一種用MwoI鑒定人乳腺癌BRCA2基因rs15869多態(tài)性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用MwoI鑒定人乳腺癌BRCA2基因rs15869多態(tài)性的方法，是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的DNA片段，然后將待檢測(cè)的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切，限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再由限制酶圖譜分析此段序列的特異酶切位點(diǎn)，藉由片段的多樣性來(lái)比對(duì)不同來(lái)源基因序列的差異性。簡(jiǎn)而言之，就是先PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的片斷，而后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，電泳后觀察比較限制性圖譜來(lái)分析序列之間的差異。此方法重復(fù)性好，操作較簡(jiǎn)單，成本低，酶切結(jié)果容易辨識(shí)。本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低、適用范圍廣泛的檢測(cè)人乳腺癌易感基因BRCA2多態(tài)性rs15869的方法及檢測(cè)試劑盒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
_種用Mwo丨鑒定人乳腺癌BRCA2基因 rs15869多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用Mwol鑒定人乳腺癌BRCA2基因 rsl5869多態(tài) 性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一 種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每500~1000個(gè)堿基 對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。CAPs ( c 1 eaved ampl ification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技術(shù)又稱(chēng)為PCR-RFLP，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài) 性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再 用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制 性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量 和相對(duì)特異性，而且方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短。這種方法與RFLP相比，不同的是以擴(kuò)增替代了 酶切，避免了 RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟。
[0003] BRCA2基因 （breast cancer 2，early onset)位于人類(lèi)染色體 13ql2.3,人類(lèi)BRCA 2基因含有28個(gè)外顯子，cDNA有10254個(gè)堿基對(duì)，編碼的蛋白質(zhì)含有3418個(gè)氨基酸。這個(gè)基因 所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是修復(fù)受損的基因的關(guān)鍵。BRCA2結(jié)合單鏈DNA與重組酶BRCA2相互作用是 同源重組過(guò)程中重要的一步。最近關(guān)于BRCA2 3'-UTR區(qū)域的遺傳變異與人類(lèi)腫瘤的關(guān)聯(lián)已 有報(bào)道。通常該多態(tài)在人群中存在三種BRCA2基因的基因型:AA型(人基因組rsl5869多態(tài)位 點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為A)，AC型（人基因組rsl5869多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別 為C和A)和CC型(人基因組rsl5869多態(tài)位點(diǎn)BRCA2的兩個(gè)等位基因堿基均為C)。
[0004] 目前鑒定人乳腺癌BRCA2基因多態(tài)rs 15869時(shí)常使用的限制性內(nèi)切酶價(jià)格昂貴，實(shí) 驗(yàn)成本高，難以在實(shí)驗(yàn)室中普及使用。因此，本領(lǐng)域存在對(duì)操作簡(jiǎn)單，成本低，使用范圍廣的 新型檢測(cè)SNP方法的需求。
[0005] 序列特異性引物PCR也稱(chēng)等位基因特異性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于Taq DNA 多聚酶不能修復(fù)DNA引物在3'末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配。所以，當(dāng)引物的3'端核苷酸與等位基因 變異部位序列互補(bǔ)，則模板被擴(kuò)增。但是，當(dāng)引物3'端核苷酸與模板錯(cuò)配，則模板不會(huì)被擴(kuò) 增或擴(kuò)增效率極低。每個(gè)等位基因的檢測(cè)，需設(shè)計(jì)兩套引物，一套為等位基因特異性引物， 一套為普通引物。PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后，DNA的存在與否通過(guò)紫外線透射來(lái)檢測(cè)，DNA條帶 的存在或缺失即可確定基因型。在同一反應(yīng)中的另一對(duì)引物(通常擴(kuò)增人生長(zhǎng)激素基因的 一段）總會(huì)產(chǎn)生一個(gè)DNA片斷，與ΗΡΑ基因型無(wú)關(guān)，作為PCR有效性的控制?；蛱禺愋訮CR (AS-PCR)的缺點(diǎn)是擴(kuò)增效率較低，擴(kuò)增特異性差，因此PCR產(chǎn)物的特異性與穩(wěn)定性無(wú)法保 障，同時(shí)，分型結(jié)果也較容易誤判，穩(wěn)定性較差。
[0006] TaqMan探針?lè)ㄊ侵窹CR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光 探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有熒光 報(bào)告基團(tuán)（Reporter，R)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，Q)，如TAMRA 等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5'端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3'端熒光基 團(tuán)淬滅，儀器檢測(cè)不到5'端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)（就是說(shuō)5'熒光基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)正 好是3'熒光基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)，因而能量被吸收傳遞到3'熒光基團(tuán)而發(fā)出其它熒光）。隨著 PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5' -3'外切酶活性(此活性是 雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會(huì)將切割探針，釋放5'端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng) 體系中，遠(yuǎn)離3'端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5'端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)就可以被 探頭檢測(cè)到。也就是說(shuō)每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積 與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。Taqman熒光探針?lè)?需要昂貴的儀器和較長(zhǎng)的步驟，成本較高，難以在實(shí)驗(yàn)室中普及使用。
[0007] 染料法基因定性分析(HRM)的主要原理是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量以及堿基互 補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，其極高的溫度均一性和溫度分辨率 使分辨精度可以達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。染料法基因定性分析方法的缺點(diǎn)在于由于染 料法特異性不強(qiáng)，只要是雙鏈的DNA都會(huì)結(jié)合發(fā)光，因此，特異性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低、適用范圍廣 泛的用Mwol鑒定人乳腺癌BRCA2基因 rsl5869多態(tài)性的方法，該方法在節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本的前提 下，通過(guò)PCR-RFLP技術(shù)的改進(jìn)，來(lái)開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)人乳腺癌BRCA2 rsl5869基因多態(tài) 性的試劑盒。首次證明了BRCA2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl5869位于內(nèi)含子3'-UTR中，在 此基礎(chǔ)上本發(fā)明提供了一種檢測(cè)乳腺癌易感性基因的方法，利用本發(fā)明檢測(cè)位點(diǎn)的基因 型，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉，為乳腺癌的診斷提供了一個(gè)簡(jiǎn)捷的新途徑。
[0009] 其技術(shù)方案如下：
[0010] 一種用Mwol鑒定人乳腺癌BRCA2基因 rsl5869多態(tài)性的方法，包括以下步驟：
[0011] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0012] (b)提供擴(kuò)增人乳腺癌BRCA2基因多態(tài)性rsl5869位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向 引物，rs 15869上游引物：5 ' -AAGCAGGACACAATTACAAC-3 '，rsl5869下游引物：5 ' -CAGGCTGGTCTTGAACTC-3 '，以步驟(a)提取的待測(cè)人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取擴(kuò) 增產(chǎn)物；
[0013] (c)使用限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟(b)中獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn) 物；
[0014] (d)將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以判定BRCA2基因多態(tài)性rs 15869 的各基因型。其中，經(jīng)電泳后有兩條條帶者為CC基因型，三條條帶者為AA基因型，四條條帶 者為AC基因型。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法，是采用聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段，然后將待檢測(cè)的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切，限制性 內(nèi)切酶識(shí)別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再由限制酶圖譜 (restriction map)分析此段序列的特異酶切位點(diǎn)，藉由片段的多樣性來(lái)比對(duì)不同來(lái)源基 因序列的差異性。簡(jiǎn)而言之，就是先PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的片斷，而后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反 應(yīng)，電泳后觀察比較限制性圖譜來(lái)分析序列之間的差異。此方法重復(fù)性好，操作較簡(jiǎn)單，成 本低，酶切結(jié)果容易辨識(shí)。本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單、成本低、適用范圍廣泛的檢測(cè)人乳 腺癌易感基因 BRCA2多態(tài)性rsl5869的方法及檢測(cè)試劑盒，可預(yù)測(cè)乳腺癌的易感性，用于臨 床早期診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序；
[0018] 圖2是BRCA2 rsl5869位點(diǎn)的電泳圖譜；
[0019] 圖3是BRCA2 rsl5869位點(diǎn)AA基因型測(cè)序圖譜；
[0020] 圖4是BRCA2 rsl5869位點(diǎn)AC基因型測(cè)序圖譜；
[0021] 圖5是BRCA2 rsl5869位點(diǎn)CC基因型測(cè)序圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)乳腺癌易感基因的方法，由于識(shí)別特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切 酶Mwol適用范圍廣，價(jià)錢(qián)較為經(jīng)濟(jì)，進(jìn)而大大降低了檢測(cè)SNP的成本。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測(cè) 該C/A多態(tài)的方法可使用表1中的1種酶。綜合考慮簡(jiǎn)單操作性與經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，限制性內(nèi)切酶 Mwol是不二選擇。
[0024] 表1中提供的限制性內(nèi)切酶的價(jià)格從NEB公司(http: //www.neb-china. com)，限制 性內(nèi)切酶的選擇從WatCut限制性內(nèi)切酶分析軟件上獲取(http: //watcut · uwater loo · ca/ template.php?act = snp_new)，以此作為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和價(jià)格的參考。
[0025] 表1 一種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列及其價(jià)格
[0026]
[0027]在本發(fā)明的實(shí)施中，正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)采用Primere.O軟件進(jìn)行，設(shè)計(jì)的 原則綜合考慮引物對(duì)PCR擴(kuò)增的靈敏度、特異度以及擴(kuò)增效率的影響。按照堿基互不配對(duì)的 原則設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間，過(guò)長(zhǎng)或短均會(huì)造成特異性差，過(guò)長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo) 致其延伸溫度大于74°C，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物GC含量在40%~60%之間，1'111 值最好接近72°C，GC含量過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機(jī)分布，引物自身及引物 之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。引物5'端和中 間A G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3'端△ G值較低。擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物應(yīng)具有 特異性，引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)，以確保其與其它基因不具有互補(bǔ)性。在 此基礎(chǔ)上，最終選取的上游引物：5 ' -AAGCAGGACACAATTACAAC-3 '，下游引物：5 ' -CAGGCTGGTCTTGAACTC-3'，。由此引物擴(kuò)增出的面的片段376bp，擴(kuò)增產(chǎn)物如下： AAGCAGGACACAATTACAACTAAAAAATATATCTAAGCATTTGCAAAGGCGACAATAAATTATTGACGCTTAACCTT TCCAGTTTATAAGACTGGAATATAATTTCAAACCACACATTAGTACTTATGTTGCACAATGAGMAAAGAAATTAGTT TCAAATTTACCTCAGCGTTTGTGTATCGGGCAAAAATCGTTTTGCCCGATTCCGTATTGGTATACTTTTGCTTCAGT TGCATATCTTAAAACTAAATGTAATTTATTAACTAATCAAGAAAAACATCTTTGGCTGAGCTCGGTGGCTCATGCCT GTAATCCCAACACTTTGAGAAGCTGAGGTGGGAGGAGTGCTTGAGGCCAGGAGTTCAAGACCAGCCTG(376bp)
[0028] 下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第141位bpM代表A/C多態(tài)即SNP位點(diǎn) rsl5869。該長(zhǎng)為376bp的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mwol酶切后可產(chǎn)生230bp，146bp，137bp 和93bp共四種片段類(lèi)型?；蛐团卸ńY(jié)果:CC突變基因型，長(zhǎng)為146bp，137bp和93bp三條帶； AA野生基因型，長(zhǎng)為230bp和146bp兩條帶;CA雜合基因型，長(zhǎng)為230bp，146bp，137bp和93bp 共四條帶。
[0029] 凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖(Agarose)是一種 線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)的。當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻 凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的，可用于DNA片段的制備電 泳。聚丙烯酰胺凝膠主要有兩種方式:一是用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰 胺凝膠，二是用于分離及純化單鏈DNA片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。但綜合考慮實(shí)用性、便 利性以及經(jīng)濟(jì)性，使用瓊脂糖凝膠電泳不失為一種最佳選擇。在本發(fā)明中，引物擴(kuò)增條件如 圖1所示，目的擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性核酸內(nèi)切酶XmnIMwo15U水浴鍋中酶切6-14h。酶切產(chǎn)物 采用3%的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基 因型，雜合基因型以及突變純合基因型。
[0030] 在本發(fā)明中，PCR擴(kuò)增體系的反應(yīng)條件并不受特別的限制，基于PCR原理三步驟而 設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90~95°C變 性，再迅速冷卻至40~60°C，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75°C，在 TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100~300bp時(shí)）可 采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94 °C變性，65°C左 右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。而對(duì)于待測(cè)DNA也沒(méi)有較高的濃度 及純度要求，既可以是人體體液或組織中提取的DNA，也可以是經(jīng)過(guò)預(yù)先降解處理的基因 組。但為了方便實(shí)施以及減少受試者痛苦，一般優(yōu)先選擇從血液中進(jìn)行基因組DNA的提取。
[0031] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明檢測(cè)人乳腺癌BRCA2基因單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs 15869的具體步驟如下：
[0032] (1)提取待測(cè)人基因組DNA模板，所述人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人 基因組模板。
[0033] (2 )PCR擴(kuò)增基因組DNA，對(duì)提取的模板基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含多態(tài)附近序 列的PCR產(chǎn)物。
[0034] (3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BccI進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物；
[0035] (4)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同條帶判斷野生純合 基因型，雜合基因型以及突變純合基因型。
[0036] 下面對(duì)上述各個(gè)主要步驟進(jìn)行詳細(xì)描述：
[0037] 1材料與方法
[0038] 1.1主要儀器與試劑
[0039] 儀器:BCD-228CH冰箱(新飛電器），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(華峰儀器），SmartGel凝 膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)），GT9612梯度PCR儀(百泰克生物），WD900SL23-2型號(hào)微波爐(格蘭 仕電器），DG-300C型電泳儀(鼎國(guó)昌盛生物)等。
[0040] 試劑:NEP004-1 DNA提取試劑盒（鼎國(guó)昌盛生物），50bp DNA Ladder(萊風(fēng)生物），2 XTaq PCR Mix(萊風(fēng)生物），MspI(Thermo)，瓊脂糖（SIGMA)等。
[0041 ] 1.2引物設(shè)計(jì)
[0042] 在NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中，查找BRCA2 rsl5869的核苷酸序列如下：
[0043] ACATTTGTTTCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTCAGCCACCAAGGAGTTGTGGCACCAAATACGAAACA CCCATAAAGAAAAAAGAACTGAATTCTCCTCAGATGACTCCATTTAAAAAATTCAATGAAATTTCTCTTTTGGAAAG TAATTCAATAGCTGACGAAGAACTTGCATTGATAAATACCCAAGCTCTTTTGTCTGGTTCAACAGGAGAAAAACAAT TTATATCTGTCAGTGAATCCACTAGGACTGCTCCCACCAGTTCAGAAGATTATCTCAGACTGAAACGACGTTGTACT ACATCTCTGATCAAAGAACAGGAGAGTTCCCAGGCCAGTACGGAAGAATGTGAGAAAAATAAGCAGGACACAATTAC AACTAAAAAATATATCTAAGCATTTGCAAAGGCGACAATAAATTATTGACGCTTAACCTTTCCAGTTTATAAGACTG GAATATAATTTCAAACCACACATTAGTACTTATGTTGCACAATGAGMAAAGAAATTAGTTTCAAATTTACCTCAGCG TTTGTGTATCGGGCAAAAATCGTTTTGCCCGATTCCGTATTGGTATACTTTTGCTTCAGTTGCATATCTTAAAACTA AATGTAATTTATTAACTAATCAAGAAAAACATCTTTGGCTGAGCTCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAACACTTTG AGAAGCTGAGGTGGGAGGAGTGCTTGAGGCCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACATAGGGAGACCCCCATCTTT ACAAAGAAAAAAAAAAGGGGAAAAGAAAATCTTTTAAATCTTTGGATTTGATCACTACAAGTATTATTTTACAAGTG AAATAAACATACCATTTTCTTTTAGATTGTGTCATTAAATGGAATGAGGTCTCTTAGTACAGTTATTTTGATGCAGA TAATTCCTTTTAGTTTAGCTACTATTTTAGGGGATTTTTTTTAGAGGTAACTCACTATGAAATAGTTCTCCTTAATG CAAATATG
[0044] 基因序列的第501個(gè)堿基R代表了 A/C多態(tài)，即為rsl5869的多態(tài)性位點(diǎn)。將以上序 列粘貼至引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0中，設(shè)置引物長(zhǎng)度和擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度等參數(shù) 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)GC含量和退火溫度等選擇最優(yōu)上下游引物，再將此引物與Pubmed中的 Blast序列比對(duì)功能(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行引物比對(duì)，最終確 定的上下游引物為正向引物序列：5'-厶厶60厶66厶0厶0厶厶1^厶0厶厶(：-3'，反向序列 ：5'-CAGGCTGGTCTTGAACTC-3'，引物的合成可以采用本領(lǐng)域通用的方法(如固相合成法），亦可委 托生物公司合成。
[0045] 1.3限制性內(nèi)切酶的選擇
[0046]根據(jù)dbSNP中五個(gè)位點(diǎn)的堿基序列，用WatCut在線限制性內(nèi)切酶分析軟件，在線搜 索獲得可識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶的信息，綜合考慮其酶切特異性及經(jīng)濟(jì)適用性選擇 最佳的限制性內(nèi)切酶Mwol。
[0047] 1.4從全血中提取待測(cè)樣本的基因組DNA
[0048]嚴(yán)格按照離心柱型DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA。
[0049] 1)在1.5ml離心管中加入300μ1血細(xì)胞后，再加入900μ1細(xì)胞裂解液混和均勻，在冰 上放置lOmin后，在離心機(jī)中12000rpm離心lmin，棄上清，再次加入900μ1細(xì)胞裂解液，用槍 吹起沉淀并混勻后，重復(fù)上述步驟；
[0050] 2)向沉淀物中加入600μ1 solution Β溶液，用移液槍輕輕吹起沉淀后，加入?ομL 蛋白酶Κ混勻，在70 °C水浴鍋中放置lOmin后，12000rpm離心5min;
[00511 3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過(guò)號(hào)的新的離心管中，再向新的離心管中加入500μ1 無(wú)水乙醇，期間可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀物，該絮狀物即為DNA;
[0052] 4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中（若一次轉(zhuǎn)不完，可分次轉(zhuǎn)入），室溫靜置2min，再 12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0053] 5)加入700μ1已加入相應(yīng)體積無(wú)水乙醇的solution C漂洗液，室溫靜置2min， 12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0054] 6)加入700μ1已加入相應(yīng)體積無(wú)水乙醇的solution D漂洗液，室溫靜置2min， 12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0055] 7)加入500μ1 solution D漂洗液，12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0056] 8)再次離心2min，將離心柱置于新的編過(guò)號(hào)的離心管中，敞口放入37 °C恒溫箱內(nèi) 10min直至無(wú)明顯乙醇味；
[0057] 9)在娃基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65°C的solution Ε 100μ1，室溫放置5min， 12000rpm離心lmin，重復(fù)上述步驟一次，終離心后的液體即為提取出的基因組DNA;
[0058] 10)吸取2μ1提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和 純度。
[0059] 2 結(jié)果
[0060] 2.1 PCR 擴(kuò)增
[00611 (1)根據(jù)提取基因組DNA的濃度，將研究對(duì)象的DNA進(jìn)行稀釋?zhuān)菇K濃度為20ygAU。
[0062] (2)PCR擴(kuò)增體系為2XTaq PCR Mix 7.5μ1、上游引物和下游引物各0.3μ1、模板 DNA Ι.ΟμΙ，最后用雙蒸水補(bǔ)充總體積至15μ1。
[0063] (3 )PCR反應(yīng)條件:第一個(gè)階段為預(yù)變性階段，94 °C/5min;第二個(gè)階段包括三個(gè)步 驟共35個(gè)循環(huán)，依次設(shè)置為94°C/30s、58°C退火時(shí)間45s、72°C/45s;第三個(gè)階段72°C/5min。 擴(kuò)增后的產(chǎn)物序列為：
[0064] AAGCAGGACACAATTACAACTAAAAAATATATCTAAGCATTTGCAAAGGCGACAATAAATTATTGACGCTTAACCTT TCCAGTTTATAAGACTGGAATATAATTTCAAACCACACATTAGTACTTATGTTGCACAATGAGMAAAGAAATTAGTT TCAAATTTACCTCAGCGTTTGTGTATCGGGCAAAAATCGTTTTGCCCGATTCCGTATTGGTATACTTTTGCTTCAGT TGCATATCTTAAAACTAAATGTAATTTATTAACTAATCAAGAAAAACATCTTTGGCTGAGCTCGGTGGCTCATGCCT GTAATCCCAACACTTTGAGAAGCTGAGGTGGGAGGAGTGCTTGAGGCCAGGAGTTCAAGACCAGCCTG(376bp)
[0065] 下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第243位bpM代表A/C多態(tài)即SNP位點(diǎn) rsl5869〇
[0066] 2.2酶切反應(yīng)
[0067] 酶切體系為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μ1、上限制性內(nèi)切酶0.5μ1、Buffer 1. ΟμL，最后用雙蒸 水補(bǔ)充總體積至15μ 1?；靹蚝笾糜谒″佒? 7 °C水浴4-16小時(shí)。
[0068] 2.3基因型的判定
[0069]將酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠在4-10￥/(^的條件下，電泳20-401^11，至紫外燈下 能分清明顯的條帶后并拍照鑒定。對(duì)于不同的基因型，rsl5869位點(diǎn)不同基因型展現(xiàn)出不同 的條帶(見(jiàn)圖2)，CC突變基因型，長(zhǎng)為146bp，137bp和93bp三條帶;AA野生基因型，長(zhǎng)為230bp 和146bp兩條帶;CA雜合基因型，長(zhǎng)為230bp，146bp，137bp和93bp共四條帶。各基因型均經(jīng)測(cè) 序以進(jìn)一步鑒定，測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)圖3至5)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測(cè)得的結(jié)果完全相同。
[0070] 實(shí)施例1.人乳腺癌組織標(biāo)本測(cè)定人乳腺癌BRCA2 rsl5869多態(tài)性。
[0071] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，檢測(cè)人乳腺癌BRCA2基因多態(tài)rsl5869的具體步驟如 下：
[0072] (1)獲取手術(shù)切取的乳腺癌組織，采用酚-氯仿法提取乳腺癌組織的基因組DNA作 為待測(cè)DNA，提取步驟如下：
[0073] 1)將乳腺癌組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取0 . lg的組織進(jìn)行碾磨，加入 lml的滅菌水，顛倒混勾，lOOOOrpm離心10min，棄上清，以上步驟重復(fù)兩次 [0074] 2)加入200μ1的DNA裂解液，5μ1的蛋白酶K混勻，55 °C水浴消化過(guò)夜。
[0075] 3)消化完成后加入等體積的酚氯仿混合液（1:1)，劇烈震蕩，使其變成奶咖色。 12000rpm離心 1 Omin。
[0076] 4)取上清時(shí)避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體。加入等體積的氯仿后顛倒混勻。 12000rm離心 1 Omin。
[0077] 5)取上清，注意避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體。加入1/10的醋酸鈉以及2.5倍的 無(wú)水乙醇，顛倒混勾，12000rpm離心10min，棄上清。
[0078] 6)加入lml 70%乙醇，使其白色沉淀懸浮，顛倒混勻數(shù)次，12000rpm離心10min，棄 上清，室溫靜置5-1 Omin使乙醇揮發(fā)干凈。
[0079] 7)加入50μ1滅菌水溶解DNA，即得乳腺癌組織基因組DNA。
[0080] (2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取，在CHIP網(wǎng)站上進(jìn)行核對(duì)，明確準(zhǔn)確 無(wú)誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物，結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的 Blast序列比對(duì)結(jié)果(http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)等信息篩選出最優(yōu)引 物為正向引物序列：5 ' -AAGCAGGACACAATTACAAC-3 '，反向序列：5 ' -CAGGCTGGTCTTGAACTC-3 '，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，制備PCR擴(kuò)增體系：2 X TaqPCRMix7.5μ1，雙蒸水5.9μ1，上游引物0.3μ 1，下游引物〇.3μ1以及模板DNAl.Oyl，充分混勻后即得15.0ylPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系；按照第一 階段:94 °C變性5min，第二階段共包括35個(gè)循環(huán)三個(gè)步驟，首先94 °C變性30s，58 °C退火45s， 最后72°C延伸45s，第三階段:72°C延伸5min，最終4°C儲(chǔ)存以備用，即得長(zhǎng)為376bp的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物；
[0081 ] (3)擴(kuò)增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶Mwol 5U水浴鍋中酶切6-14h，PCR反應(yīng) 產(chǎn)物5μ1，限制性內(nèi)切酶0.5μ1，Buf f erl. ΟμL以及無(wú)核酸酶純水8.5μ1共計(jì)15μ1酶切體系，于 水浴鍋中37 °C酶切6-14h，即得酶切產(chǎn)物。所述的識(shí)另ljGCN5、GC序列的限制性內(nèi)切酶為內(nèi)切 酶Mwol及其同裂酶;綜合考慮經(jīng)濟(jì)實(shí)用性以及簡(jiǎn)單操作性最終選擇Mwol進(jìn)行酶切鑒定；
[0082] (4)酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的 條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型(見(jiàn)表2)。
[0083] 表2 rs 15869位點(diǎn)基因型判定
[0084]
[0085] 實(shí)施例2.人外周血全血標(biāo)本測(cè)定人乳腺癌BRCA2 rsl5869多態(tài)性
[0086]與實(shí)施例1的步驟基本相同，只是采用下面的方法從人外周血中提取基因組DNA作 為待測(cè)DNA。
[0087] 按照NEP004-1全血基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行待測(cè)血樣基因組DNA的 提取，具體步驟如下：
[0088] 1)在1.5ml離心管中加入300μ1血細(xì)胞后，再加入900μ1細(xì)胞裂解液混和均勻，在冰 上放置lOmin后，在離心機(jī)中12000rpm離心lmin，棄上清，再次加入900μ1細(xì)胞裂解液，用槍 吹起沉淀并混勻后，重復(fù)上述步驟；
[0089] 2)向沉淀物中加入600μ1 solution Β溶液，用移液槍輕輕吹起沉淀后，加入ΙΟμΙ 蛋白酶Κ混勻，在70 °C水浴鍋中放置lOmin后，12000rpm離心5min。
[0090] 3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過(guò)號(hào)的新的離心管中，再向新的離心管中加入500μ1 無(wú)水乙醇，期間可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀物，該絮狀物即為DNA;
[0091] 4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中（若一次轉(zhuǎn)不完，可分次轉(zhuǎn)入），室溫靜置2min，再 12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0092] 5)加入700μ1已加入相應(yīng)體積無(wú)水乙醇的solution C漂洗液，室溫靜置2min， 12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0093] 6)加入700μ1已加入相應(yīng)體積無(wú)水乙醇的solution D漂洗液，室溫靜置2min， 12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0094] 7)加入500μ1 solution D漂洗液，12000rpm離心lmin，棄廢液；
[0095] 8)再次離心2min，將離心柱置于新的編過(guò)號(hào)的離心管中，敞口放入37 °C恒溫箱內(nèi) lOmin直至無(wú)明顯乙醇味；
[0096] 9)在娃基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65°C的solution Ε 100μ1，室溫放置5min， 12000rpm離心lmin，重復(fù)上述步驟一次，終離心后的液體即為提取出的基因組DNA。
[0097]提取完畢基因組DNA后按照案例一的步驟進(jìn)行基因型的鑒定，鑒定結(jié)果如下：將酶 切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下拍照鑒定。對(duì)于不同的基因型，rsl5869位點(diǎn) 不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見(jiàn)圖2)，CC突變基因型，長(zhǎng)為146bp，137bp和93bp三條帶;AA 野生基因型，長(zhǎng)為230bp和146bp兩條帶;CA雜合基因型，長(zhǎng)為230bp，146bp，137bp和93bp共 四條帶。各基因型均經(jīng)測(cè)序以進(jìn)一步鑒定，測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)圖3、圖4、圖5)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測(cè)得 的結(jié)果完全相同。
[0098] 本發(fā)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳后即可進(jìn)行基因型的鑒定工作，因此在實(shí)際運(yùn)用 中具有很大的靈活性，加之檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行，因此是一種進(jìn)行單堿基突變位點(diǎn)基因型鑒 定的好方法。技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)是設(shè)計(jì)出的BRCA2多態(tài)性rsl5869的上下游引物，正向引物序列： 5'-AAGCAGGACACAATTACAAC-3'，反向序列：5'-CAGGCTGGTCTTGAACTC-3'，以及限制性內(nèi)切酶 Mwol的使用。本發(fā)明所提供得檢測(cè)人乳腺癌易感基因 BRCA2多態(tài)性rsl5869的方法操作簡(jiǎn) 單、成本低、適用范圍廣泛。
[0099] 以上所述，僅為本發(fā)明最佳實(shí)施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明 披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見(jiàn)地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用MwoI鑒定人乳腺癌BRCA2基因 rsl5869多態(tài)性的方法，其特征在于，包括以下 步驟： (a) 抽提樣品的基因組DNA; (b) 提供擴(kuò)增人乳腺癌BRCA2基因多態(tài)性rsl5869位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引 物，rsl5869上游引物：5' -AAGCAGGACACAATTACAAC-3'，rsl5869下游引物：5'_ CAGGCTGGTCTTGAACTC-3 '，以步驟(a)提取的待測(cè)人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取擴(kuò) 增產(chǎn)物； (c) 使用限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟(b)中獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物； (d) 將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以判定BRCA2基因多態(tài)性rs 15869的各 基因型，其中，經(jīng)電泳后有兩條條帶者為CC基因型，三條條帶者為AA基因型，四條條帶者為 AC基因型。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105907880SQ201610502984
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】趙艷艷, 朱利楠, 楊再剛, 岳欣閣, 桑海強(qiáng), 宋春花
【申請(qǐng)人】鄭州大學(xué)第附屬醫(yī)院, 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院