專利名稱：抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽及其在制藥中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類多肽及其制藥應用，尤其涉及一類抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽及其在制藥中的應用。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白家族定位在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)功能。PDI對細胞異常分化，毛細血管增生及抗氧化損傷起著重要作用[1]。硫氧還蛋白5(thiredoxin domain containing 5，TXNDC5)位于人6號染色體上(6p24. ；3)，其編碼的二硫化物異構(gòu)酶含有PDI結(jié)構(gòu)，在缺氧的狀況下高表達，催化蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)過程[1]。有人用蛋白質(zhì)組學方法發(fā)現(xiàn)TXNDC5在肝細胞癌，結(jié)直腸癌等腫瘤組織表達，在組織低氧的環(huán)境下對內(nèi)皮細胞起到保護的作用[2]。類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自我免疫疾病，臨床表現(xiàn)為慢性、多滑膜關(guān)節(jié)炎。RA病理學表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜嚴重炎癥，組織增厚，滑膜內(nèi)T細胞大量滲入，B細胞和滑膜纖維狀細胞異常增生，毛細血管大量生成，解剖學上稱之為血管翳。本發(fā)明人利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較RA、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和強直性脊柱炎 (ankylosing spondilitis, AS)病變滑膜組織的蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)TXNDC5在RA的滑膜組織中顯著性高表達。免疫組化、western blotting和定量PCR方法在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上均證實了 TXNDC5在RA關(guān)節(jié)滑膜組織細胞中的特異性高表達。此外，本發(fā)明人用酶聯(lián)免疫分析方(ELISA)發(fā)現(xiàn)，與OA、AS患者相比，53. 3% RA患者的血液和73. 3% RA患者的關(guān)節(jié)滑液中TXNDC5的表達量增加兩倍或兩倍以上[3]，顯示TXNDC5可能與RA發(fā)病過程有關(guān)?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人就TXNDC5對RA的致病機制進行了研究。許多研究證明， RA病變關(guān)節(jié)為低氧環(huán)境，RA本質(zhì)上具有低氧特性[4]，并表現(xiàn)出氧化應激反應[5、6]。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，RA低氧條件下誘導滑膜TXNDC5高表達。高濃度的TXNDC5可以上調(diào)RA滑膜血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達，VEGF刺激滑膜組織毛細血管增生，形成血管翳。血管翳是RA滑膜病變的重要組織學特征。正是由于血管翳的生成，T細胞得以向滑膜組織大量滲入造成炎癥，同時，病變組織獲得充足的營養(yǎng)支持B細胞和纖維狀細胞大量增殖。鑒于此，TXNDC5 可成為潛在的RA治療靶點。通過抑制TXNDC5酶活性，可抑制RA滑膜組織毛細血管生成， 從而阻斷病變滑膜細胞增生的營養(yǎng)途徑和T細胞轉(zhuǎn)移途徑，達到殺傷RA滑膜細胞和抑制炎癥過程的治療RA目的。參考文獻1. Sullivan DC, Huminiecki L, Moore Jff, et al. EndoPDI, a novel protein-disulfide isomerase-Like protein that is preferentially expressed in endothelial cells acts as a stress survival factor. J Biol Chem,2003,278 47079-47088.2. Wang Y, Ma Y, LiiB, et al. Differential expression of mimecan and thioredoxin domain-containing protein 5 in colorectal adenoma and cancer :a proteomic study. Exp Biol Med(Maywood), 2007, 232 :1152-9.3. Chang X, Cui Y,Zong M,et al. Identification of proteins with increased expression in rheumatoid arthritis synovial tissues. J Rheumatol,2009,36 872-880.4Distler JH, Wenger RH, Gassmann M, et al. Physiologic Responses to Hypoxia and Implications for Hypoxia-Inducible Factors in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum,2004, 50 :10-23.5. Tak PP, Zvaifler NJ, Green DR, et al. Rheumatoid arthritis and p53 :how oxidative stress might alter the course of inflammatory diseases. Immunol Today, 2000,21 :78-82.6.Hitchon CA, El-Gabalawy HS. Oxidation in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther，2004，6 :265-78.

發(fā)明內(nèi)容
基于上述TXNDC5在RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵作用，本發(fā)明的目的是提供一類抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽及其在制藥中的應用。本發(fā)明所述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽，其特征在于它是SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列；具體序列描述為Arg Thr Glu Thr Gly Ala Thr Glu Thr Val Thr Pro Ser Glu1510。上述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽的合成方法為常規(guī)人工合成方法。根據(jù)免疫抑制的原理，對應TXNDC5不同區(qū)段的短肽，申請人設(shè)計了 9段TXNDC5多肽(即SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 9所示的氨基酸序列)，按常規(guī)人工合成方法對9種多肽實施了合成，SEQ IDN0. 3所示的氨基酸序列的多肽即是其中的之一。上述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管翳生成藥物中的應用。進一步的，上述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜毛細血管增生、阻斷滑膜細胞增殖的營養(yǎng)途徑和T細胞滲入途徑等抗類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應用。上述的抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備硫氧還蛋白5(TXNDC5)多克隆抗體或單克隆抗體中的應用。本發(fā)明研究思路是采用免疫治療的途徑，人為刺激RA患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗 TXNDC5抗體，利用抗原、抗體特異性結(jié)合原理，用抗TXNDC5抗體結(jié)合高表達的TXNDC5，從而抑制該酶活性，阻斷毛細血管形成，達到治療RA病程的目的。目前，已有的幾個RA有效的生物制劑，如益塞譜^tanerapt)、類克等，皆是用RA炎癥相關(guān)因子TNF (腫瘤壞死因子) 的抗體，通過向患者體內(nèi)注射抗TNF抗體，結(jié)合RA高表達的TNF，抑制TNF的生物活性，阻斷 RA炎癥發(fā)展，獲得RA治療效果。本研究也按此RA治療思路，首先以RA實驗動物為模型，通過免疫干預治療的方式，通過抑制TXNDC5生物功能，達到治療RA目的。基本實施過程如下應用本發(fā)明所述按常規(guī)制備的TXNDC5各區(qū)段的9種短肽(即 SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列)，分別將其注入大白鼠體內(nèi)，使動物產(chǎn)生抗TXNDC5抗體。然后，按常用的RA關(guān)節(jié)炎動物模型建立方法，向動物體內(nèi)注射II型膠原誘導動物表現(xiàn)RA臨床癥狀(向大鼠注射膠原誘導動物全身性關(guān)節(jié)炎癥是RA病理研究和藥物篩選最常用的動物模型)。與對照組相比，觀察注射了 TXNDC5短肽注射后的實驗動物是否表現(xiàn)RA關(guān)節(jié)炎癥。如果動物未出現(xiàn)RA癥狀，則說明注射后的動物體內(nèi)抗TXNDC5抗體和 TXNDC5抗原特異性結(jié)合，通過抑制該酶的PDI催化功能有效地阻止了 TXNDC5下游病理途經(jīng)，阻斷了 TXNDC5對毛細血管生成的刺激作用，從而達到RA治療目的。實驗結(jié)果表明抗TXNDC5抗體水平在注射了 TXNDC5短肽后明顯升高，顯示 TXNDC5抗體和其抗原在大鼠體內(nèi)發(fā)生特異性結(jié)合，可以對TXNDC5酶活性形成免疫抑制。在膠原誘導RA之前注射了 TXNDC5短肽的動物不再表現(xiàn)RA臨床癥狀和組織學特征，說明對 TXNDC5的免疫抑制可以有效地抑制RA的病理進程。對照組包括α頭發(fā)角蛋白短肽或BSA 替代TXNDC5短肽后，RA現(xiàn)象未受到抑制，證實TXNDC5短肽對RA抑制結(jié)果不是免疫耐受不造成的。TXNDC5短肽注射后用BSA免疫的大鼠未表現(xiàn)RA，這意味著TXNDC5短肽和多肽本身并沒有對RA影響。在實驗中，TXNDC5短肽分別對應該酶的C-末端，鈣離子結(jié)合區(qū)、PDI活性部位等部位，因此，其產(chǎn)生的抗體可以通過免疫結(jié)合有效地抑制TXNDC5酶的生理功能。本發(fā)明的意義和潛在用途現(xiàn)在治療RA的生物制劑主要是益賽普和英夫利昔，均為腫瘤壞死因子TNF的單克隆抗體，90年代的開始在國外使用，2005年起在中國使用，收到了良好治療效果。該制劑主要通過抑制炎癥而抑制發(fā)病進程。目前開始使用的另一生物制劑是利妥昔(Rituximab)，是針對B細胞的單抗，通過殺死大量增殖的B細胞，抑制RA的自我免疫反應。以上這些生物制劑均針對RA大量增生的滑膜細胞或炎癥因子，無一針對另一 RA重要病理特征-血管翳生成。而且，中國治療RA的藥物無論生物制劑與否均無知識產(chǎn)權(quán)。本發(fā)明的試驗結(jié)果顯示，以TXNDC5短肽序列所制備的多肽藥物或抗體藥物，可以通過免疫抑制TXNDC5活性，直接抑制RA的血管翳生成。通過切斷滑膜細胞大量增殖所需的營養(yǎng)渠道和T細胞侵入途徑，從根本上達到治療RA的目的。RA病變關(guān)節(jié)組織的本質(zhì)是低氧， 低氧環(huán)境誘導病變進程。抑制低氧所誘導的TXNDC5的生物活性，是從整體上治療RA的重要途徑。


圖1實驗動物RA出現(xiàn)時間圖。圖2實驗動物出現(xiàn)炎癥時間(炎癥指數(shù))圖。圖3血中抗TXNDC5抗體水平圖。圖4血中VEGF水平圖。圖5動物的關(guān)節(jié)滑膜免疫組織化學的切片照片。
具體實施例方式實施例1根據(jù)免疫抑制的原理，對應TXNDC5不同區(qū)段的短肽，申請人設(shè)計了 9段TXNDC5多肽。
〔0031〕它是3即10而.1所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0032〕八617 61736『6111 ！118 861’ 61^ 61^ 八『8
〔0033〕1510；或
〔0034〕它是3即10而.2所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0035〕八I”經(jīng)八61^八611161^ 八『8
〔0036〕1510；或
〔0037〕它是3即10而.3所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0038〕八1111- 6111 1111- 617 八 1& 1111” 6111 1111” 1111” ？1-0 861’ 6111
〔0039〕1510；或
〔0040〕它是3即10而.4所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0041〕？1-0 1111- ？1-0 6111 ？『0 6111 6111 ？『0 ？『0 361”八 1& ？『0
〔0042〕1510；或
〔0043〕它是3即10而.5所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0044〕1111- 八811 八1611 61^ 八1^8 了八811 361”姑6七 6111 八
〔0045〕1510；或
〔0046〕它是3即10而.6所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0047〕1^8 ？1-0 617 6111 6111 八 1& 1^8 了6111 61^ ？^^ ^
〔0048〕1510；或
〔0049〕它是3即10而.7所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0050〕？1-0 ？1-0 八 1& 八 1& 八617 6111 八617 6111 八？1-0 ！118 361”
〔0051〕1510；或
〔0052〕它是3即10而.8所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0053〕1111” 1611 八 1& ？1-0 1111” 了！^) 6111 6111 1611 361”6111 ？116
〔0054〕1510；或
〔0055〕它是3即10而.9所示的氨基酸序列；具體序列描述為
〔0056〕361” 1611 ！118 361” ？116 ^3,1 1611 八『經(jīng) 6111 八 1& 八6111 1611
〔0057〕1510。
〔0058〕按常規(guī)人工合成方法對上述9種多肽實施合成，備用。
〔0059〕實施例2
〔0060〕本發(fā)明所述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽的藥物用途
^0061實驗方法
^0062雄性[冊化大鼠60只，平均體重120克，8周齡。
〔0063〕按常規(guī)人工合成的IX冊〔5各區(qū)段的9種短肽〈即3即10吣.1 3即10吣.9 所示的氨基酸序列〉。
〔0064〕通過尾靜脈向每只大鼠分別注射100微克的3即10而.1 3即10而.9所示氨 基酸序列的短肽。短肽分別與載體蛋白匙孔血藍蛋白(皿！!)偶聯(lián)。該氨基酸序列為IX冊⑶ 人完全匹配氨基酸序列。人與鼠的IX冊⑶氨基酸序列幾乎完全一致。以上短肽與同等體 積濃度的弗氏佐劑巧呢/!!^)充分混合，在第1、14和28天對實驗動物免疫注射，按常規(guī)方法使之產(chǎn)生抗TXNDC5抗體。然后，在第一次注射后的第42，56和70天，向這些動物注射牛 II型膠原(Sigma公司)，按常規(guī)建立RA動物模型方法誘導動物表現(xiàn)RA。每日檢查大鼠的肢體發(fā)紅、腫脹和僵硬程度。RA炎癥程度按研究通常所用的12分評分標準評判，評分標準如下0 正常，無腫脹/發(fā)紅，1 輕度發(fā)紅，2 變紅和整個足腫脹；3 強炎癥和足嚴重變形。 每只鼠四肢RA程度最大累計12分。同時，在第0，35，77和102天采集動物血液樣本，用常規(guī)ELISA方法測定血中抗TXNDC5抗體和血管內(nèi)皮生長因子VEGF水平。VEGF代表組織毛細血管發(fā)育程度。VEGF水平用大鼠VEGF ELISA試劑盒anvitrogen公司)完成。大鼠在第一次注射后的第102天處死。解剖出來的滑膜組織用常規(guī)免疫組織化方法檢查組織病變程度和TXNDC5表達狀況。實驗同時設(shè)置一系列對照組，每組大鼠為60只，具體組別如下(1)，α頭發(fā)角蛋白短肽(AAVGSRPIHCGVRFC肽)替代TXNDC5短肽；⑵牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)的取代II型膠原蛋白誘導；(3)BSA代替TXNDC5短肽和II型膠原誘導；(4)只注射II膠原誘導；( 只用BSA免疫動物，取代短肽和膠原免疫注射；(6)未注射任何短肽和蛋白質(zhì)。實驗結(jié)果實驗組大鼠在免疫TXNDC5短肽后按常規(guī)用膠原誘導RA。實驗結(jié)果以SEQ ID NO. 9 短肽為例闡述如下以在第一次注射膠原蛋白后第50天(即第一次注射后第92天)，60只大鼠(97%)中的58只沒有表現(xiàn)任何炎癥和四肢關(guān)節(jié)僵硬。只有兩只在第一次注射膠原后第56天肢體出現(xiàn)輕微發(fā)炎(炎癥評分=；3)。用α頭發(fā)角蛋白短肽替代TXNDC5短肽注射的大鼠中，陽只大鼠(92%)在膠原誘導后第34. 5士3. 6關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹。在用BSA 替代TXNDC5短肽的大鼠中，50只(83% )大鼠在第一次注射膠原蛋白的第39. 7士4. 3天， 關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯炎癥。所有60只(100% )用BSA替代TXNDC5短肽、多肽和膠原的大鼠均不表現(xiàn)RA的臨床表現(xiàn)。56只(93%，其中4只在實驗期間死亡)大鼠在單獨注射膠原后第 37. 3士2. 1天顯示關(guān)節(jié)炎癥。注射TXNDC5短肽，然后注射BSA替代II型膠原的60只大鼠 (100%)均沒有表現(xiàn)RA癥狀。沒有任何注射的大鼠也均沒有顯示任何關(guān)節(jié)發(fā)炎癥狀。實驗動物RA出現(xiàn)時間和炎癥程度見圖1，圖2和表1。表1 :RA出現(xiàn)狀況和TXNDC5表達狀況
權(quán)利要求
1.一種抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽，其特征在于它是SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列； 具體序列描述為Arg Thr Glu Thr Gly Ala Thr Glu Thr Val Thr Pro Ser Glu 1510ο
2.權(quán)利要求1所述的抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管翳生成藥物或硫氧還蛋白5抗體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO.3所示。應用本發(fā)明的多肽注射大鼠，然后人工誘導動物關(guān)節(jié)炎癥。結(jié)果表明，被注射多肽的大鼠內(nèi)產(chǎn)生了相應抗體，血管內(nèi)皮生長因子濃度同時相應降低，90％以上的大鼠注射II型膠原后不再出現(xiàn)類風濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。組織病理學分析表明，實驗動物病變關(guān)節(jié)內(nèi)的血管增生明顯減少，VEGF水平降低。表明本發(fā)明的多肽可以通過免疫干預方式抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜毛細血管增生，阻斷滑膜細胞增殖的營養(yǎng)途徑和T細胞滲入途徑，抑制組織炎癥和組織損傷，從而抑制類風濕關(guān)節(jié)炎過程病變進程，并能開發(fā)為抗類風濕關(guān)節(jié)炎藥物。
文檔編號C07K7/08GK102229656SQ20111015908
公開日2011年11月2日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者常曉天, 韓金祥 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心