基因標(biāo)志物在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了基因標(biāo)志物在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的用途，所述標(biāo)志物為SPAG9基因，SPAG9基因在缺血性腦卒中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)檢測(cè)SPAG9基因的表達(dá)水平可以為缺血性腦卒中患者提供早期診斷，以期實(shí)現(xiàn)早治療，降低缺血腦卒中患者的死亡率和致殘率。
【專利說(shuō)明】
基因標(biāo)志物在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因標(biāo)志物在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的 用途，具體地該基因標(biāo)志物為SPAG9。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦卒中（（stroke)，又稱為中風(fēng)或腦血管意外，是一組突然起病，由于腦局部血液 循環(huán)障礙導(dǎo)致的、以局灶性神經(jīng)功能缺損為共同特征的急性腦血管疾病。其因高發(fā)病率、高 死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率成為世界范圍內(nèi)三大死亡疾病之一，在我國(guó)已躍升為城市居民 死因首位、農(nóng)村居民死因第二位，也是成年人首位致殘疾病。近20年來(lái)，隨著自然人口增加 和老齡化的沖擊，我國(guó)的腦卒中發(fā)病率、死亡率總體呈上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新發(fā)腦 卒中超過(guò)200萬(wàn)，每年死于腦卒中者超過(guò)100萬(wàn)，而且存活者中50-70%病人遺留癱瘓、失語(yǔ) 等嚴(yán)重殘疾，給個(gè)人和社會(huì)構(gòu)成巨大的負(fù)擔(dān)，成為嚴(yán)重危害人類健康及社會(huì)發(fā)展的主要公 共衛(wèi)生問(wèn)題之一。
[0003] 缺血性腦卒中又稱為腦梗死，它是由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障 礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。缺血性卒 中是卒中的主要類型，約占卒中總發(fā)病的60%~80%。許多流行病學(xué)研究已從不同方面表 明，缺血性腦卒中是一種受環(huán)境和遺傳因素共同作用的復(fù)雜性疾病。眾所周知，高齡、吸煙、 飲酒、高血壓、高血脂、高血搪、心臟病、纖維蛋白原水平異常和凝血機(jī)制障礙等是心腦血管 疾病的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，但這僅能解釋約50-60%腦卒中的發(fā)生。許多人即使具備上述危險(xiǎn)因 素未發(fā)生腦卒中，而一些不具備上述危險(xiǎn)因素的人卻發(fā)生了腦卒中，提示腦卒中的發(fā)病還 與其它因素有關(guān)。多數(shù)關(guān)于家族中一級(jí)親屬腦血管病發(fā)病情況的研究均發(fā)現(xiàn)，有卒中或心 臟病陽(yáng)性家族史者較同齡、同性別的陰性家族史者更易患腦卒中，提示家族史是腦血管病 的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素;對(duì)丹麥孿生子的長(zhǎng)期隨訪也表明，同卵雙生子均患腦梗死的危險(xiǎn)性 是雙卵雙生子的2倍，說(shuō)明缺血性腦卒中發(fā)病與遺傳因素密切相關(guān)。近年來(lái)，由于人類基因 組計(jì)劃的完成，對(duì)缺血性腦卒中的研究從分子遺傳學(xué)角度有了新的突破。
[0004] 目前，腦卒中的診斷主要依靠臨床檢查和各種神經(jīng)成像技術(shù)，盡管相比以往來(lái)說(shuō)， 醫(yī)學(xué)技術(shù)已高度發(fā)達(dá)，但是尚無(wú)可靠的生物標(biāo)志物可以對(duì)缺血性腦卒中進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和早 期診斷，而目前防治缺血性腦卒中的關(guān)鍵是早期發(fā)現(xiàn)病變血管，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)估干預(yù)，指導(dǎo) 臨床選擇及時(shí)有效的治療措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種缺血性腦卒中的診斷標(biāo) 志物；
[0006] 本發(fā)明的目的之二，提供一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)缺血性腦卒中的早 期診斷。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了檢測(cè)SPAG9基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，上面所述診斷產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交 或芯片檢測(cè)SPAG9基因的表達(dá)水平以診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。
[0010] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SPAG9基 因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SPAG9基因 的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與SPAG9蛋白特異性結(jié)合的抗體； 所述用原位雜交診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與SPAG9基因的核酸序列雜交的探針;所述 用微陣列芯片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括與 SPAG9蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與SPAG9基因的核酸序列雜交的探針。
[0011]進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒;其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯 片;所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒。
[0012]進(jìn)一步，所述基因檢測(cè)試劑盒特異性擴(kuò)增SPAG9基因的引物對(duì)。
[0013]在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述特異性擴(kuò)增SPAG9基因的引物對(duì)序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
[0014] 本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中 SPAG9基因的表達(dá)水平來(lái)診斷缺血性腦卒中。
[0015] 進(jìn)一步，上面所述的產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白 質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷 酸探針包括用于檢測(cè)SPAG9基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)SPAG9基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯 片包括固相載體以及固定在固相載體上的SPAG9蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因 檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)SPAG9基因轉(zhuǎn)錄水 平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括SPAG9蛋白的特異性抗體。其中，所述基因芯片可 用于檢測(cè)包括SPAG9基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與缺血性腦卒中相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá) 水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括SPAG9蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與缺血性腦卒中 相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與缺血性腦卒中的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提 高缺血性腦卒中診斷的準(zhǔn)確率。
[0016] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)SPAG9基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括針對(duì)SPAG9基因的引物和/或探 針。
[0017] 進(jìn)一步，所述針對(duì)對(duì)SPAG9基因的引物序列如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。
[0018] 在本發(fā)明中，"抗體"覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性 抗體）、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。"單克隆抗體"指 從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除 了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單 克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括 從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。
[0019] 單克隆抗體還包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種 或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另 一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片 段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。
[0020] "抗體或抗體片段"指無(wú)論自天然生成抗體的任何物種衍生，還是通過(guò)重組DNA技 術(shù)創(chuàng)建;無(wú)論自血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌分離的抗體(例如IgG、IgM、IgA、 IgD或IgE)或片段(諸如Fab、F(ab'）2、Fv、二硫化物連接的Fv、scFv、閉合構(gòu)象多特異性抗 體、二硫化物連接的scFv、雙抗體）。
[0021] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的 分子。除非另有指出，術(shù)語(yǔ)"探針"通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為 "革巴多核苷酸"）結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全 序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式， 包括，但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。
[0022] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質(zhì)上，所述雜交陣列原 件諸如聚核苷酸探針(例如寡核苷酸)或結(jié)合劑(例如抗體）。所述基質(zhì)可以是固體基質(zhì)，例 如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纖維光學(xué)粘結(jié)劑或半固態(tài)基質(zhì)，例如硝酸纖維素膜。核苷酸序 列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
[0023] 各種探針陣列已經(jīng)描述在文獻(xiàn)中并且可以用于本發(fā)明上下文中檢測(cè)可能與本文 所述表型相關(guān)的標(biāo)志物。例如，DNA探針陣列芯片或較大的DNA探針陣列晶片（否則，可以通 過(guò)打斷晶片而獲得各個(gè)體芯片）用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。DNA探針陣列晶片一般包含玻 璃晶片，其上放置了高密度DNA探針（短DNA片段)陣列。這些晶片各自可以保持例如約6000 萬(wàn)個(gè)用于識(shí)別較長(zhǎng)樣品DNA序列（例如，來(lái)自個(gè)體或群體，例如，包含所關(guān)注的標(biāo)志物）的DNA 探針。用玻璃晶片上的DNA探針組識(shí)別樣品DNA通過(guò)DNA雜交進(jìn)行。當(dāng)DNA樣品與DNA探針陣列 雜交時(shí)，樣品結(jié)合于樣品DNA序列互補(bǔ)的那些探針。通過(guò)評(píng)價(jià)個(gè)體樣品DNA與那些探針更穩(wěn) 固地雜交，有可能確定已知的核酸序列是否存在于樣品中，由此確定核酸中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物 是否存在。還可以使用這一手段通過(guò)控制雜交條件以允許區(qū)別單一核苷酸，例如，用于SNP 鑒定和一種或多種SNP的樣品基因分型來(lái)進(jìn)行ASH。陣列提供了一種同時(shí)(或串連)檢測(cè)多個(gè) 多態(tài)性標(biāo)志物的便利性實(shí)施方案。
[0024]上述探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂"互補(bǔ)"， 只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有 80 %以上、優(yōu)選90 %以上、更優(yōu)選95 %以上、特別優(yōu)選100 %的同源性。這些探針可以是DNA， 也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過(guò)?嫩丄嫩4嫩、6嫩、了嫩等人工 核酸置換得到的多核苷酸。
[0025]在本發(fā)明的上下文中，"SPAG9基因"包括人SPAG9基因以及人SPAG9基因的任何功 能等同物的多核苷酸。SPAG9基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中SPAG9基 因（NC_000017.11)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；在本 發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述SPAG9基因的編碼序列是SEQ ID N0.1所示的DNA序列。
[0026]本發(fā)明的SPAG9基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá)SPAG9的 DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0027]病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、pcDNA3.0表 達(dá)載體、pcDNA3.1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、pTRE表達(dá)載 體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
[0028] 在本發(fā)明的上下文中，SPAG9基因表達(dá)產(chǎn)物包括人SPAG9蛋白以及人SPAG9蛋白的 部分肽。所述SPAG9蛋白的部分肽含有與缺血性腦卒中相關(guān)的功能域。
[0029] "SPAG9蛋白"包括SPAG9蛋白以及SPAG9蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括SPAG9蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變 體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人SPAG9的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。在 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述SPAG9蛋白是由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組 成的蛋白質(zhì)。
[0030] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"樣本"是指從目標(biāo)患者得到的組合物，其包含細(xì)胞和/或其他分 子體一將其進(jìn)行特征化和/或識(shí)別，例如，根據(jù)物理、生化、化學(xué)和/或生理特征。例如，短語(yǔ) "臨床樣本"或"疾病樣本"及其變體，是指從目標(biāo)患者獲得的任何樣本，將預(yù)期或已知所述 樣本中能夠獲得細(xì)胞和/或分子體，例如將被特征化的生物標(biāo)志物。
[0031] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述"樣本"為受試者的血液。
[0032]在本發(fā)明的上下文中，"診斷缺血性腦卒中"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有缺血 性腦卒中、也包括判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。
[0033]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0034] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 SPAG9基因表達(dá)與缺血性腦卒中相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)受試者血液中 SPAG9的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有缺血性腦卒中、或者判斷受試者是否存在患有缺血 性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0035]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種缺血性腦卒中的新的分子標(biāo)記物-SPAG9基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè) 手段，基因診斷更及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷，從而降低缺血 性腦卒中的死亡率。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1顯示利用QPCR檢測(cè)SPAG9基因在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)情況。
[0037]具體的實(shí)施方式
[0038]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0039 ]實(shí)施例1篩選與缺血性腦卒中相關(guān)的基因標(biāo)志物 [0040] 1、樣品收集
[0041 ]各收集10例正常人血液和缺血性腦卒中患者血液樣本，上述所有標(biāo)本的取得均通 過(guò)倫理委員會(huì)的同意，并獲得受試者的知情同意。
[0042] 2、RNA樣品的制備及質(zhì)量分析
[0043] 2.1 RNA樣品的制備
[0044] (1)勻漿處理
[0045] 直接取血液，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10min，10，000rpm離心 lmin。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。每100-200μ1血液收集的白細(xì)胞沉淀加入lml Trizol〇
[0046] (2)分層
[0047] a ·樣品加入Tr i ζο 1后，室溫放置5min，使樣品充分裂解。4 °C 12，OOOrpm離心1 Omin， 取上清；
[0048] b.每lml Trizol加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勾后室溫放置3_5min使其自然分相。 [0049] (3)RNA 沉淀
[0050] a. 4 °C 12，OOOrpm離心10-15min。樣品會(huì)分成三層:黃色的有機(jī)相，中間層和無(wú)色的 水相，RNA主要在水相中，把水相小心的轉(zhuǎn)移到新管中。
[0051 ] b ·在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置lOjOminjr 12，OOOrpm離心 10min，棄上清，RNA沉淀于管底。
[0052] (4)RNA 漂洗
[0053] a.RNA沉淀中加入lml 75%乙醇（用RNase-free水配制），溫和振蕩離心管，懸浮沉 淀。每lml TRIzol加入lml 75%乙醇。
[0054] b. 4°C5，000-8，OOOrpm離心l-2min，棄上清;短暫快速離心，用移液器小心吸棄上 清，注意不要吸棄沉淀。室溫放置l_2min瞭干沉淀。
[0055] (5)溶解 RNA
[0056] 沉淀中加入50-100μ1 RNase-f ree水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70 °C保存。
[0057] 2.2 RNA樣品的質(zhì)量分析(NanoDroplOOO分光光度計(jì)）
[0058] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品，RNA-seq測(cè)序的樣品要求:0D260/0D280為 1·8_2·2 〇
[0059] 2.3 RNA樣品的質(zhì)量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0060] 將上述提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Ag i 1 ent Techno 1 og i e s 2 1 00 Bioanalyzer檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無(wú)降解、RNA完整性指 數(shù)合格、濃度達(dá)到要求的符合RNA-seq測(cè)序cDNA文庫(kù)構(gòu)建的要求，可以用于文庫(kù)構(gòu)建及測(cè) 序。
[0061 ] 3、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0062] 3.1 RNA-seq 讀段定位
[0063]首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHat vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組(hgl9)進(jìn)行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預(yù)先構(gòu)建的索引 從TopHat主頁(yè)下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時(shí)，允許每個(gè)讀段(默認(rèn) 到20)有多個(gè)匹配位點(diǎn)，最多2次錯(cuò)配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號(hào)建立可能的 剪切位點(diǎn)庫(kù)，根據(jù)這些剪切位點(diǎn)庫(kù)將沒(méi)有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 TopHat方法的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。
[0064] 3.2轉(zhuǎn)錄豐度評(píng)估
[0065]匹配上的讀段文件通過(guò)Cufflinks vl.0.3處理，Cufflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。FPKM值指的是每一百萬(wàn)測(cè)序片段中匹配到特定 基因 lkb長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過(guò)貝葉斯推理方法計(jì)算FPKM估計(jì)值的置信區(qū)間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載（Homo_ sapiens.GRCh37·63·gtf)〇
[0066] 3.3差異表達(dá)基因的檢測(cè)
[0067] 將下載的Ensembl GTF文件和通過(guò)TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測(cè)差異表 達(dá)。在Cuff idff輸出中只有q值<0.01，測(cè)試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。
[0068] 4、結(jié)果
[0069] RNA-seq結(jié)果顯示，SPAG9基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達(dá)水平顯著高于正 常人的表達(dá)水平。
[0070] 實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證SPAG9基因的差異表達(dá)
[0071] 1、根據(jù)高通量測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果選擇SPAG9基因進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1 中的樣本收集方式選擇缺血性腦卒中患者血液和正常人血液各80例。
[0072] 2、RNA提取步驟同實(shí)施例1。
[0073] 3、逆轉(zhuǎn)錄:使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。具體步驟如下：
[0074] (1)取總RNA 2yg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入01 igo(dT)2μ1，充分混勻；70°C水?。?min后立 即冰浴2_3min;
[0075] (2)構(gòu)建25μ1反應(yīng)體系，其中包括5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，補(bǔ)無(wú)核酶水至25μ1;
[0076] (3)42°C水浴 60min 后，95°C水浴 5min 以滅活 M-MLV，-20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0077] 4、QPCR 擴(kuò)增
[0078] (1)引物設(shè)計(jì)
[0079] 根據(jù)Genebank中SPAG9基因和管家基因 GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物， 北京賽諾基因組研究中心有限公司合成。其中SPAG9基因的引物對(duì)序列如下:正向引物序列 為5'-AGAGAATTGGAGGAAGAG-3'（SEQIDN0·3) ;反向引物序列為5'-ATCACTATCATCGTCATCT-3'（SEQ ID NOdhGAPDH基因的引物序列對(duì)如下：正向引物序列為5'_ CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.5);反向引物 3'（SEQ ID N0.6)。
[0080] (2)PCR反應(yīng)體系：正向引物和反向引物各lyl，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系 12.5以1，模板2以1，加去離子水補(bǔ)足至25"1。
[0081 ] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0082] (3)PCR反應(yīng)條件：95°C lOmin，（95°C 15s，60°C60s) X 30個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為 熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0083] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0084] 實(shí)驗(yàn)采用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，使用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0085] 6、結(jié)果
[0086] 結(jié)果如圖1所示，與正常人血液相比，SPAG9基因在缺血性腦卒中患者血液中的表 達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)，同RNA-S印結(jié)果一致。
[0087]上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)SPAG9基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中產(chǎn)品中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測(cè)、原位雜交或微陣列芯片檢測(cè)SPAG9基因的表達(dá)水平以診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至 少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SPAG9基因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少 包括一對(duì)特異擴(kuò)增SPAG9基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與 SPAG9蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與SPAG9基 因的核酸序列雜交的探針;所述用微陣列芯片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和 基因芯片;其中，蛋白芯片包括與SPAG9蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與SPAG9基因 的核酸序列雜交的探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒； 其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢 測(cè)試劑盒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因檢測(cè)試劑盒特異性擴(kuò)增SPAG9基 因的引物對(duì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述特異性擴(kuò)增SPAG9基因的引物對(duì)序列 如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。7. -種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，其特征在于，所述的產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中SPAG9 基因的表達(dá)水平來(lái)診斷缺血性腦卒中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核 苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)SPAG9基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)SPAG9基因的寡核苷 酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的SPAG9蛋白的特異性抗體;所 述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè) SPAG9基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括SPAG9蛋白的特異性抗體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述檢測(cè)SPAG9基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括 針對(duì)SPAG9基因的引物和/或探針。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述針對(duì)對(duì)SPAG9基因的引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105907881SQ201610509639
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年7月1日
【發(fā)明人】宋宏濤, 肖楓, 楊承剛
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司