專利名稱：抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類多肽及其制藥應(yīng)用，尤其涉及一類抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽及其在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白家族定位在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)功能。PDI對細胞異常分化，毛細血管增生及抗氧化損傷起著重要作用[1]。硫氧還蛋白5(thiredoxin domain containing 5，TXNDC5)位于人6號染色體上(6p24. ；3)，其編碼的二硫化物異構(gòu)酶含有PDI結(jié)構(gòu)，在缺氧的狀況下高表達，催化蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)過程[1]。有人用蛋白質(zhì)組學方法發(fā)現(xiàn)TXNDC5在肝細胞癌，結(jié)直腸癌等腫瘤組織表達，在組織低氧的環(huán)境下對內(nèi)皮細胞起到保護的作用[2]。類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自我免疫疾病，臨床表現(xiàn)為慢性、多滑膜關(guān)節(jié)炎。RA病理學表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜嚴重炎癥，組織增厚，滑膜內(nèi)T細胞大量滲入，B細胞和滑膜纖維狀細胞異常增生，毛細血管大量生成，解剖學上稱之為血管翳。本發(fā)明人利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較RA、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和強直性脊柱炎 (ankylosing spondilitis, AS)病變滑膜組織的蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)TXNDC5在RA的滑膜組織中顯著性高表達。免疫組化、western blotting和定量PCR方法在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上均證實了 TXNDC5在RA關(guān)節(jié)滑膜組織細胞中的特異性高表達。此外，本發(fā)明人用酶聯(lián)免疫分析方(ELISA)發(fā)現(xiàn)，與OA、AS患者相比，53. 3% RA患者的血液和73. 3% RA患者的關(guān)節(jié)滑液中TXNDC5的表達量增加兩倍或兩倍以上[3]，顯示TXNDC5可能與RA發(fā)病過程有關(guān)。基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人就TXNDC5對RA的致病機制進行了研究。許多研究證明， RA病變關(guān)節(jié)為低氧環(huán)境，RA本質(zhì)上具有低氧特性[4]，并表現(xiàn)出氧化應(yīng)激反應(yīng)[5、6]。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，RA低氧條件下誘導(dǎo)滑膜TXNDC5高表達。高濃度的TXNDC5可以上調(diào)RA滑膜血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達，VEGF刺激滑膜組織毛細血管增生，形成血管翳。血管翳是RA滑膜病變的重要組織學特征。正是由于血管翳的生成，T細胞得以向滑膜組織大量滲入造成炎癥，同時，病變組織獲得充足的營養(yǎng)支持B細胞和纖維狀細胞大量增殖。鑒于此，TXNDC5 可成為潛在的RA治療靶點。通過抑制TXNDC5酶活性，可抑制RA滑膜組織毛細血管生成， 從而阻斷病變滑膜細胞增生的營養(yǎng)途徑和T細胞轉(zhuǎn)移途徑，達到殺傷RA滑膜細胞和抑制炎癥過程的治療RA目的。參考文獻1. Sullivan DC, Huminiecki L, Moore Jff, et al. EndoPDI, a novel protein-disulfide isomerase-Like protein that is preferentially expressed in endothelial cells acts as a stress survival factor. J Biol Chem,2003,278 47079-47088.2. Wang Y, Ma Y, LiiB, et al. Differential expression of mimecan and thioredoxin domain-containing protein 5 in colorectal adenoma and cancer :a proteomic study. Exp Biol Med(Maywood), 2007, 232 :1152-9.3. Chang X, Cui Y,Zong M,et al. Identification of proteins with increased expression in rheumatoid arthritis synovial tissues. J Rheumatol,2009,36 872-880.4Distler JH, Wenger RH, Gassmann M, et al. Physiologic Responses to Hypoxia and Implications for Hypoxia-Inducible Factors in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum,2004, 50 :10-23.5. Tak PP, Zvaifler NJ, Green DR, et al. Rheumatoid arthritis and p53 :how oxidative stress might alter the course of inflammatory diseases. Immunol Today, 2000,21 :78-82.6.Hitchon CA, El-Gabalawy HS. Oxidation in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther，2004，6 :265-78.

發(fā)明內(nèi)容
基于上述TXNDC5在RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵作用，本發(fā)明的目的是提供一類抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽及其在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明所述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽，其特征在于它是SEQ ID N0. 7所示的氨基酸序列；具體序列描述為Pro Pro Ala Ala Asp Gly Glu Asp Gly Gln Asp Pro His Ser1510。上述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽的合成方法為常規(guī)人工合成方法。根據(jù)免疫抑制的原理，對應(yīng)TXNDC5不同區(qū)段的短肽，申請人設(shè)計了 9段TXNDC5多肽(即SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 9所示的氨基酸序列)，按常規(guī)人工合成方法對9種多肽實施了合成，SEQ IDN0. 7所示的氨基酸序列的多肽即是其中的之一。上述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管翳生成藥物中的應(yīng)用。進一步的，上述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜毛細血管增生、阻斷滑膜細胞增殖的營養(yǎng)途徑和T細胞滲入途徑等抗類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。上述的抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備硫氧還蛋白5(TXNDC5)多克隆抗體或單克隆抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明研究思路是采用免疫治療的途徑，人為刺激RA患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗 TXNDC5抗體，利用抗原、抗體特異性結(jié)合原理，用抗TXNDC5抗體結(jié)合高表達的TXNDC5，從而抑制該酶活性，阻斷毛細血管形成，達到治療RA病程的目的。目前，已有的幾個RA有效的生物制劑，如益塞譜^tanerapt)、類克等，皆是用RA炎癥相關(guān)因子TNF (腫瘤壞死因子) 的抗體，通過向患者體內(nèi)注射抗TNF抗體，結(jié)合RA高表達的TNF，抑制TNF的生物活性，阻斷 RA炎癥發(fā)展，獲得RA治療效果。本研究也按此RA治療思路，首先以RA實驗動物為模型，通過免疫干預(yù)治療的方式，通過抑制TXNDC5生物功能，達到治療RA目的?；緦嵤┻^程如下應(yīng)用本發(fā)明所述按常規(guī)制備的TXNDC5各區(qū)段的9種短肽(即 SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列)，分別將其注入大白鼠體內(nèi)，使動物產(chǎn)生抗TXNDC5抗體。然后，按常用的RA關(guān)節(jié)炎動物模型建立方法，向動物體內(nèi)注射II型膠原誘導(dǎo)動物表現(xiàn)RA臨床癥狀(向大鼠注射膠原誘導(dǎo)動物全身性關(guān)節(jié)炎癥是RA病理研究和藥物篩選最常用的動物模型)。與對照組相比，觀察注射了 TXNDC5短肽注射后的實驗動物是否表現(xiàn)RA關(guān)節(jié)炎癥。如果動物未出現(xiàn)RA癥狀，則說明注射后的動物體內(nèi)抗TXNDC5抗體和 TXNDC5抗原特異性結(jié)合，通過抑制該酶的PDI催化功能有效地阻止了 TXNDC5下游病理途經(jīng)，阻斷了 TXNDC5對毛細血管生成的刺激作用，從而達到RA治療目的。實驗結(jié)果表明抗TXNDC5抗體水平在注射了 TXNDC5短肽后明顯升高，顯示 TXNDC5抗體和其抗原在大鼠體內(nèi)發(fā)生特異性結(jié)合，可以對TXNDC5酶活性形成免疫抑制。在膠原誘導(dǎo)RA之前注射了 TXNDC5短肽的動物不再表現(xiàn)RA臨床癥狀和組織學特征，說明對 TXNDC5的免疫抑制可以有效地抑制RA的病理進程。對照組包括α頭發(fā)角蛋白短肽或BSA 替代TXNDC5短肽后，RA現(xiàn)象未受到抑制，證實TXNDC5短肽對RA抑制結(jié)果不是免疫耐受不造成的。TXNDC5短肽注射后用BSA免疫的大鼠未表現(xiàn)RA，這意味著TXNDC5短肽和多肽本身并沒有對RA影響。在實驗中，TXNDC5短肽分別對應(yīng)該酶的C-末端，鈣離子結(jié)合區(qū)、PDI活性部位等部位，因此，其產(chǎn)生的抗體可以通過免疫結(jié)合有效地抑制TXNDC5酶的生理功能。本發(fā)明的意義和潛在用途現(xiàn)在治療RA的生物制劑主要是益賽普和英夫利昔，均為腫瘤壞死因子TNF的單克隆抗體，90年代的開始在國外使用，2005年起在中國使用，收到了良好治療效果。該制劑主要通過抑制炎癥而抑制發(fā)病進程。目前開始使用的另一生物制劑是利妥昔(Rituximab)，是針對B細胞的單抗，通過殺死大量增殖的B細胞，抑制RA的自我免疫反應(yīng)。以上這些生物制劑均針對RA大量增生的滑膜細胞或炎癥因子，無一針對另一 RA重要病理特征-血管翳生成。而且，中國治療RA的藥物無論生物制劑與否均無知識產(chǎn)權(quán)。本發(fā)明的試驗結(jié)果顯示，以TXNDC5短肽序列所制備的多肽藥物或抗體藥物，可以通過免疫抑制TXNDC5活性，直接抑制RA的血管翳生成。通過切斷滑膜細胞大量增殖所需的營養(yǎng)渠道和T細胞侵入途徑，從根本上達到治療RA的目的。RA病變關(guān)節(jié)組織的本質(zhì)是低氧， 低氧環(huán)境誘導(dǎo)病變進程。抑制低氧所誘導(dǎo)的TXNDC5的生物活性，是從整體上治療RA的重要途徑。


圖1實驗動物RA出現(xiàn)時間圖。圖2實驗動物出現(xiàn)炎癥時間(炎癥指數(shù))圖。圖3血中抗TXNDC5抗體水平圖。圖4血中VEGF水平圖。圖5動物的關(guān)節(jié)滑膜免疫組織化學的切片照片。
具體實施例方式實施例1根據(jù)免疫抑制的原理，對應(yīng)TXNDC5不同區(qū)段的短肽，申請人設(shè)計了 9段TXNDC5多
5肽。


它是SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Arg Gly Gly Lys Lys Val Ser Glu His Ser Gly Gly Arg Asp 1510
它是SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Arg Asp Gly Lys Lys Val Asp Gln Tyr Lys Gly Lys Arg Asp 1510
它是SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Arg Thr Glu Thr Gly Ala Thr Glu Thr Val Thr Pro Ser Glu 1510
它是SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Pro Val Thr Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Pro Ser Ala Pro 1510
它是SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Thr Trp Asn Asp Leu Gly Asp Lys Tyr Asn Ser Met Glu Asp 1510
它是SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Lys Pro Gly Gln Glu Ala Val Lys Tyr Gln Gly Pro Arg Asp 1510
它是SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Pro Pro Ala Ala Asp Gly Glu Asp Gly Gln Asp Pro His Ser 1510
它是SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Thr Leu Ala Pro Thr Trp Glu Glu Leu Ser Lys Lys Glu Phe 1510
它是SEQ ID N0. 9所示的氨基酸序列；具體序列描述為 Ser Leu His Ser Phe Val Leu Arg Gln Ala Lys Asp Glu Leu 1510
按常規(guī)人工合成方法對上述9種多肽實施合成，備用。 實施例2
本發(fā)明所述抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽的藥物用途實驗方法
雄性Lewis大鼠60只，平均體重120克，8周齡。 按常規(guī)人工合成的TXNDC5各區(qū)段的9種短肽(即SEQ ID NO. 1 所示的氨基酸序列)。 通過尾靜脈向每只大鼠分別注射100微克的SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 9所示氨基酸序列的短肽。短肽分別與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)。該氨基酸序列為TXNDC5 人完全匹配氨基酸序列。人與鼠的TXNDC5氨基酸序列幾乎完全一致。以上短肽與同等體積濃度的弗氏佐劑(5ug/ml)充分混合，在第1、14和28天對實驗動物免疫注射，按常規(guī)方
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SEQ ID NO. 9法使之產(chǎn)生抗TXNDC5抗體。然后，在第一次注射后的第42，56和70天，向這些動物注射牛 II型膠原(Sigma公司)，按常規(guī)建立RA動物模型方法誘導(dǎo)動物表現(xiàn)RA。每日檢查大鼠的肢體發(fā)紅、腫脹和僵硬程度。RA炎癥程度按研究通常所用的12分評分標準評判，評分標準如下0 正常，無腫脹/發(fā)紅，1 輕度發(fā)紅，2 變紅和整個足腫脹；3 強炎癥和足嚴重變形。 每只鼠四肢RA程度最大累計12分。同時，在第0，35，77和102天采集動物血液樣本，用常規(guī)ELISA方法測定血中抗TXNDC5抗體和血管內(nèi)皮生長因子VEGF水平。VEGF代表組織毛細血管發(fā)育程度。VEGF水平用大鼠VEGF ELISA試劑盒anvitrogen公司)完成。大鼠在第一次注射后的第102天處死。解剖出來的滑膜組織用常規(guī)免疫組織化方法檢查組織病變程度和TXNDC5表達狀況。實驗同時設(shè)置一系列對照組，每組大鼠為60只，具體組別如下(1)，α頭發(fā)角蛋白短肽(AAVGSRPIHCGVRFC肽)替代TXNDC5短肽；⑵牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)的取代II型膠原蛋白誘導(dǎo)；(3)BSA代替TXNDC5短肽和II型膠原誘導(dǎo)；(4)只注射II膠原誘導(dǎo)；( 只用BSA免疫動物，取代短肽和膠原免疫注射；(6)未注射任何短肽和蛋白質(zhì)。實驗結(jié)果實驗組大鼠在免疫TXNDC5短肽后按常規(guī)用膠原誘導(dǎo)RA。實驗結(jié)果以SEQ ID NO. 9 短肽為例闡述如下以在第一次注射膠原蛋白后第50天(即第一次注射后第92天)，60只大鼠(97%)中的58只沒有表現(xiàn)任何炎癥和四肢關(guān)節(jié)僵硬。只有兩只在第一次注射膠原后第56天肢體出現(xiàn)輕微發(fā)炎(炎癥評分=；3)。用α頭發(fā)角蛋白短肽替代TXNDC5短肽注射的大鼠中，陽只大鼠(92%)在膠原誘導(dǎo)后第34. 5士3. 6關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹。在用BSA 替代TXNDC5短肽的大鼠中，50只(83% )大鼠在第一次注射膠原蛋白的第39. 7士4. 3天， 關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯炎癥。所有60只(100% )用BSA替代TXNDC5短肽、多肽和膠原的大鼠均不表現(xiàn)RA的臨床表現(xiàn)。56只(93%，其中4只在實驗期間死亡)大鼠在單獨注射膠原后第 37. 3士2. 1天顯示關(guān)節(jié)炎癥。注射TXNDC5短肽，然后注射BSA替代II型膠原的60只大鼠 (100%)均沒有表現(xiàn)RA癥狀。沒有任何注射的大鼠也均沒有顯示任何關(guān)節(jié)發(fā)炎癥狀。實驗動物RA出現(xiàn)時間和炎癥程度見圖1，圖2和表1。表1 :RA出現(xiàn)狀況和TXNDC5表達狀況
權(quán)利要求
1.一種抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽，其特征在于它是SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列； 具體序列描述為Pro Pro Ala Ala Asp Gly Glu Asp Gly Gln Asp Pro His Ser 1510ο
2.權(quán)利要求1所述的抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽在制備抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管翳生成藥物或硫氧還蛋白5抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO.7所示。應(yīng)用本發(fā)明的多肽注射大鼠，然后人工誘導(dǎo)動物關(guān)節(jié)炎癥。結(jié)果表明，被注射多肽的大鼠內(nèi)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體，血管內(nèi)皮生長因子濃度同時相應(yīng)降低，90％以上的大鼠注射II型膠原后不再出現(xiàn)類風濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。組織病理學分析表明，實驗動物病變關(guān)節(jié)內(nèi)的血管增生明顯減少，VEGF水平降低。表明本發(fā)明的多肽可以通過免疫干預(yù)方式抑制類風濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜毛細血管增生，阻斷滑膜細胞增殖的營養(yǎng)途徑和T細胞滲入途徑，抑制組織炎癥和組織損傷，從而抑制類風濕關(guān)節(jié)炎過程病變進程，并能開發(fā)為抗類風濕關(guān)節(jié)炎藥物。
文檔編號C07K7/08GK102250214SQ20111015907
公開日2011年11月23日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者常曉天, 韓金祥 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心