一種篩選腎癌外周血miRNA標(biāo)志物的方法及腎癌標(biāo)志物miR-378的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選腎癌血清/血漿miRNA標(biāo)志物的方法及miRNA標(biāo)志物。篩選方法是匯總與腎癌相關(guān)miRNAs資料并對其進(jìn)行meta分析，篩選出綜合分析結(jié)果最優(yōu)的1種以上miRNAs作為候選miRNAs；然后采用TaqManprobe?basedqRT?PCR方法，對候選miRNAs進(jìn)行人群血清/血漿樣本驗(yàn)證，篩選出腎癌患者相對健康人血清/血漿中表達(dá)閾值在2.53以上小于3.12的miRNAs；最后驗(yàn)證其在腎癌組織和血清/血漿中的表達(dá)一致性，表達(dá)一致的，則為目標(biāo)標(biāo)志物。本發(fā)明還提供了一種腎癌血清/血漿miRNA標(biāo)志物miR?378，為腎癌的無創(chuàng)診斷提供新途徑，具有重大的臨床實(shí)用價(jià)值?！緦＠f明】一種篩選腎癌外周血miRNA標(biāo)志物的方法及腎癌標(biāo)志物miR-378
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種篩選腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物的方法及miRNA標(biāo)志物?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]腎癌是起源于腎小管上皮細(xì)胞的一種常見腎臟惡性腫瘤，占成人全部惡性腫瘤的2%~3%，占腎臟原發(fā)惡性腫瘤的85%~90%(3丨68611?，似丨811&(111&111〇，如1]1&1厶.0&11〇6『statistics·CACancerJClin,2012,62:10-29)。腎癌組織分型較多，根據(jù)2004年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，腎癌在病理上可分為透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞癌、集合管癌和未分類腎細(xì)胞癌，其中以透明細(xì)胞癌為主，約占60%~85%(MuldersP，F(xiàn)iglinR，deKeonJBetal.Renalcellcarcinoma:recentProgressandfuturedirections.CaneerRes.1997,57(22):5189-5195)。每年全世界約有90000人因腎癌而死亡。國內(nèi)外的流行病學(xué)資料顯示腎癌的發(fā)病率和死亡率均有增高的趨勢。2000年中國上海標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率男性為5.8/10萬人，女性為3.8/10萬人。在過去的60余年中腎癌發(fā)病率每年以2%的速度增長，每年死于腎癌患者近10萬例（全國腫瘤防治研究辦公室、衛(wèi)生部衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)信息中心.中國試點(diǎn)市、縣惡性腫瘤的發(fā)病與死亡.（1993-1997)第2卷.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002，271-279)。[0003]腎細(xì)胞癌是一種泌尿系統(tǒng)獨(dú)特的惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)及腎外表現(xiàn)極為豐富，臨床病理學(xué)高度多樣，很難做到早期診斷和治療。血尿、疼痛和腹部包塊稱為腎腫瘤的三聯(lián)征。值得注意的是目前腎癌中有30%~50%病例系偶然發(fā)現(xiàn)的無癥狀患者。三聯(lián)征齊全時多已屬晚期，且30%的腎癌在診斷時已有或?qū)l(fā)生轉(zhuǎn)移病變（JonaschE，GaoJ，RathmellWK.Renalcel1carcinoma.BMJ.2014，10:349:g4797)。腎癌的主要治療方法是外科手術(shù)根治，但即使早期腎癌患者手術(shù)后，仍有30.40%將發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性腎癌預(yù)后較差，對放化療等治療不敏感，平均生存時間僅3.33個月，3年存活率低于5%(1&^1^1111&1131，1111&1111^&1，LapitanC.Systematicreviewofoncologicaloutcomesfollowingsurgicalmanagementoflocalisedrenalcancer.EurUrol,2012:61:972-993)。隨著影像學(xué)的發(fā)展，尤其是超聲的廣泛應(yīng)用和CT檢測的普及，越來越多的腎癌被早期診斷。但是依然有相當(dāng)多的患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期或者局部晚期，單純手術(shù)預(yù)后差。腎癌的組織病理類型較多，尚有形態(tài)學(xué)不明確的病理亞型，而且不同病理類型的腎癌具有不同的臨床特點(diǎn)、治療方案和預(yù)后。腎癌惡性程度決定其手術(shù)方式，術(shù)前影像學(xué)技術(shù)只能判別其臨床分期，尚不能提示腫瘤惡性程度。目前國內(nèi)腎癌一線化療藥索拉非尼對于腎癌的輔助治療和新輔助治療有顯著的效果，但是部分患者出現(xiàn)化療耐藥（？<^1^(：114，13〇1'1:1;[061<:2，]\161;[(3113113,6七al.Efficacyofsunitinibinpatientswithmetastaticorunresectablerenalcellcarcinomaandrenalinsufficiency.EurJCancer，2015，51(4):507-513)0晚期或局部晚期的腎癌預(yù)后較差。所以對腎癌患者的早期診斷對于該病的鑒別病理分型、提示惡性程度、監(jiān)測化療耐藥以及預(yù)后復(fù)發(fā)判斷的十分重要，但是目前對于腎癌乃至多數(shù)實(shí)體瘤來說尚未找到合適的早期診斷和預(yù)后隨訪生物標(biāo)志物。而目前已有的研究顯示微小RNA(microRNA，miRNA)有可能會成為一種潛在的早期診斷和治療腎癌的新途徑。[0004]miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類約有22個核苷酸(nt)的非編碼的小RNA分子。這些小RNA分子在基因轉(zhuǎn)錄后水平上，通過與革EmRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR)完全或不完全的互補(bǔ)配對，促進(jìn)目標(biāo)mRNA降解或抑制蛋白翻譯，對基因的表達(dá)起著負(fù)調(diào)節(jié)作用或基因沉默(GarzonR，etal.MicroRNAgeneexpressionduringretinoicacid-induceddifferentiationofhumanacutepromyelocyticleukemia.Oncogene，2007，26:4148-4157)〇miRNA參與細(xì)胞生長，分化和凋亡等多種生理病理過程，在腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用（CullenBR.TranscriptionandprocessingofhumanmicroRNAprecursors.MolCell，2004,16:861-865)。循環(huán)中miRNA分子具有較好的抗RNA酶降解能力，在血清中可長期穩(wěn)定存在，甚至在煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境等情況下仍能保持穩(wěn)定(MitchellPS,etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.ProcNatlAcadSciUSA，2008:105，10513_10518)。在一些疾病中miRNA的表達(dá)譜改變具有明顯的特征，尤其是在惡性腫瘤中存在著不同于正常機(jī)體的特征性miRNA表達(dá)譜（CalinGA，CroeeMC.MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatRevCaneer,2006,6(11):857-866.Redova,M.etal.CirculatingmiR-378andmiR-451inserumarepotentialbiomarkersforrenalcellcarcinoma.JTrans1Med,2012,10:1-8.HauserS,etal.AnalysisofserummicroRNAs(miR-26a_2*,miR_191,miR-337_3pandmiR-378)aspotentialbiomarkersinrenalcellcarcinoma.CancerEpidemiol,2012,36:391-394.ZhaiQ,etal.IdentificationofmiR-508-3pandmiR-509-3pthatareassociatedwithcellinvasionandmigrationandinvolvedintheapoptosisofrenalcellcarcinoma.BiochemBiophysResCommun,2012,419:621-626.ZhaoA,LiG,Peoc'hM,GeninC,GiqanteM.SerummiR-210asanovelbiomarkerformoleculardiagnosisofclearcellrenalcellcarcinoma.ExpMolPathol,2013,94:115-120)〇miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)水平的模式，而測定這些miRNA的表達(dá)將成為惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的重要手段。由于腫瘤組織標(biāo)本來源的限制，使得組織miRNA在臨床上的應(yīng)用存在一定的局限性。外周血標(biāo)本的獲得十分簡便，如果能在血液中檢出腎癌特異性的miRNA并將其作為腎癌的生物學(xué)標(biāo)志物經(jīng)具有至關(guān)重要的意義。循環(huán)中miRNA獲取的便利和穩(wěn)定性將拓寬其在實(shí)驗(yàn)研究和臨床中的作用。[0005]目前已有研究證實(shí)血清/血漿中存在幾百種的miRNAs，這些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性，有可能會成為一種潛在的早期診斷和監(jiān)測預(yù)后的新標(biāo)志。但是，由于血清/血漿中miRNA的表達(dá)量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡便且成本低廉的檢測方法是目前血清/血衆(zhòng)miRNA在腫瘤臨床檢測中亟待解決的問題。另一方面，僅僅采用一種血清/血漿miRNA作為腫瘤標(biāo)志物往往特異性不足，若將多種miRNA組合使用并與其他類型腫瘤標(biāo)志物檢測相結(jié)合，可有望顯著提高診斷的準(zhǔn)確性。然而，目前還沒有用于腎癌診斷的較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物的報(bào)道，若能篩選出腎癌異常表達(dá)的血清/血衆(zhòng)miRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對我國腎癌的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動。因此，開發(fā)miRNA檢測試劑盒產(chǎn)品和優(yōu)化精確而高通量的表達(dá)譜技術(shù)服務(wù)，研制和生產(chǎn)基于循環(huán)中miRNA的新型腎癌早期診斷和監(jiān)測預(yù)后的檢測試劑盒將有著重要的臨床意義。【
發(fā)明內(nèi)容】[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中對于腎癌的診斷仍然需要組織學(xué)檢查，給患者造成痛苦并且不能及早診斷的缺陷，本發(fā)明提供了一種篩選腎癌血清/血漿miRNA標(biāo)志物的方法。基于這種方法，本發(fā)明提供了一種腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物。[0007]本發(fā)明提供的篩選腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物的方法，包括以下步驟：[0008](1)搜集匯總與腎癌相關(guān)miRNAs資料；[0009](2)對匯總的miRNAs分別進(jìn)行診斷性meta分析，meta分析包括R0C曲線下面積、靈敏度、特異性、陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比;采用Q檢驗(yàn)和計(jì)算I2值進(jìn)行異質(zhì)性分析;篩選出綜合分析結(jié)果最優(yōu)的1種或多種miRNAs作為候選miRNAs;[0010](3)米用TaqManprobe-basedqRT-PCR方法，對候選miRNAs進(jìn)行人群血清/血衆(zhòng)樣本驗(yàn)證，篩選出腎癌患者相對健康人血清/血漿中表達(dá)閾值2.53以上小于3.12的miRNAs;[0011](4)檢驗(yàn)步驟(3)篩選出的miRNAs在腎癌組織和血清/血漿中的表達(dá)一致性，表達(dá)一致的，則該miRNA標(biāo)志物為目標(biāo)標(biāo)志物。[0012]靈敏度是指由金標(biāo)準(zhǔn)確診患病組內(nèi)所檢測出陽性病例數(shù)的比率（％)。即本試驗(yàn)(所涉及的標(biāo)志物)診斷的真陽性率，靈敏度越高，漏診的機(jī)會就越少。[0013]特異性是指由金標(biāo)準(zhǔn)確診為無病組內(nèi)所檢測出陰性人數(shù)的比率（％)。即本診斷試驗(yàn)(所涉及的標(biāo)志物)的真陰性率。特異性越高，發(fā)生誤診的機(jī)會就越少。[0014]陽性似然比(positivelikelihoodratio，PLR)是指臨床診斷檢測出的真陽性率與假陽性率之間的比值，即陽性似然比=靈敏度/(1-特異性）。[0015]陰性似然比（negativelikelihoodratio，NLR)是指臨床診斷檢測出的假陰性率與真陰性率之比值，值越小說明該診斷方法(或所涉及的標(biāo)志物)越好。[0016]診斷比值比（diagnosticoddsratio，D0R)是陽性似然比與陰性似然比的比值，數(shù)值越大表明診斷試驗(yàn)(所涉及的標(biāo)志物)區(qū)分患者與非患者的能力越大。[0017]其中，步驟(2)的meta分析，具體是通過將R0C曲線下面積、靈敏度、特異性、陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比變量進(jìn)行合并，采用層次綜合受試者工作特征曲線模型擬合SR0C曲線圖，分析匯總的miRNAs在區(qū)分腎癌患者和健康人方面的優(yōu)勢大小，進(jìn)而結(jié)合異質(zhì)性分析篩選出最優(yōu)的1種或多種作為候選miRNAs。[0018]目前研究認(rèn)為，血清/血漿miRNAs主要來源于腫瘤組織分泌的或者是腫瘤細(xì)胞死亡游離所致，但是，組織內(nèi)差異表達(dá)的miRNAs在血清/血漿中并不一定就差異表達(dá)，有的miRNAs甚至相反。本發(fā)明首次將所有已知、具有潛在腎癌早期診斷價(jià)值的循環(huán)miRNAs進(jìn)行綜合性meta分析評估，以判斷其真實(shí)診斷價(jià)值;并在血清/血楽;和組織生物樣本中，進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)差異和診斷價(jià)值，以達(dá)到最優(yōu)評價(jià)體系，以此篩選出的循環(huán)miRNAs生物指標(biāo)更具有臨床指導(dǎo)性，為今后開發(fā)早期診斷腎癌非侵入性生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)，具有重大的臨床實(shí)用價(jià)值。[0019]優(yōu)選地，上述篩選腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物的方法，步驟(1)中資料的納入標(biāo)準(zhǔn)包括:①患者為經(jīng)組織病理學(xué)確診的腎癌患者;②用于檢測miRNAs的外周血（即血清/血漿）在進(jìn)行臨床治療前采集;③納入檢測循環(huán)miRNAs并探討其與腎癌診斷相關(guān)性的研究;④所納入的研究必須提供足以進(jìn)行meta分析提取的數(shù)據(jù);⑤對照組為良性疾病人群或健康個體;排除標(biāo)準(zhǔn)包括:①綜述或致編者函;②重復(fù)報(bào)道論文中排除較小樣本量或較早發(fā)表的文獻(xiàn)(也就是說，如果查到論文有重復(fù)報(bào)道的，排除樣本量小的和時間早的那些，留下最新樣本量最大的那一篇就可以了）。[0020]優(yōu)選地，上述篩選腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物的方法，步驟(2)中采用Q檢驗(yàn)和計(jì)算I2值進(jìn)行異質(zhì)性分析時，Q檢驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)P>〇.05時，認(rèn)為研究是同質(zhì)的，反之不能認(rèn)為各研究間同質(zhì)；12>50%判斷為研究間存在異質(zhì)性；[0021]若各研究間是同質(zhì)的，采用Mantel-Haenszel方法計(jì)算固定效應(yīng)模型;若存在異質(zhì)性，貝采用DerSimonianandLaird的隨機(jī)效應(yīng)模型;發(fā)表偏倚采用Deeks'漏斗圖不對稱檢驗(yàn)，P〈0.10認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0022]本發(fā)明提供的一種腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物，其為miR-378。[0023]雖然在腎癌組織中已經(jīng)確定miR-378可作為標(biāo)志物，但是在外周血清/血漿樣本的報(bào)道中結(jié)果不一致，本發(fā)明的創(chuàng)新在于確定了血清/血衆(zhòng)miR-378與組織miR-378表達(dá)趨勢一致性，血清/血衆(zhòng)miR-378可作為診斷標(biāo)志物，而且是無創(chuàng)的，可以用于未來的臨床診斷。[0024]本發(fā)明還提供了上述腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物在制備腎癌診斷試劑中的應(yīng)用。[0025]本發(fā)明還提供了一種腎癌診斷試劑盒，其包括血清/血漿RNA提取試劑、miR-378檢測探針和PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑。[0026]其中，RNA提取試劑以及PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑可以直接選用現(xiàn)有市售商品，為現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)，miR-378檢測探針則可以根據(jù)公開的miR-378序列（SEQ:cuccugacuccagguccugugu)自行設(shè)計(jì)，探針序列的5'端需標(biāo)記焚光基團(tuán)，3'端需標(biāo)記淬滅基團(tuán)，以適合進(jìn)行TaqManprobe-basedqRT-PCR方法檢測。PCR焚光定量試劑用于進(jìn)彳丁TaqManprobe-basedqRT-PCR反應(yīng)，使用常規(guī)市售的商品試劑即可。[0027]本發(fā)明還提供了血清/血衆(zhòng)miR-378作為標(biāo)志物在篩查診斷腎癌中的應(yīng)用。[0028]本發(fā)明還提供了含有miR-378檢測試劑的試劑盒在篩查診斷腎癌中的應(yīng)用。[0029]本發(fā)明具有以下有益效果：[0030]本發(fā)明基于診斷性meta分析，優(yōu)化出簡約而恰當(dāng)?shù)姆治霾呗?，結(jié)合qRT-PCR方法驗(yàn)證及組織同血清/血漿表達(dá)一致性驗(yàn)證，篩選出適用于血清/血漿診斷的標(biāo)志物，是一種簡單有效的篩選方法。[0031]本發(fā)明提供的腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物，其在腎癌組織和血清/血漿中的表達(dá)一致，均表現(xiàn)異常顯著增高，是血清/血漿樣本診斷腎癌的非常可靠的標(biāo)志物，為臨床診斷提供了新途徑。[0032]本發(fā)明提供的試劑盒，使腎癌的臨床診斷簡便快捷、診斷結(jié)果可靠?！靖綀D說明】[0033]圖1.綜合評價(jià)循環(huán)miR-378對腎癌的診斷價(jià)值示意圖。圖中A為合并受試者工作特征曲線模型對循環(huán)中miR-378在腎癌患者和健康對照人群的診斷意義;B為合并診斷0R評價(jià)血漿miR-378甄別腎癌患者和健康對照人群的森林圖；C為合并敏感性評價(jià)血漿miR-378甄別腎癌患者和健康對照人群的森林圖;D合并特異性評價(jià)血衆(zhòng)miR-378甄別腎癌患者和健康對照人群的森林圖;E合并陽性似然比評價(jià)血衆(zhòng)miR-378甄別腎癌患者和健康對照人群的森林圖;F合并陰性似然比評價(jià)血衆(zhòng)miR-378甄別腎癌患者和健康對照人群的森林圖。[0034]圖2.獨(dú)立驗(yàn)證人群中血漿miR-378對于腎癌診斷價(jià)值評價(jià)。圖中A為血漿miR-378在腎癌患者和健康對照人群的表達(dá)差異;B為受試者工作特征曲線評價(jià)血衆(zhòng)miR-378甄別腎癌患者和健康對照人群的能力圖示。[0035]圖3.miR-378在腎癌組織中的表達(dá)模式圖。圖A為miR-378在腎癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織;圖B為腎癌組織和血清中的miR-378表達(dá)水平相關(guān)性分析?！揪唧w實(shí)施方式】[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。實(shí)施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)或者制造廠商所建議的條件進(jìn)行。[0037]實(shí)施例1篩選腎癌外周血miRNA標(biāo)志物[0038]1、匯總所有與腎癌相關(guān)、且具有潛在早期診斷價(jià)值的循環(huán)miRNAs[0039]截至2015年12月，在已有的開放數(shù)據(jù)庫PubMed中檢索與腎癌相關(guān)、并涉及到循環(huán)miRNAs的所有已發(fā)表文獻(xiàn)，主題詞或關(guān)鍵詞如下："circulating"或"serum"或"plasma"，"miRNA"或"microRNA"或"miR"，"kidney"或"renal"，以及"cancer"或"carcinoma"或"neoplasm"，并結(jié)合手工檢索方式參考會議紀(jì)要或引用文獻(xiàn)獲得符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)。文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)包括:①患者為經(jīng)組織病理學(xué)確診的腎癌患者;②用于檢測miRNAs的外周血(包括血漿、血清)在進(jìn)行臨床治療前采集;③納入檢測循環(huán)miRNAs并探討其與腎癌診斷相關(guān)性的研究;④所納入的研究必須提供足以進(jìn)行meta(表1)分析的數(shù)據(jù);⑤對照組為良性疾病人群或健康個體。排除標(biāo)準(zhǔn)包括:①綜述或致編者函;②重復(fù)論文中排除較小樣本量或較早發(fā)表的文獻(xiàn)。該部分由雙人獨(dú)立完成，待雙人仔細(xì)校正后無爭議文獻(xiàn)納入后續(xù)分析。[0040]參照以上文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，共有12篇文獻(xiàn)滿足要求。其中有4篇文獻(xiàn)報(bào)道的miRNAs為一組miRNAs，6篇非miR-378的，2篇只有差異表達(dá)沒有R0C曲線的，無法進(jìn)行后續(xù)的診斷性meta分析。因此，最終共4項(xiàng)關(guān)于miR-378的研究納入診斷性meta分析，見表1。[0041]表1候選4篇循環(huán)中的miR-378對腎癌診斷價(jià)值的文章[0042][0043]2、對候選循環(huán)中miR-378的診斷價(jià)值進(jìn)行診斷性meta分析[0044]使用Stata8.2和Meta-Disc1.4軟件完成診斷性meta分析。對R0C曲線下面積(areaunderROCcurve，AUC)、靈敏度、特異性、診斷比值比（diagnosticoddsratio，DOR)、陽性似然比（positivelikelihoodratio，PLR)和陰性似然比（negativelikelihoodratio,NLR)變量進(jìn)行合并。采用層次綜合受試者工作特征曲線模型(hierarchicalsummaryROCmodel，HSR0C)擬合SR0C(symmetricreceiveroperatorcharacteristic，SR0C)曲線圖。采用Q檢驗(yàn)和計(jì)算I2值進(jìn)行異質(zhì)性分析。Q檢驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)P>0.05時，認(rèn)為研究是同質(zhì)的；反之不能認(rèn)為各研究間同質(zhì)。I2值計(jì)算結(jié)果，12>50%提示研究間存在異質(zhì)性。另外，若各研究間是同質(zhì)的，采用Mantel-Haenszel方法計(jì)算固定效應(yīng)模型；若存在異質(zhì)性，則采用DerSimonianandLaird的隨機(jī)效應(yīng)模型。發(fā)表偏倚采用Deeks'漏斗圖不對稱檢驗(yàn)，P〈〇.10認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0045]嚴(yán)格遵循以上meta分析流程，對4項(xiàng)循環(huán)miR-378的研究進(jìn)行診斷性meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-378能夠較好地區(qū)分腎癌患者和健康人(合并AUC=0.82(0.73-0.91)見圖1。為此，后續(xù)對miR-378進(jìn)行獨(dú)立人群樣本驗(yàn)證。[0046]3、在獨(dú)立人群樣本中驗(yàn)證循環(huán)miR-378對腎癌的診斷價(jià)值[0047](1)采集血漿樣本[0048]收集92例血漿樣本，包括46例腎癌患者、46例健康個體(性別、年齡與腎癌樣本頻數(shù)匹配，基本信息見表2)，每位提供5ml新鮮血液，采用EDTA真空抗凝采血管采集血樣，離心機(jī)3000rpm，離心5min離心，后收集上層血漿，吸取上層血漿于1.5ml去RNA酶EP塑料管中，_80°C保存。所有腎癌病人都經(jīng)過兩名病理醫(yī)生的病理診斷，納入本研究前未患其它腫瘤，且未經(jīng)放射或化學(xué)藥物治療。病例和對照都使用統(tǒng)一的健康狀況調(diào)查表，以面對面的方式對病例和對照進(jìn)行現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、患者組織病理類型、臨床分級、分期等臨床相關(guān)信息。所有調(diào)查人員均經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)。[0049]表2獨(dú)立驗(yàn)證人群基本信息[0050][0051][0052](2)血漿miRNAs的提取[0053]使用LSReagent(Invitrogen)處理血衆(zhòng)，加入人工合成的線蟲cel-miR-39作為內(nèi)參，采用miRNeasyMiniKit(Qiagen)試劑盒提取血衆(zhòng)總miRNAs，-80°C|C存?zhèn)溆谩0054](3)逆轉(zhuǎn)錄血漿RNA[0055]米用TaqManmiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AppliedBiosystems)和miRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作參照ABI公司推薦的程序，其中部分進(jìn)行調(diào)整，反應(yīng)體系包括3yL5X的逆轉(zhuǎn)錄引物（同時加入5個逆轉(zhuǎn)錄引物，每次包含內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物）、1.5yL10X的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.15yL100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、lyL逆轉(zhuǎn)錄酶(5〇υ/μ1)、0.19yL的RNA抑制劑，共5.84μ1，每個反應(yīng)體系中加入9.16yLRNA，總反應(yīng)體系為15μ1。該方法的反應(yīng)條件為：16°C反應(yīng)30min，42°C反應(yīng)30min，最后85°C孵育5min。[0056](4)實(shí)時熒光定量PCR[0057]采用TaqMan探針法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，具體操作參照ABI公司推薦的程序，其中部分進(jìn)行調(diào)整，反應(yīng)體系包括:〇.25yL20XmiRNA檢測探針、2.5yL2XMasterMix、1.25yL雙蒸水、lyL稀釋后的cDNA，共5μ1，每個miRNA檢測實(shí)施4平行，以人工合成的線蟲cel-miR-39為內(nèi)參。使用ABIPrism7900熒光定量PCR儀檢測，其反應(yīng)條件:95°C反應(yīng)10min、95°C反應(yīng)15sec、60°C反應(yīng)lmin，40個循環(huán)。[0058](5)結(jié)果分析[0059]實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，Ct值系指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。目的miRNAs起始拷貝數(shù)越多，則Ct值越小，反之則越大。在目的miRNAs與內(nèi)參擴(kuò)增效率相同的情況下可以直接得到目的miRNAs相對于內(nèi)參的定量ACt=Ct目的-Ct內(nèi)參，AACt=ACt病例-ACt對照。使用SDS2.4軟件分析qRT-PCR數(shù)據(jù)，采用SPSS16.0軟件做進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。采用風(fēng)險(xiǎn)評分系統(tǒng)、繪制R0C曲線和計(jì)算AUC評價(jià)目標(biāo)miRNAs對腎癌診斷價(jià)值。[0060]在46例腎癌患者和46例健康人群血漿中發(fā)現(xiàn)，miR-378在腎癌患者血漿中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人群(P〈〇.001，圖2中A)A0C曲線分析顯示，腎癌患者血清中miR-378能夠顯著甄別患者人群，其AUC=0.82(0.73-0.91)，見圖2中B;另外，miR-378表達(dá)閾值為2.53時，診斷腎癌的靈敏度和特異性分別為85%和86.2%。[0061]4、檢驗(yàn)miR-378在腎癌組織和血漿中表達(dá)一致性[0062]同時檢測46病腎癌和癌旁正常組織miR-378的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，miR-378在腎癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（圖3中A)，進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)腎癌組織和血清中的miR-378表達(dá)水平相關(guān)（圖3中B)。因此可以判斷，無論在腎癌組織還是血漿樣本中，miR-378表達(dá)模型一致，均表現(xiàn)異常顯著增高。[0063]以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種篩選腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)搜集匯總與腎癌相關(guān)miRNAs資料；(2)對匯總的miRNAs分別進(jìn)行診斷性meta分析，meta分析包括ROC曲線下面積、靈敏度、特異性、陽性似然比、陰性似然比和診斷比值比；采用Q檢驗(yàn)和計(jì)算I2值進(jìn)行異質(zhì)性分析;篩選出綜合分析結(jié)果最優(yōu)的1種或多種miRNAs作為候選miRNAs;(3)采用TaqManprobe-basedqRT-PCR方法，對候選miRNAs進(jìn)行人群血清/血衆(zhòng)樣本驗(yàn)證，篩選出腎癌患者相對健康人血清/血漿中表達(dá)閾值2.53以上小于3.12的miRNAs;(4)檢驗(yàn)步驟(3)篩選出的miRNAs在腎癌組織和血清/血漿中的表達(dá)一致性，表達(dá)一致的，則該miRNA標(biāo)志物為目標(biāo)標(biāo)志物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選腎癌血清/血漿miRNA標(biāo)志物的方法，其特征在于，步驟(1)中資料的納入標(biāo)準(zhǔn)包括:①患者為經(jīng)組織病理學(xué)確診的腎癌患者;②用于檢測miRNAs的外周血在進(jìn)行臨床治療前采集;③納入檢測循環(huán)miRNAs并探討其與腎癌診斷相關(guān)性的研究;④所納入的研究必須提供足以進(jìn)行meta分析提取的數(shù)據(jù);⑤對照組為良性疾病人群或健康個體;排除標(biāo)準(zhǔn)包括:①綜述或致編者函;②重復(fù)論文中排除較小樣本量或較早發(fā)表的文獻(xiàn)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選腎癌血清/血漿miRNA標(biāo)志物的方法，其特征在于，步驟(2)中采用Q檢驗(yàn)和計(jì)算I2值進(jìn)行異質(zhì)性分析時，Q檢驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)P>0.05時，認(rèn)為研究是同質(zhì)的，反之不能認(rèn)為各研究間同質(zhì)；12>50%判斷為研究間存在異質(zhì)性；若各研究間是同質(zhì)的，采用Mantel-Haenszel方法計(jì)算固定效應(yīng)模型；若存在異質(zhì)性，則采用DerSimonianandLaird的隨機(jī)效應(yīng)模型；發(fā)表偏倚采用Deeks'漏斗圖不對稱檢驗(yàn)，P〈0.10認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.一種腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物，其特征在于，為miR-378。5.權(quán)利要求4所述的腎癌血清/血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物在制備腎癌診斷試劑中的應(yīng)用。6.-種腎癌診斷試劑盒，其特征在于，包括血清/血漿RNA提取試劑、miR-378檢測探針、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR熒光定量試劑。7.血清/血衆(zhòng)miR-378作為標(biāo)志物在篩查診斷腎癌中的應(yīng)用。8.含有miR-378檢測試劑的試劑盒在篩查診斷腎癌中的應(yīng)用?！疚臋n編號】C12Q1/68GK105907875SQ201610410997【公開日】2016年8月31日【申請日】2016年6月13日【發(fā)明人】徐華,唐焜【申請人】武漢泰安康生物科技有限公司