細(xì)胞因子IL-1和TNF-a誘導(dǎo)的。IL-6通常是由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞生成的。IL-6正常的血清濃度是<5pg/ml。檢測(cè)例如CRP和IL-6的生物標(biāo)記物的優(yōu)選方法是特異性結(jié)合測(cè)定，特別是免疫測(cè)定法。免疫測(cè)定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。進(jìn)行這種測(cè)定的方法以及實(shí)際應(yīng)用和操作總結(jié)于相關(guān)的教科書(shū)中。相關(guān)教科書(shū)的實(shí)例是Tijssen，P.,In:Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays，eds.R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg，Elsevier,Amsterdam(1990),pp.221-278,和多巻MethodsinEnzymology,eds.Colowick,S.P.,和Caplan，N.O.,AcademicPress,dealingwithimmunologicaldetectionmethods,凈爭(zhēng)別是70、73、74、84、92和121巻。例如IL-6可以通過(guò)竟?fàn)幮曰驃A心型(sandwich)免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選IL-6是在夾心型免疫測(cè)定法中測(cè)定的，夾心型免疫測(cè)定法基本上基于特異性結(jié)合于IL-6的抗體，IL-6直接或間接連接或能夠結(jié)合于固定相，特異性結(jié)合于可被檢測(cè)標(biāo)記的IL-6的抗體，并且在允許抗IL-6抗體與樣品中IL-6結(jié)合的條件下培養(yǎng)這些反應(yīng)物，分離未結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記的抗體，測(cè)定通過(guò)IL-6結(jié)合的標(biāo)記的抗體的量，以及將結(jié)合的標(biāo)記抗體的量與樣品中IL-6的濃度相關(guān)聯(lián)。C-反應(yīng)蛋白(CRP)是具有21kDa亞基的涉及宿主防御的均五聚體(homopentameric)Ca"-結(jié)合急性期蛋白。CRP合成是由IL-6誘導(dǎo)的，并由IL-I間接誘導(dǎo)，因?yàn)镮L-I可以引發(fā)通過(guò)肝竇中的K叩ffer細(xì)胞的IL-6的合成。在卯°/。的健康人群中CRP正常的血漿濃度是〈3^g/ml(30nM),在99%的健康個(gè)體中<10嗎/ml(100nM)。血漿CRP濃度可以，例如通過(guò)均質(zhì)測(cè)定形式或ELISA測(cè)定。CRP被認(rèn)為是全身性炎癥的標(biāo)記物。進(jìn)一步混雜和合并患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的因素是患者在就診的時(shí)候可以是在疾病發(fā)展的不同階段和處于不同的治療方案中。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)能夠證實(shí)所發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記物組合對(duì)還沒(méi)有使用抗風(fēng)濕藥物治療的患者和已經(jīng)處于使用緩解疾病的抗類(lèi)風(fēng)濕性藥物(DMARD)治療的患者具有預(yù)測(cè)性。特別是后來(lái)的發(fā)現(xiàn)具有更大的相關(guān)性，其顯示本發(fā)明公開(kāi)的方法可以幫助鑒定那些對(duì)使用DMARD治療不響應(yīng)或者不充分響應(yīng)的患者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明的方法是使用從處于使用選自緩解疾病的抗類(lèi)風(fēng)濕性藥物(DMARD)的抗風(fēng)濕藥治療的RA患者獲得的樣品實(shí)施的。還優(yōu)選，本文公開(kāi)的方法是使用從還沒(méi)有處于使用抗風(fēng)濕藥治療的RA患者獲得的樣品實(shí)施的。相信隨著CRP和IL-6標(biāo)記物組合的鑒定，用于評(píng)估患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的重要地標(biāo)記物組合還沒(méi)有被鑒定。如本發(fā)明人進(jìn)一步所示，評(píng)估患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的方法可以進(jìn)一步通過(guò)將兩種關(guān)鍵標(biāo)記物CRP和IL-6的測(cè)定與進(jìn)一步的參數(shù)組合來(lái)改善。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括a)獲得液體樣品，b)測(cè)定所述樣品中C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6以及一種或多種其它標(biāo)記物的濃度，c)將步驟(b)中測(cè)得的濃度與疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的步驟，其中任選的一種或多種其他標(biāo)記物選自骨或軟骨標(biāo)記物、滑液標(biāo)記物、其他炎癥標(biāo)記物、遺傳標(biāo)記物和放射學(xué)評(píng)分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中用于本發(fā)明方法的一種或多種其他標(biāo)記物是骨或軟骨標(biāo)記物，優(yōu)選所述的骨或軟骨標(biāo)記物選自PINP、卩-CrossLaps、CartiLaps、骨4丐素和ICTP,還優(yōu)選一種或多種骨或軟骨標(biāo)記物是ICTP和/或CartiLaps。最顯著的關(guān)節(jié)組織是骨、軟骨和滑膜。由于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是破壞性疾病，這些組織受到影響的最多。在RA領(lǐng)域它們是潛在的生物學(xué)標(biāo)記物可能的來(lái)源。原則上這些標(biāo)記物不4義可以來(lái)自于各自組織的石皮壞也可以來(lái)自于失控和/或無(wú)效的修復(fù)過(guò)程。有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員會(huì)理解，骨、軟骨和滑膜代謝的標(biāo)記物可以來(lái)源于這些組織的合成或破壞。多種骨、軟骨和滑膜代謝的標(biāo)記物可以由兩種不同組的蛋白進(jìn)行描繪。它們來(lái)自于多種類(lèi)型的膠原或非膠原蛋白。非膠原蛋白通常參與細(xì)胞外基質(zhì)的形成。在所有三種組織中可以發(fā)現(xiàn)不同量的其中一些標(biāo)記物。骨和/或軟骨標(biāo)記物包括骨和/或軟骨膠原降解的標(biāo)記物以及骨和/或軟骨膠原形成的標(biāo)記物。優(yōu)選的膠原衍生的骨或軟骨標(biāo)記物是1.吡咬諾林(=PYD)、脫氧吡啶諾林(=DYD)和Glc-Gal-PYD:吡啶諾林(=PYD)通過(guò)交聯(lián)膠原三螺旋的鏈穩(wěn)定膠原。PYD的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，作為膠原降解的最終產(chǎn)物可以在血清和尿中發(fā)現(xiàn)(Knott,L.,和Bailey，A丄，Bone22(1998)181-187)。其與關(guān)節(jié)炎有關(guān)(Kaufmann，丄，等，Rheumatology42(2003)314-320)。PYD監(jiān)測(cè)參與關(guān)節(jié)破壞的軟骨，因?yàn)槠溆绍浌轻尫牛⑶覂H一定程度上由骨釋放，而其近親脫氧吡啶諾林(=DYD)主要來(lái)源于骨。所有三種標(biāo)記物與關(guān)節(jié)炎相關(guān)(Kaufmann,supra)。糖基化形式的Glc-Gal-PYD主要發(fā)現(xiàn)于滑液組織(Gineyts,E.,等，Rheumatology40(2001)315-323)。2.交聯(lián)端肽CTX-I、CTX-II、NTX-I、LQ-表位，它們是分別來(lái)自于I型或II型膠原的C-或N-末端的交聯(lián)端肽，其中卩-CTX-I也稱(chēng)為卩-CrossLaps⑧(Bonde，M.,等，Clin.Chem.40(1994)2022-2025)。3.I型膠原羧基末端終肽(-ICTP)是指I型膠原片段和標(biāo)記物，其初期來(lái)源于I型膠原通過(guò)氰溴化物裂解(US5,538,853)。4.來(lái)源于膠原的線性肽稱(chēng)為。&1^&口8@的測(cè)定法測(cè)量來(lái)源于II型膠原C-末端區(qū)域的線性肽(US6,372,442)。5.修飾的氨基酸膠原包含例如羥基脯氨酸和半乳糖羥基賴(lài)氨酸的修飾的氨基酸，其可以用作膠原降解的標(biāo)記物(Al-Dehaimi，A.W.,等，Clin.Chem.45(1999)676-681)。6.膠原新表位(neoepit叩es):Col2-3/4和CIIN是通過(guò)膠原酶由II型膠原的初期裂解生成的新表位(Billinghurst,R.C.,等，J.Clin.I鵬st.99(1997)1534-1545)。7.考慮過(guò)的反映骨形成的膠原標(biāo)記物I型膠原的N-末端以及C-末端前肽(=PINP和PICP),分別在合成期間/之后由前體多肽(前膠原)和骨形成的考慮過(guò)的標(biāo)記物剪切得到。PIICP是來(lái)自II型膠原的相對(duì)應(yīng)的前肽，而PIIINP來(lái)源于III型膠原。還優(yōu)選骨或軟骨標(biāo)記物是非膠原標(biāo)記物，例如CS846,其為在聚集蛋白聚糖合成期間生成的硫酸軟骨素表位；在軟骨中具有橋接功能的軟骨低聚物基質(zhì)蛋白(=COMP)(Saxne,T.,和Heinegard,D.，Br丄Rhe醒to1.31(1992)583-591);軟骨間層蛋白(=CILP),其為軟骨的基質(zhì)蛋白(Lorenzo,P.,等，J.Biol.Chem.273(1998)23463-23468);軟骨基質(zhì)蛋白1-3也稱(chēng)為matnlins;在軟骨中作為信號(hào)分子的chondromodulins(Suzuki,F.,Connect.TissueRes.35(1996)303-307);軟骨原性視黃酸敏感蛋白(=CD-RAP)或MIA,其在軟骨細(xì)胞調(diào)控中具有尚未確定的功能(Mueller-Ladner，U.,等，Rheumatology38(1999)148-154);骨4丐素，其由成骨細(xì)胞合成，屬于主要的骨非膠原基質(zhì)蛋白，用于監(jiān)測(cè)骨轉(zhuǎn)換(Gundberg,C.M.，等，J.Clin丄igandAssay21(1998)128-138);以及骨唾液蛋白，其為主要的骨非膠原基質(zhì)蛋白，例如骨唾液蛋白II,現(xiàn)稱(chēng)為骨唾液蛋白，其例如作為標(biāo)記物用于評(píng)估骨轉(zhuǎn)換(Saxne,T.,等，ArthritisRheum.38(1995)82-90)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明方法中所用的一種或多種其他標(biāo)記物是滑液標(biāo)記物，選自基質(zhì)金屬蛋白酶l(=pro-MMP-l)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(=pro-MMP-3)、透明質(zhì)酸，優(yōu)選地一種或多種其他滑液標(biāo)記物是透明質(zhì)酸和pro-MMP3?；|(zhì)-金屬蛋白酶(=MMP)家族降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)的組分。因此MMP不僅和多種類(lèi)型的癌癥相關(guān)，也與RA中的炎癥過(guò)程相關(guān)。MMP1和MMP3是由成纖維細(xì)月包、成骨細(xì)月包和內(nèi)皮細(xì)月包通過(guò)例如IL-1或TNF-a的促炎細(xì)胞因子刺激生成的。通常在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)作為無(wú)活性的前體形式的MMP，即，分別作為pro-MMPl和pro-MMP3。已經(jīng)在RA患者的滑液中檢測(cè)到pro-MMP1和pro-MMP3，它們的水平對(duì)抗TNF-a療法敏感。用于評(píng)估患有RA的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物組中使用的最優(yōu)選金屬蛋白酶是pro-MMP3。除了上文提及的金屬蛋白酶，也可能使用它們統(tǒng)稱(chēng)為基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑(=TIMP)的相應(yīng)的抑制劑，例如，MMP-1和MMP-3在體內(nèi)通過(guò)TIMP-1失活，TIMP-1是29.5kD的唾液糖蛋白，其與MMP形成1:1的定比化學(xué)復(fù)合物。已經(jīng)研究了RA中TIMP1和TIMP-2與軟骨的破壞的關(guān)系(Ishiguro,N.,等，ArthritisRheum.44(2001)2503-2511)。葡糖胺聚糖透明質(zhì)酸是一種關(guān)節(jié)功能必需的大分子。它是由成纖維細(xì)胞和其它特殊結(jié)締組織細(xì)胞合成的。透明質(zhì)酸參與細(xì)胞外基質(zhì)的形成和細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸。在滑液中發(fā)現(xiàn)高濃度，在其中負(fù)責(zé)水分的保持從而有助于關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中透明質(zhì)酸的合成由促炎癥介質(zhì)IL-1和TNF-a刺激，導(dǎo)致增加血清/血漿水平(Sawai,T.,和Uzuki,M.,ConnectiveTissue33(2001)253-259)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所用的一種或多種其他標(biāo)記物是遺傳標(biāo)記物，選自HLA-DR4和HLA-DRB1等位基因，優(yōu)選地一種或多種其他遺傳標(biāo)記物是HLA-DRBTOl或/和HLA-DRBr04等位基因(Goronzy,J丄，等，ArthritisandRheumatism50(2004)43-54)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明方法中所用的一種或多種其他標(biāo)記物是放射學(xué)評(píng)分，優(yōu)選地所述的放射學(xué)評(píng)分選自Sharp-評(píng)分、Sharp-Genant-評(píng)分、vanderHeijde-Sharp-評(píng)分、Ratingen-評(píng)分、Larsen-評(píng)分、RAU-評(píng)分和Herborn-評(píng)分，還優(yōu)選一種或多種放射學(xué)評(píng)分是Sharp-Genant-評(píng)分或/和Larsen-評(píng)分。"Sharp-評(píng)分，，首先在1971年被提出(Sharp,J.T.,等，ArthritisandRheumatism14(1971)706-720)并在1985年被進(jìn)一步闡明(Sharp,J.T.,等，ArthritisandRheumatism28(1985)1326-1335)。"Sharp-Genant-評(píng)分"是Genant于1983年提出的"Sharp-評(píng)分"的修正版(Genant,H.K.,Am丄Med.75(1983)35-47)。"vanderHeijde-Sharp-評(píng)分"是vanderHeijde于1989年提出的"Sharp-評(píng)分，，的修正版(vanderHeijde,D.M.F.M.，Lancet1(1989)1036-1038)。"Larsen-評(píng)分"首先在1977年被提出(Larsen,A.，等，ActaRadiol.Diagn.18(1977)481-491)。"RAU-評(píng)分"有時(shí)也稱(chēng)為"Ratingen-評(píng)分"是Larsen-評(píng)分的修正版(Rau，R.和Wassenberg,S.，Z.Rheumatol.62(2003)555-565)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明方法中所用的一種或多種其他標(biāo)記物是炎癥的進(jìn)一步標(biāo)記物，優(yōu)選所述的炎癥的進(jìn)一步標(biāo)記物是炎癥標(biāo)記物，選自S100-蛋白、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、SAA和E-選4奪素，優(yōu)選它是SAA或/和E-選擇素。術(shù)語(yǔ)"炎癥的其它標(biāo)記物"或"炎癥的進(jìn)一步標(biāo)記物"是指這些標(biāo)記物不是CRP和IL-6。血清淀粉樣蛋白A(二SAA)是U.7kDa的低分子量的急性期蛋白。其主要是通過(guò)肝對(duì)IL-1、IL-6或TNF-a刺激響應(yīng)而合成，并參與T-細(xì)胞依賴(lài)性免疫應(yīng)答的調(diào)控。在急性癥狀下SAA的濃度增加至1000倍，達(dá)到每毫升1毫克。其用于監(jiān)測(cè)疾病例如嚢性纖維化、腎移植排斥、外傷或感染中的炎癥。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中在某些情況下它用作CRP的替代物，但是，SAA還沒(méi)有被廣泛地接受。S-100蛋白形成不斷增加的Ca^結(jié)合蛋白家族，如今包括超過(guò)20個(gè)成員。S-100蛋白的生理學(xué)相關(guān)結(jié)構(gòu)是同型二聚體，但某些也可以互相形成異型二聚體，例如S100A8和S100A9。其細(xì)胞內(nèi)功能從蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性或細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)的調(diào)控到參與細(xì)胞增殖和分化。由于某些S100-蛋白也由細(xì)胞釋放，其細(xì)胞外功能也已經(jīng)得到描述，例如，神經(jīng)元存活、星形細(xì)胞增殖、凋亡的誘導(dǎo)和炎癥過(guò)程的調(diào)控。在S100A8對(duì)十曼性炎癥應(yīng)答的炎癥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了S100A8、S100A9、異型二聚體S100A8/A9和S100A12,而在急性炎癥中S100A9、S100A8/A9和S100A12增加。S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12已經(jīng)與具有炎癥組分的不同的疾病相聯(lián)系，包括某些癌癥、腎移植排斥、結(jié)腸炎以及更重要的是與RA相聯(lián)系(Burmeister,G.,和Gallacchi,G.,Inflammopharmacology3(1995)221-230;Foell,D.,等,Rheumathology42(2003)1383-1389)。用于評(píng)估RA中疾病進(jìn)展的標(biāo)記物組中使用的最優(yōu)選的S100標(biāo)記物是S100A8、S100A9、S100A8/A9異型二聚體和S100A12。sE-選擇素(可溶性?xún)?nèi)皮白細(xì)胞粘附分子-1,ELAM-1)是115kDa,I型跨膜糖蛋白，其僅在被炎癥細(xì)胞因子(IL-1卩、TNF-a)或內(nèi)毒素激活后在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。細(xì)胞表面E-選擇素是白細(xì)胞滾動(dòng)附著于內(nèi)皮-在炎癥部位白細(xì)胞外滲中的必要步驟-的介質(zhì)，因此在局部炎癥應(yīng)答中起到重要作用。在健康個(gè)體的血液中發(fā)現(xiàn)可溶性E-選擇素，可能來(lái)源于表面表達(dá)的分子的蛋白水解裂解。在許多疾病中已經(jīng)報(bào)道了血清中水平升高的sE陽(yáng)選擇素(Gearing,A丄H.,等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331)。優(yōu)選地為了評(píng)估RA中疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)用于與CRP和IL-6組合的一種或多種其它標(biāo)記物是生化標(biāo)記物或生物標(biāo)記物。優(yōu)選地生物標(biāo)記物是多肽或自身抗體。由實(shí)施例部分可以明顯看出包含CRP和IL-6的標(biāo)記物組會(huì)幫助評(píng)估患有RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明涉及包含至少CRP和白介素-6的標(biāo)記物組在評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的用途。與CRP和IL-6—起使用的一種或多種額外的標(biāo)記物優(yōu)選是標(biāo)記物組的一部分，即適合進(jìn)一步完善任何患有RA患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估一系列標(biāo)記物。在這種用于評(píng)估RA進(jìn)展的標(biāo)記物組中標(biāo)記物的總數(shù)優(yōu)19選少于20種標(biāo)記物，更優(yōu)選少于15種標(biāo)記物，還優(yōu)選少于10種標(biāo)記物，8種或更少的標(biāo)記物甚至是更優(yōu)選的。優(yōu)選的是總共包含3、4、5或6種標(biāo)記物的用于評(píng)估RA中疾病進(jìn)展的標(biāo)記物組。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案涉及標(biāo)記物組在評(píng)估患有RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的用途，該組包含CRP、白介素-6和至少一種選自CartiLaps、透明質(zhì)酸、E-選4奪素和ICTP的額外標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中幫助評(píng)估患有RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物組包括CRP、白介素-6和透明質(zhì)酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中幫助評(píng)估患有RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物組包括CRP、白介素-6和E-選才奪素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中幫助評(píng)估患有RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物組包括CRP、白介素-6和ICTP。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中幫助評(píng)估患有RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物組包括CRP、白介素-6和CartiLaps。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中實(shí)施至少CRP和白介素-6測(cè)定所需的試劑以試劑盒形式提供。因此本發(fā)明也涉及包含分別特異性測(cè)定CRP和白介素-6所需的試劑，以及任選的實(shí)施測(cè)定的輔助試劑的試劑合瘋。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性結(jié)合兩種生物標(biāo)記物蛋白CRP和IL-6以及任選的一種或多種其它生物標(biāo)記物的試劑固定于固體載體上，例如聚苯乙烯表面。本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供同時(shí)結(jié)合并定量用于評(píng)估RA中疾病進(jìn)展的標(biāo)記物組的蛋白微陣列或蛋白陣列裝置。蛋白陣列裝置由結(jié)合于載體材料上確定點(diǎn)的分子(捕獲劑)組成。優(yōu)選地生物素化的特異性結(jié)合試劑作為涂布有抗生蛋白鏈菌素的固定相上非常小的點(diǎn)結(jié)合。然后陣列接觸樣品。例如抗體的捕獲劑能夠結(jié)合來(lái)自生物樣品的感興趣的蛋白。然后可以通過(guò)定量每個(gè)點(diǎn)產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)特異性分析蛋白與個(gè)體位點(diǎn)的結(jié)合。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明涉及用于評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的包含至少合適的用于CRP和白介素-6測(cè)定的特異性結(jié)合配偶體和任選的合適的一種或多種其它標(biāo)記物的特異性結(jié)合配偶體的蛋白陣列裝置。提供下列實(shí)施例和圖以幫助理解本發(fā)明，所附權(quán)利要求所述的真實(shí)范圍。應(yīng)當(dāng)理解可以在所述的方法中進(jìn)行改變而不偏離本發(fā)明的精神。附圖簡(jiǎn)述圖1所有RA患者進(jìn)展率1的累積概率圖(x軸=累積概率％,y-軸二SharpGenant評(píng)分中的變化)圖2-5顯示單個(gè)標(biāo)記物或標(biāo)記物組合的箱線圖(boxplots)。組I的RA患者分為具有疾病進(jìn)展的或沒(méi)有疾病進(jìn)展的。特異性(每個(gè)圖中右邊的箱)設(shè)置為大約卯％(y軸上=0.9)。每個(gè)標(biāo)記物或標(biāo)記物組合的靈敏度顯示于中間的箱，對(duì)應(yīng)的總誤差通過(guò)左邊的箱線圖輔助顯示。(箱=25化-75化四分值；須(whiskers)=1.5倍四分位差；箱中-=中位數(shù)；+顯示平均值的位置；*=落在須外的個(gè)體值)圖2CRP的箱線圖靈敏度=35%;總誤差=23%圖3IL-6的箱線圖靈敏度=35%;總誤差=25%圖4CRP+IL-6標(biāo)記物組合的箱線圖靈敏度=50%;總誤差=20%圖5CRP、IL-6和pro-MMP3標(biāo)記物組合的箱線圖靈敏度=53%;總誤差=20%實(shí)施例1研究人群來(lái)源于237個(gè)高度特征的最大病程15年的RA患者的樣品收集于具有一或兩年隨訪的五個(gè)歐洲中心。根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分類(lèi)的1987年修訂標(biāo)準(zhǔn)，所有個(gè)體^皮診斷為RA-患者(Arnett,F.C.,等，ArthritisRh函.31(1988)315-324)。所有患者使用廣泛的病例報(bào)告表(=CRF)記錄。CRF包括健康評(píng)估問(wèn)巻、SF36問(wèn)巻、腫脹和觸痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)、相關(guān)手術(shù)的臨床史、藥物、共病(co-morbidities)和共病的藥物。在基線處由手和腳獲得X-射線，在一年和兩年后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化程序。只有從RA-患者獲得的基線樣品用于不同分析物的測(cè)定，相應(yīng)的結(jié)果用于單變量和多變量分析。研究人群的人口數(shù)據(jù)顯示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例2Sharp-Genant-評(píng)分的測(cè)定在基線處以及一年和兩年后從每個(gè)患者的四肢獲得x射線。將傳統(tǒng)的膠片x光照片送至Synarc(SynarcGmbH,漢堡，德國(guó))，在那里使用Lumiscan200高分辨率數(shù)字轉(zhuǎn)換器將硬拷貝膠片數(shù)字化。在質(zhì)量檢查后，由有經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師讀取每個(gè)圖像并根據(jù)Genant-modifiedSharpscoring進(jìn)行評(píng)分。x光照片的形態(tài)學(xué)評(píng)分根據(jù)下文描述的Genant-修改的Sharp評(píng)分方案對(duì)手和腳中骨侵蝕和關(guān)節(jié)腔狹窄進(jìn)行評(píng)分。該評(píng)分方案是基于Genant-修改的Sharp評(píng)分技術(shù)。侵蝕評(píng)分基于侵蝕的大小和累及骨(關(guān)節(jié)的兩側(cè))的面積使用8點(diǎn)的評(píng)分等級(jí)從0-3.5對(duì)每個(gè)手腕和手上的14個(gè)位點(diǎn)(4個(gè)近端指間和5個(gè)掌指關(guān)節(jié)、拇指的腕掌關(guān)節(jié)、舟骨、橈骨遠(yuǎn)端和尺骨遠(yuǎn)端)和每只腳的六個(gè)關(guān)節(jié)(5個(gè)跖趾關(guān)節(jié)和趾I(即，拇趾)的趾間關(guān)節(jié))進(jìn)行評(píng)分0(正常無(wú)侵蝕)0.5(皮質(zhì)連續(xù)性的微小損失或骨侵蝕不確定的結(jié)果)1.0(輕度一個(gè)或兩個(gè)關(guān)節(jié)骨確定但低的侵蝕，通常在棵區(qū)，包括<25°/。的關(guān)節(jié)面)1.5(輕度至中度中小型侵蝕，包括<25%的一個(gè)或兩個(gè)關(guān)節(jié)骨的關(guān)節(jié)面)2.0(中度大中型侵蝕，包括大約26%-50%的兩個(gè)關(guān)節(jié)骨的關(guān)節(jié)面)2.5(中度至嚴(yán)重大約51%-75%關(guān)節(jié)面的侵蝕)3.0(嚴(yán)重大約76%-90%關(guān)節(jié)面的侵蝕)3.5(非常嚴(yán)重100%的關(guān)節(jié)面的侵蝕(關(guān)節(jié)面的完全破壞))關(guān)節(jié)腔狹窄(JSN)評(píng)分。使用9點(diǎn)的評(píng)分等級(jí)從0到4對(duì)每個(gè)手腕和手上的13個(gè)位點(diǎn)(指II-V的近端指間、拇指的指間關(guān)節(jié)和5個(gè)掌指關(guān)節(jié)、作為一個(gè)單元的指III-V的腕掌關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)嚢周(舟骨-頭狀骨(capitate)和月骨(lunate)-頭狀骨結(jié)合)的空間和橈腕關(guān)節(jié))和每只腳上六個(gè)位點(diǎn)(5個(gè)跖趾關(guān)節(jié)和趾I(即，拇趾)的趾間關(guān)節(jié))進(jìn)行評(píng)分0(正常)0.5(微小的關(guān)節(jié)腔狹窄或模糊的結(jié)果)1.0(輕度關(guān)節(jié)腔狹窄(局部的或較小的))1.5(輕度至中度關(guān)節(jié)腔狹窄)2.0(中度關(guān)節(jié)腔狹窄)2.5(中度至重度關(guān)節(jié)腔狹窄)3.0(重度關(guān)節(jié)腔狹窄)3.5(重度關(guān)節(jié)腔狹窄接近關(guān)節(jié)強(qiáng)直)4.0(確定的關(guān)節(jié)強(qiáng)直)手/手腕分別總計(jì)個(gè)體關(guān)節(jié)評(píng)分以建立手和手腕的總的侵蝕評(píng)分和總的JSN評(píng)分。手和手腕最大的總的侵蝕評(píng)分是(14x3.5最大每關(guān)節(jié))x2=98。最大的總的JSN評(píng)分是(13x4最大每關(guān)節(jié))x2=104。為了提供侵蝕和關(guān)節(jié)腔狹窄相等的權(quán)重，每個(gè)總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化到0-100的評(píng)分等級(jí)。如果E-評(píng)分是總的侵蝕評(píng)分和J-評(píng)分是雙手總的JSN評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)分如下計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化E-評(píng)分-(E-評(píng)分/98)xlOO,和標(biāo)準(zhǔn)化^評(píng)分=(J-評(píng)分/104)xlOO。腳對(duì)于手/手腕，分別總計(jì)個(gè)體關(guān)節(jié)評(píng)分以建立腳的總的侵蝕評(píng)分和總的JSN評(píng)分。腳的最大的總的侵蝕評(píng)分是(6x3.5最大每關(guān)節(jié))x2=42。最大的總的JSN評(píng)分是(6x4最大每關(guān)節(jié))"=48。為了提供侵蝕和關(guān)節(jié)腔狹窄相等的權(quán)重，每個(gè)總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化到0-100的評(píng)分等級(jí)。如果E-評(píng)分是總的侵蝕評(píng)分和J-評(píng)分是雙腳總的JSN評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)分如下計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化E-評(píng)分(E-評(píng)分/42)x45，和標(biāo)準(zhǔn)化-評(píng)分=(J-評(píng)分/48)x45。組合手/手腕和腳的總評(píng)分是每個(gè)個(gè)體總分的總和。因此，最大可獲得的評(píng)分是290。4曼蝕評(píng)分=標(biāo)準(zhǔn)化E-評(píng)分手/手腕+標(biāo)準(zhǔn)化E-評(píng)分腳，加JSN評(píng)分=標(biāo)準(zhǔn)化J-評(píng)分手/手腕+標(biāo)準(zhǔn)化J-評(píng)分腳，加總評(píng)分H菱蝕評(píng)分+JSN評(píng)分?？傇u(píng)分中的變化如下計(jì)算侵蝕變化=(隨訪侵蝕評(píng)分)-(最初侵蝕評(píng)分)加JSN變化=(隨訪JSN評(píng)分)-(最初JSN評(píng)分)，加總變化=(隨訪總評(píng)分)-(最初總評(píng)分)。實(shí)施例3具有疾病進(jìn)展的RA和沒(méi)有疾病進(jìn)展的RA中患者的分類(lèi)存在疾病進(jìn)展的分類(lèi)的文獻(xiàn)中討論的某些可能性。除了廣泛用于藥物研究中評(píng)估治療應(yīng)答的ACR和EULAR標(biāo)準(zhǔn)，HAQ評(píng)分和放射學(xué)評(píng)分也可以用于疾病進(jìn)展的分類(lèi)。最優(yōu)選的方法是在一年后使用任何放射學(xué)評(píng)分的變化。我們決定使用總的Sharp-Genant-評(píng)分和測(cè)定在基線值后一年或兩年該評(píng)分的個(gè)體變化(-進(jìn)展率)。進(jìn)展率(1)=從基線到1年Sharp-Genant-評(píng)分(SGS)的變化。進(jìn)展率(2)=從基線到2年Sharp-Genant-評(píng)分(SGS)的變化。接下來(lái)重要的步驟是定義能夠分類(lèi)具有進(jìn)展的RA和沒(méi)有進(jìn)展的RA中的患者的進(jìn)展率的臨界值。因此繪制所有患者的進(jìn)展率1或2的累積概率圖(參見(jiàn)圖1)(vanderHeijde等,ArthritisRhe腿.52(005)49-60)。在圖的第一個(gè)斜面上設(shè)置一條直線，在"5"的進(jìn)展率(1)測(cè)定交叉點(diǎn)。使用進(jìn)展率(2)的概率圖獲得相同的結(jié)果。使用"5"的進(jìn)展率(即，每年SGS中增加超過(guò)5)作為用于將RA患者分類(lèi)為具有或不具有進(jìn)展的患者的臨界值通過(guò)下列兩個(gè)論證支持1.使用"5"的進(jìn)展率(1)作為臨界值，該樣品群體大約20%的RA患者會(huì)分類(lèi)為具有進(jìn)展的RA患者。2.任何用于測(cè)定臨床結(jié)果的評(píng)分方法的值取決于其可信度。存在描述過(guò)的用于測(cè)定"變化的靈敏度"的不同方法(Boini,S.和Guillemin,F.,Ann.Rheum.Dis.60(2001)817-827)。用于個(gè)體患者分類(lèi)的最好的可信度評(píng)分是最小檢測(cè)差異(SDD)。評(píng)價(jià)了用于建立SGS的放射照片的專(zhuān)家已經(jīng)測(cè)定了SGS的5.1的SDD。這是指，大約5的SGS變化是一個(gè)患者在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的最小差異，其可以顯著的區(qū)分。因此使用下列分類(lèi)進(jìn)展率(1)或(2)〉5:具有進(jìn)展性疾病的RA患者進(jìn)展率(1)或(2)S5:沒(méi)有進(jìn)展性疾病的RA患者使用這個(gè)定義，我們完成了下列分類(lèi)具有疾病進(jìn)展的RA患者59個(gè)患者沒(méi)有疾病進(jìn)展的RA患者178個(gè)患者實(shí)施例4測(cè)定的標(biāo)記物表2代表了所用的測(cè)定法并給出了測(cè)試形式以及測(cè)定法的供應(yīng)商。大多數(shù)測(cè)定法是手動(dòng)微孔板(=MTP)形式ELISA。在自動(dòng)Hitachi分析儀上同種測(cè)試形式中測(cè)定RF和CRP。測(cè)定血清樣品中除了CartiLaps外的所有標(biāo)記物濃度，CartiLaps在尿中測(cè)定。通過(guò)肌酐結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化CartiLaps值。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>)實(shí)施例5單變量分析使用表2所列的16種標(biāo)記物測(cè)定所有237個(gè)RA患者的基線樣品。每個(gè)標(biāo)記物值進(jìn)行對(duì)數(shù)化并進(jìn)行ROC分析。表3描繪了AUC值和每個(gè)標(biāo)記物的靈敏度(在90%的特異性下)。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>8種標(biāo)記物獲得70%以及更高的AUC。在90%的特異性下最好的靈敏度顯示37%的CRP。非常令人驚訝的是，作為預(yù)后因子被公開(kāi)的抗-CCP,顯示只有0.59的AUC。在許多科學(xué)論文中具有大約3.0或更高的優(yōu)勢(shì)比的生物標(biāo)記物相當(dāng)樂(lè)觀地稱(chēng)為進(jìn)展預(yù)測(cè)因子。例如，Syve腦，S.W.等(Ann.Rheum.Dis.65,Suppl.II(2006)1IO)報(bào)道了抗-CCP(OR=4.18)、RF-IgM(OR=3.12)、ESR(OR=3.73)和女性性別(OR=3.29)是RA患者中IO年放射學(xué)進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。如果我們計(jì)算在我們的RA群體中抗-CCP的優(yōu)勢(shì)比(Oddsratio)(臨界值〉5U/mL),我們獲得了相似的優(yōu)勢(shì)比，即，4.6的OR。然而"4，，或"5，，的優(yōu)勢(shì)比在需要高的特異性(對(duì)應(yīng)低數(shù)量的假陽(yáng)性結(jié)果)的臨床常規(guī)中沒(méi)有診斷價(jià)值。實(shí)施例6多變量分析由于有限數(shù)量的具有進(jìn)展的RA患者，患者群體隨機(jī)化分為訓(xùn)練組和試驗(yàn)組是不可能的。因此進(jìn)行外部交叉驗(yàn)證(ECV)。對(duì)于ECV，訓(xùn)練組再分50次(比例2(訓(xùn)練亞組):l(試驗(yàn)亞組))對(duì)于外部Monte-Carlo交叉驗(yàn)證(Dudoit,S.和vanderLaan,M.J.，StatisticalMethodology2(2005)131-154)。在訓(xùn)練亞組中制定分類(lèi)算法并在獨(dú)立試驗(yàn)亞組中驗(yàn)證該算法。使用正則化判別分析(RDA)產(chǎn)生分類(lèi)算法，正則化判別分析(RDA)是普通判別分析的一般化，即，二次和一次判別分析(McLachlan，G丄，DiscriminantAnalysisandStatisticalPatternRecognition,WileySeriesinprobabilityandmathematicalstatistics,1992)在RDA中使用通常最大似然(插件)評(píng)估協(xié)方差矩陣的替代法。這些替代法以?xún)蓚€(gè)參數(shù)(x、y)為特征，通過(guò)共同最小化未來(lái)錯(cuò)分類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)的基于樣品的評(píng)估，它們的值專(zhuān)門(mén)用于個(gè)體情況(Friedman,J.H.,J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175)。作為可選的方法，支持向量才幾算法(SupportVectorMachinesalgorithms)(Hastie，T.，等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001)可以使用可比較的分類(lèi)結(jié)果。逐步構(gòu)建標(biāo)記物組，從最好的用于分類(lèi)問(wèn)題的單個(gè)標(biāo)記物開(kāi)始并當(dāng)總分類(lèi)誤差不再顯著變化時(shí)結(jié)束。為了獲得集中分布，使用自然對(duì)數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)化每個(gè)單個(gè)標(biāo)記物。實(shí)施例7用于評(píng)估RA患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物組的鑒定多變量分析的目標(biāo)是尋找顯示比最好的單個(gè)標(biāo)記物更高靈敏度的標(biāo)記物組。特異性極限設(shè)為90%。選擇的第一個(gè)標(biāo)記物是具有35%的靈敏度的CRP,第二個(gè)標(biāo)記物是將靈敏度提高至50%的IL-6。具有不同標(biāo)記物的其他組合作為第三個(gè)和第四個(gè)標(biāo)記物，它們能夠最小化總誤差和/或改善靈敏度(表4)。對(duì)所有這些標(biāo)記物組合，最重要的兩個(gè)標(biāo)記物是CRP和IL-6,從而代表這些標(biāo)記物組中關(guān)4建的標(biāo)記物。本發(fā)明的目的是幫助風(fēng)濕病學(xué)家評(píng)估RA患者是否處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中。已鑒定的標(biāo)記物組的診斷價(jià)值在表4中通過(guò)分類(lèi)的總誤差得到最好的反映。CRP,目前用于炎癥評(píng)估的單個(gè)生物學(xué)標(biāo)記物得到0.228的總誤差。IL作為單個(gè)標(biāo)記物也顯示相似的0.247的總誤差。優(yōu)選的CRP和IL6的組合顯著改善分類(lèi)，減少總誤差至0.203。加入第三或第四標(biāo)記物最終幫助進(jìn)一步最小化錯(cuò)分類(lèi)(總誤差0.196)。獲得的50%的靈敏度表明基于本文公開(kāi)的方法大約一半的具有進(jìn)展性疾病的RA患者可以通過(guò)生化標(biāo)記物測(cè)定在單一時(shí)間點(diǎn)被正確地鑒定，即在基線，但到目前為止還不可能。期望這種分類(lèi)幫助風(fēng)濕病學(xué)家的決策過(guò)程，例如4吏用DMARD開(kāi)始治療或^_用不同DMARD的組合變?yōu)楦玫闹委煼桨浮１?分類(lèi)為具有疾病進(jìn)展的RA對(duì)沒(méi)有疾病進(jìn)展的RA的患者的分類(lèi)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4中標(biāo)記物CRP和IL-6以及標(biāo)記物組合(CRPIL-6和CRP+IL-6+pro-MMP3)的箱線圓分別如圖2-5所示。權(quán)利要求1.幫助評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括以下步驟a)獲得液體樣品，b)測(cè)定所述樣品中C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6以及任選的一種或多種其它標(biāo)記物的濃度，和c)將步驟(b)中測(cè)定的濃度與疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中當(dāng)實(shí)施評(píng)估時(shí)，RA患者處于選自緩解疾病的抗類(lèi)風(fēng)濕性藥物(DMARD)的抗風(fēng)濕藥物的治療中。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中任選的一種或多種其他標(biāo)記物選自骨或軟骨標(biāo)記物、滑液標(biāo)記物、其他炎癥標(biāo)記物、遺傳標(biāo)記物和放射學(xué)評(píng)分。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中一種或多種骨或軟骨標(biāo)記物選自PINP、卩-C聽(tīng)Laps、CartiLaps、骨鈣素和ICTP。5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中一種或多種滑液標(biāo)記物選自透明質(zhì)酸和pro-MMP3。6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中一種或多種遺傳標(biāo)記物選自HLA-DR4和HLA-DRB1等位基因。7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中一種或多種放射學(xué)評(píng)分選自Sharp-評(píng)分、Sharp-Genant-評(píng)分、vanderHeijde-Sharp-評(píng)分、Ratingen評(píng)分、Larsen-評(píng)分和RAU-評(píng)分。8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中一種或多種其他炎癥標(biāo)記物選自SAA和E-選擇素。9.包含至少CRP和白介素-6的標(biāo)記物組在評(píng)價(jià)患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中的用途。10.用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1的方法的試劑盒，所述試劑盒包含分別特異性測(cè)定CRP和白介素-6所需的試劑，以及任選的用于實(shí)施測(cè)定的輔助試劑。11.用于評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的蛋白陣列裝置，所述蛋白陣列裝置包含至少用于CRP和白介素-6測(cè)定的合適的特異性結(jié)合配偶體和任選的一種或多種其他標(biāo)記物的合適的特異性結(jié)合配偶體。全文摘要本發(fā)明涉及幫助進(jìn)一步評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的體外方法。該方法特別用于評(píng)估RA患者是否處于疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)中。該方法例如通過(guò)分析生化標(biāo)記物實(shí)施，包括測(cè)定樣品中至少C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素-6的濃度并將測(cè)定的濃度與RA潛在的快速進(jìn)展形式的可能性相關(guān)聯(lián)。處于快速進(jìn)展疾病的高風(fēng)險(xiǎn)中的患者可以是需要治療或者如果已經(jīng)治療還需要不同的和更有效治療的患者。本發(fā)明還涉及包含C-反應(yīng)蛋白和白介素的標(biāo)記物組在評(píng)估患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中的用途，以及教導(dǎo)了分別用于實(shí)施本發(fā)明方法的蛋白陣列裝置和試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/68GK101523218SQ200780036552公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2007年9月25日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者J·卡爾,N·威爾德,V·格魯納特,W·羅林杰申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司