本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用BsmAI鑒定人乳腺癌LINC-ROR基因rs4801078多態(tài)性的方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,包括剪輯的置換/插入和缺失等形式。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種,現(xiàn)已廣泛用于簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析/關(guān)聯(lián)分析及疾病易感基因的定位,指導(dǎo)易感基因克隆.較常見的單堿基多態(tài)性位點的檢測方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP),三引物等位基因擴增法(TP-PCR)和測序等方法。這些方法雖各有優(yōu)點,但也各有其不足之處。

PCR-RFLP是一種快速、簡便、準確的檢測SNP基因型的經(jīng)典方法。其原理是：限制性內(nèi)切酶是一類識別DNA特異位點(通常4-6bp),并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的特異性意味著對特定等位基因的完全消化會產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的置換，插入和缺失可以產(chǎn)生或消除一個特定酶切位點，從而改變酶切后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個限制性內(nèi)切酶位點，則可以通過對PCR產(chǎn)物進行酶切、電泳加以檢測。該方法的優(yōu)點在于快速簡單，終點判斷準確。但其主要缺點在于酶切位點的選擇，要求待測多態(tài)性位點和某一酶切位點相關(guān)。PCR-RFLP酶的選擇具有局限性，并不是所有的SNP位點都可以用這種方法來鑒別，且部分內(nèi)切酶價格昂貴，實驗成本高。三引物等位基因擴增法(TP-PCR)一種不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的重組DNA方法。反應(yīng)體系中有2種模板和3種引物,從而在同一個反應(yīng)體系中產(chǎn)生一個重組DNA分子。這種方法的主要優(yōu)點是快速，不依賴連接片段的限制酶位點。但其缺點是擴增效率低，擴增特異性差，無法保證PCR產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性，分型結(jié)果易造成誤判。Taqman熒光探針法是一種新型高效準確的基因分型方法，其優(yōu)點是檢測靈敏度高，分型準確。但該方法需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高。

LINC-ROR(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA,Regulator Of Reprogramming)屬于長鏈非編碼RNA，位于人類18號染色體。LINC-ROR已被確定為促進誘導(dǎo)人類多能干細胞(iPSCs)，被認為在miRNA介導(dǎo)的人類胚胎干細胞的自我更新中抑制核轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)報道，作為一種競爭性內(nèi)源性RNA，lincRNA ROR通過與miR-145結(jié)合在三陰性乳腺癌的發(fā)生、侵襲過程發(fā)揮重要作用。此外，lincRNA ROR也可以與miR-145競爭性結(jié)合在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌干細胞分化的過程中發(fā)揮作用。

LINC-ROR基因rs4801078位點多態(tài)性在人群中存在三種基因型：TT型(人基因組rs4801078多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為T)，CT型(人基因組rs4801078多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為C和T)和CC型(人基因組rs4801078多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為C)(美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

目前人LINC-ROR基因多態(tài)rs4801078的鑒定常采用PCR-RFLP方法。但是目前鑒定人LINC-ROR基因多態(tài)rs4801078時常使用的限制性內(nèi)切酶價格昂貴(關(guān)于部分內(nèi)切酶的參考價格可參考后面的表1)，實驗成本高，難以在實驗室中普及使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的用BsmAI鑒定人乳腺癌LINC-ROR基因rs4801078多態(tài)性的方法，通過PCR-RFLP技術(shù)的改進，開發(fā)經(jīng)濟、快速的檢測人LINC-ROR rs4801078基因多態(tài)性的試劑盒。

其技術(shù)方案如下：

一種用BsmAI鑒定人乳腺癌LINC-ROR基因rs4801078多態(tài)性的方法，包括以下步驟：

(a)抽提樣品基因組DNA；

(b)提供擴增人LINC-ROR基因多態(tài)性rs4801078位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，獲取擴增產(chǎn)物；

(c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴增產(chǎn)物進行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；

(d)將酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖凝膠進行電泳，以判定LINC-ROR基因多態(tài)性rs4801078位點的各基因型。

進一步，步驟(b)中所述正向引物和反向引物的設(shè)計與合成具體為：堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取，在CHIP網(wǎng)站上進行核對，確定LINC-ROR多態(tài)位點堿基變異數(shù)據(jù)，含LINC-ROR rs4801078的部分基因序列如如SEQ:ID:NO:1所示，基因序列的第501個堿基Y代表了C/T多態(tài)，即為rs4801078的多態(tài)性位點。根據(jù)rs4801078的具體序列和多態(tài)性堿基的位置采用Primer Premier 6.0設(shè)計出的最有上下游引物SEQ:ID:NO:2、SEQ:ID:NO:3所示；

其中正向引物序列中倒數(shù)第三位堿基為錯配堿基G，錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由TAAAGAC或TAAAGAT更改為TAGAGAC或TAGAGAT,因此擴增產(chǎn)物中C等位基因片段可被識別GTCTCN序列的限制性內(nèi)切酶BsmAI識別，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型，

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用固相合成法，或者委托生物公司合成并檢測正向和反向引物。

進一步，步驟(b)中PCR擴增反應(yīng)中制備PCR擴增體系具體為：2×Taq PCR Mix7.5μl，雙蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混勻后即得15.0μlPCR擴增反應(yīng)體系；按照第一階段：94℃變性5min，第二階段共包括35個循環(huán)三個步驟，首先94℃變性30s，56.1℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三階段：72℃延伸5min，最終4℃儲存以備用，即得長為109bp的PCR擴增產(chǎn)物，擴增后的產(chǎn)物序列如SEQ:ID:NO:4所示。

進一步，步驟(c)中進行酶切的酶切體系具體為：：PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計15μl酶切體系，于水浴鍋中37℃酶切6-14h，即得酶切產(chǎn)物，選擇BsmAI進行酶切鑒定。

進一步，步驟(d)瓊脂糖凝膠電泳，確定基因多態(tài)性具體為：將酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠在4-10V/cm的條件下，電泳20-40min，至紫外燈下能分清明顯的條帶后并拍照鑒定。對于不同的基因型，rs4801078位點不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶，CC野生基因型，長為88bp及21bp兩條帶；CT雜合基因型，長為109bp，88bp及21bp三條帶；TT突變基因型，109bp一條帶。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用創(chuàng)造酶切位點法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)，利用引物堿基錯配技術(shù)設(shè)計檢測LINC-ROR多態(tài)性rs4801078。由于這種方法應(yīng)用了引物3’端錯配技術(shù)，PCR產(chǎn)物進行酶切電泳后即可進行基因型的鑒定工作，因此在實際運用中具有很大的靈活性，且檢測方法簡單易行，是一種進行單堿基突變位點基因型鑒定的較好方法。本發(fā)明建立的LINC-ROR多態(tài)性rs4801078基因分型方法簡單、快速、安全、準確、靈敏度高，值得在臨床和研究中推廣，并可借鑒用于其它多態(tài)性基因的分型。

附圖說明

圖1是LINC-RORrs4801078位點的電泳圖譜；

圖2是LINC-RORrs4801078位點CC基因型測序圖譜(反向測序)；

圖3是LINC-RORrs4801078位點CT基因型測序圖譜(反向測序)；

圖4是LINC-RORrs4801078位點TT基因型測序圖譜(反向測序)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

本發(fā)明的方法包括以下步驟：

(a)抽提樣品基因組DNA；

(b)提供擴增人LINC-ROR基因多態(tài)性rs4801078位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，獲取擴增產(chǎn)物

(c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴增產(chǎn)物進行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；

(d)將酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖凝膠進行電泳，以判定LINC-ROR基因多態(tài)性rs4801078位點的各基因型。

其中，所述正向引物其3’末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs4801078堿基相鄰一個堿基，倒數(shù)第三位堿基為錯配堿基G，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)T等位基因形成GTCTC結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的方法可以通過引物上的錯配堿基將SNP附近的序列改變?yōu)榭杀活A(yù)先確定的限制性內(nèi)切酶識別的序列。因此，可以克服傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂貴內(nèi)切酶的缺陷，進而大大降低了檢測SNP的成本。具體原理：由于在該正向引物序列中倒數(shù)第三位堿基為錯配堿基G(該堿基在人LINC-ROR基因序列中的相應(yīng)位置為A)，因此錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由ATAAAGAC更改為ATAGAGAC。因此擴增產(chǎn)物中C等位基因片段可被識別GTCTCN序列的限制性內(nèi)切酶識別(即C等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)；進而，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型。更具體地，經(jīng)序列分析可知，基因原始序列中C/T多態(tài)可由表1中前兩種內(nèi)切酶識別。如通過堿基錯配PCR將多態(tài)性位點前面第四位堿基A改變?yōu)镚，則該多態(tài)為C等位基因經(jīng)PCR擴增后包含GTCTCN序列可被識別GTCTCN序列的限制性內(nèi)切酶BsmAI識別，而T等位基因不能切開。

經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測該G/T多態(tài)的方法可使用表1中的三種酶，其中表中前兩種酶價格昂貴，且酶切效果不理想。在采用創(chuàng)造酶切位點法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)對反向引物序列中倒數(shù)第三位堿基錯配為T后，PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列生成ATGCAT序列，從而可被限制性內(nèi)切酶BsmAI識別。由于識別特定位點的限制性內(nèi)切酶BsmAI適用范圍廣，價錢較為經(jīng)濟，進而大大降低了檢測SNP的成本。因此，綜合考慮簡單操作性與經(jīng)濟實用性，限制性內(nèi)切酶BsmAI是不二選擇。

表1中提供的限制性內(nèi)切酶的價格從NEB公司(http://www.neb-china.com)，限制性內(nèi)切酶的選擇從WatCut限制性內(nèi)切酶分析軟件上獲取(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php？act＝snp_new)，以此作為限制性內(nèi)切酶識別位點和價格的參考。

表1 幾種限制性內(nèi)切酶識別序列及其價格

在本發(fā)明的實施方案中，正向引物和反向引物的設(shè)計采用Primer6.0軟件進行，設(shè)計的原則綜合考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度以及擴增效率的影響。按照堿基互不配對的原則設(shè)計引物，引物長度一般在15～30堿基之間，過長或過短均會造成特異性差，過長還會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。引物GC含量在40％～60％之間，Tm值最好接近72℃，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機分布，引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3′端△G值較低。擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物應(yīng)具有特異性，引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行BLAST檢測，以確保其與其它基因不具有互補性。

最終正向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成：ATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAG；

反向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成：TCTAAGGGACAGAATAAATAATCGT。

正向引物和反向引物的設(shè)計主要考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度和擴增效率的影響。通常按照堿基互補配對原則設(shè)計引物，引物與模板的序列要緊密互補。引物長度為15-30bp,過短或過長可導(dǎo)致特異性差，過長亦會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃而不利于PCR反應(yīng)。反向引物在其3’末端倒數(shù)第三位含有錯配堿基T，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)T等位基因形成ATGCAT結(jié)構(gòu)，從而可以被BsmAI內(nèi)切酶識別。擴增產(chǎn)物總長度為109bp，擴增產(chǎn)物如下：

ATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAGAYGTTTTTCAATCTATTCCAATGTTTAGTGGAACATCTGAAA GTCACATAGAGCACGGGACGATTATTTATTCTGTCCCTTAGA下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第27位bpY代表C/T多態(tài)即SNP位點rs4801078。第23位bp為錯配后的堿基G(原為堿基A)。該長為109bp的擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsmAI酶切后可產(chǎn)生109bp，88bp(該片段上游序列相比下游序列由于BsmAI酶切產(chǎn)生的粘性末端增加3個單鏈堿基)，21bp(該片段上游序列相比下游序列由于BsmAI酶切產(chǎn)生的粘性末端減少3個單鏈堿基)共三種片段類型?；蛐团卸ńY(jié)果：CC野生基因型，長為88bp及21bp兩條帶；CT雜合基因型，長為109bp，88bp及21bp三條帶；TT突變基因型，109bp一條帶。

凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖(Agarose)是一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的，可用于DNA片段的電泳。聚丙烯酰胺凝膠主要有兩種方式：一是用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠，二是用于分離及純化單鏈DNA片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。但綜合考慮實用性、便利性以及經(jīng)濟性，使用瓊脂糖凝膠電泳不失為一種最佳選擇。在本發(fā)明中，引物擴增條件如圖1所示，目的擴增產(chǎn)物使用限制性核酸內(nèi)切酶BsmAI 3U水浴鍋中酶切6-14h。酶切產(chǎn)物采用3％的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型。

下面將本發(fā)明的具體實施方案予以詳細的描述，但需要強調(diào)的是，本項發(fā)明并不受限于所述的具體實施方式。

在本發(fā)明的具體實施方案中，本發(fā)明檢測人乳腺癌LINC-ROR基因多態(tài)rs4801078的具體步驟如下：

(l)提取待測人基因組DNA模板，所述人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人基因組模板。

(2)PCR擴增基因組DNA，對提取的模板基因組DNA進行PCR擴增，獲得含多態(tài)附近序列的PCR產(chǎn)物。

(3)對PCR擴增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BsmAI進行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物；

(4)酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型，雜合基因型以及突變純合基因型。

下面對上述各個主要步驟進行詳細描述：

(1)引物設(shè)計與合成

堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取，在CHIP網(wǎng)站上進行核對，確定LINC-ROR多態(tài)位點堿基變異數(shù)據(jù).

含LINC-RORrs4801078的部分基因序列如下：

GCCACACGGGAAGTCCCCAGCCAGCTTGTACAGAGAAATCAAACTTTAGAACAGTCCCCAGGGAGAAGGAAGAAAGTGGGAAtcctgatacccaatggccaaagttcattccatggggaattgactctcctgtacttctgggttatgttatctggtcccttggcaactgagcaggaagccagatcacacctccttgagcgtggcctgttatgtgatgctagaagcaacagaagcattctgagattcacggcacaagggcacatggctggtggggcttaggtggtggaatgaggatgccttgttgagactcaggtggagcagaaagctgaaagcccaggtggcaaggtgcagcgaagagaatctgaggagatgaatatgctgtgtccgatccaATATAGTGATTGCAATCCTGGAAGACCCGTTGTATGTTAAAACCTTTTAAATTTTTTATGTTTATATATGAAAAAGAGTTACATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAGAYGTTTTTCAATCTATTCCAATGTTTAGTGGAACATCTGAAAGTCACATAGAGCACGGGACGATTATTTATTCTGTCCCTTAGATTTCAGGAAAATGATCACTGATATTTGtaagttttaggccttgttctaggggctttgtaaaggttgattcacagcatgtgcacaacaatcttgggaggtaggcatggttattattgccattttacagatgaggaaactgaggccagagaagttTACACAGCCAATCAGTGCTAGAACTGTGATTGGAACTCAGGGGTCTGGATCTTCAGCGGTTCCAGTCTTCATCCTCTAAATGCCACTGGTATCTCCTCTACCAATTGTTGGGACAAGAAACACACTCCCAGAAATTTCTCCCCAGCCCATGGGAGCAGTATGTTCCCCACAGGCCCTTTGCACAGTTCACAGATGGACACATGGCCCCCAGGGAGCTGGGCCTGCTGGGGCCACCACCTAGAGCCCCAGGTTTACTAACCCTGAG

基因序列的第501個堿基Y代表了C/T多態(tài)，即為rs4801078的多態(tài)性位點。根據(jù)rs4801078的具體序列和多態(tài)性堿基的位置采用Primer Premier 6.0設(shè)計出的最有上下游引物如下；

正向引物序列：5’-ATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAG-3’

反向引物序列：5’-TCTAAGGGACAGAATAAATAATCGT-3’。

其中正向引物序列中倒數(shù)第三位堿基為錯配堿基G(該堿基在人LINC-ROR基因序列中的相應(yīng)位置為A)，因此錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由TAAAGAC或TAAAGAT更改為TAGAGAC或TAGAGAT(其中第七個堿基C/T多態(tài)位點，第三個堿基T為錯配堿基)。因此擴增產(chǎn)物中C等位基因片段可被識別GTCTCN序列的限制性內(nèi)切酶BsmAI識別(即C等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。進而，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型。

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用本領(lǐng)域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成并檢測正向和反向引物。

(2)制備PCR擴增體系：2×Taq PCR Mix7.5μl，雙蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混勻后即得15.0μlPCR擴增反應(yīng)體系；按照第一階段：94℃變性5min，第二階段共包括35個循環(huán)三個步驟，首先94℃變性30s，56.1℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三階段：72℃延伸5min，最終4℃儲存以備用，即得長為109bp的PCR擴增產(chǎn)物。擴增后的產(chǎn)物序列為：

ATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAGAYGTTTTTCAATCTATTCCAATGTTTAGTGGAACATCTGAAA GTCACATAGAGCACGGGACGATTATTTATTCTGTCCCTTAGA下劃線部分分別為正向引物和反向引物，第27位bpY代表C/T多態(tài)即SNP位點rs4801078。第23位bp為錯配后的堿基G(原為堿基A)。

(3)酶切體系：PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，限制性內(nèi)切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計15μl酶切體系，于水浴鍋中37℃酶切6-14h，即得酶切產(chǎn)物。綜合考慮經(jīng)濟實用性以及簡單操作性最終選擇BsmAI進行酶切鑒定。

(4)瓊脂糖凝膠電泳，確定基因多態(tài)性：將酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠在4-10V/cm的條件下，電泳20-40min，至紫外燈下能分清明顯的條帶后并拍照鑒定。對于不同的基因型，rs4801078位點不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見圖1)，CC野生基因型，長為88bp及21bp兩條帶；CT雜合基因型，長為109bp，88bp及21bp三條帶；TT突變基因型，109bp一條帶。各基因型均經(jīng)測序以進一步鑒定，測序結(jié)果(見圖2-4)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測得的結(jié)果完全相同。

實施例1.人乳腺癌外周血全血標本測定人LINC-ROR rs4801078多態(tài)性

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

儀器：BCD-228CH冰箱(新飛電器)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(華峰儀器)，SmartGe凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè))，GT9612梯度PCR儀(百泰克生物)，WD900SL23-2型號微波爐(格蘭仕電器)，DG-300C型電泳儀(鼎國昌盛生物)等。

試劑：NEP004-1DNA提取試劑盒(鼎國昌盛生物)，50bp DNA Ladder(萊風生物)，2×Taq PCR Mix(萊風生物)，BsmAI(Thermo)，瓊脂糖(SIGMA)等。

1.2引物設(shè)計

在NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中，查找LINC-RORrs4801078的核苷酸序列，在引物設(shè)計軟件Primer Premier 6.0中，設(shè)置引物長度和擴增目的片段長度等參數(shù)進行引物設(shè)計，根據(jù)GC含量和退火溫度等選擇最優(yōu)上下游引物，其中正向引物序列中倒數(shù)第三位堿基為錯配堿基G(該堿基在人LINC-ROR基因序列中的相應(yīng)位置為A)，因此錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由TAAAGAC或TAAAGAT更改為TAGAGAC或TAGAGAT(其中第七個堿基C/T多態(tài)位點，第三個堿基T為錯配堿基)。因此擴增產(chǎn)物中C等位基因片段可被識別ATGCAT序列的限制性內(nèi)切酶BsmAI識別(即C等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。再將此引物與Pubmed中的Blast序列比對功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行引物比對，最終確定的上下游引物為正向引物序列：5’-ATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAG-3’，反向引物序列：5’-TCTAAGGGACAGAATAAATAATCGT-3’。

1.3限制性內(nèi)切酶的選擇

根據(jù)dbSNP中rs4801078前后五個位點的堿基序列，用WatCut在線限制性內(nèi)切酶分析軟件，在線搜索獲得可識別突變位點的限制性內(nèi)切酶的信息，綜合考慮其酶切特異性及經(jīng)濟適用性選擇最佳的限制性內(nèi)切酶BsmAI。

1.4從人乳腺癌全血中提取待測樣本的基因組DNA

嚴格按照離心柱型DNA提取試劑盒操作步驟提取人基因組DNA。

l)在1.5ml離心管中加入300μl人血細胞后，再加入900μl細胞裂解液混和均勻，在冰上放置10min后，在離心機中12000rpm離心1min，棄上清，再次加入900μl細胞裂解液，用槍吹起沉淀并混勻后，重復(fù)上述步驟；

2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液槍輕輕吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混勻，在70℃水浴鍋中放置10min后，12000rpm離心5min。

3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號的新的離心管中，再向新的離心管中加入500μl無水乙醇，期間可能會出現(xiàn)絮狀沉淀物，該絮狀物即為DNA；

4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完，可分次轉(zhuǎn)入)，室溫靜置2min，再12000rpm離心1min，棄廢液；

5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄廢液；

7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液；

8)再次離心2min，將離心柱置于新的編過號的離心管中，敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味；

9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl，室溫放置5min，12000rpm離心1min，重復(fù)上述步驟一次，終離心后的液體即為提取出的基因組DNA；

10)吸取2μl提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度計測定其濃度和純度。

2結(jié)果

2.1PCR擴增

(1)根據(jù)提取人基因組DNA的濃度，將研究對象的DNA進行稀釋，使終濃度為20μg/μl。

(2)PCR擴增體系為2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl，最后用雙蒸水補充總體積至15μl。

(3)PCR反應(yīng)條件：第一個階段為預(yù)變性階段，94℃/5min；第二個階段包括3個步驟共35個循環(huán)，依次設(shè)置為94℃/35s、58℃退火時間45s、72℃/30s；第三個階段72℃/5min。

2.2酶切反應(yīng)

酶切體系為PCR擴增產(chǎn)物5μl、限制性內(nèi)切酶0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用雙蒸水補充總體積至15μl?；靹蚝笾糜谒″佒?7℃水浴4-16小時。

2.3基因型的判定

表2 rs4801078位點基因型判定

實施例2.人乳腺癌組織標本測定人LINC-RORrs4801078多態(tài)性

與實施例1的步驟基本相同，只是采用下面的方法從乳腺癌組織標本中提取DNA作為待測DNA。

使用手機切除乳腺癌組織，酚-氯仿法提取乳腺癌組織基因組DNA作為待測DNA。

1)將乳腺癌組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取0.1g左右的組織碾磨，加入1ml的滅菌水，顛倒混勻，10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清。管底應(yīng)該有沉淀。重復(fù)兩次

2)加入200ul的DNA裂解液，5ul的蛋白酶K混勻，55度過夜消化。

3)消化完成后加入等體積的酚氯仿混合液(1:1)，劇烈震蕩，使其變成奶咖色。12000轉(zhuǎn)離心10分鐘。

4)取上清，注意不要洗到中間介質(zhì)以及下層液體。加入等體積的氯仿，顛倒混勻。12000轉(zhuǎn)離心10分鐘。

5)取上清，注意不要洗到中間介質(zhì)以及下層液體。加入10分之一的醋酸鈉以及2.5倍的無水乙醇，顛倒混勻。

6)12000轉(zhuǎn)離心10分鐘。棄上清。

7)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀懸浮，顛倒混勻數(shù)次。12000轉(zhuǎn)離心10分鐘。

8)棄上清，然后室溫開蓋靜置分鐘使其乙醇揮發(fā)干凈。

9)加入滅菌水溶解DNA，一般加入50ul滅菌水溶解

10)-20℃保存，即得乳腺癌組織基因組DNA

結(jié)果：將酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠電泳20-40min，至紫外燈下能分清明顯的條帶并拍照鑒定。對于不同的基因型，rs4801078位點不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見圖1)，CC野生基因型，長為88bp及21bp兩條帶；CT雜合基因型，長為109bp，88bp及21bp三條帶；TT突變基因型，109bp一條帶。各基因型均經(jīng)測序以進一步鑒定，測序結(jié)果(見圖2-4)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測得的結(jié)果完全相同。

從上述實施例可以看出，本發(fā)明針對使用CRS-PCR鑒定LINC-ROR rs4801078多態(tài)性，對傳統(tǒng)PCR-RFLP法進行改進，應(yīng)用了引物3’端錯配技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR-RFLP法內(nèi)切酶選擇余地小，價格昂貴，實驗成本高等缺點，本研究建立的LINC-ROR rs4801078多態(tài)性的檢測方法，內(nèi)切酶價格十分便宜，同時PCR產(chǎn)物純度較高，酶切結(jié)果易于分辨。該檢測方法通過測序驗證，其結(jié)果準確可靠。

SNP檢測技術(shù)已經(jīng)很成熟，較常見的單堿基多態(tài)性位點的檢測方法包括測序、三引物等位基因擴增法(TP-PCR)、聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)等方法。這些方法雖各有優(yōu)點，但也各有其不足之處。測序可以直接測出DNA序列中的所有突變位點的堿基替代情況，但該方法需要昂貴的儀器和較長的步驟,成本較高；TP-PCR方法準確性低，結(jié)果易造成誤判；PCR-RFLP方法比較成熟，但要求待測多態(tài)性位點和某一酶切位點相關(guān)，酶的選擇具有局限性，往往成本較高。

因此，鑒于本發(fā)明所使用的限制性內(nèi)切酶價格低廉，且引物合成以及各試劑均較為經(jīng)濟，加之CRS-PCR操作簡單，重復(fù)性好，因此是最經(jīng)濟有效的基因型檢測方法。

本發(fā)明對傳統(tǒng)PCR-RFLP技術(shù)進行改進，采用創(chuàng)造酶切位點法(Created Restriction Site PCR,CRS-PCR)，利用引物堿基錯配技術(shù)設(shè)計檢測LINC-ROR多態(tài)性rs4801078。由于這種方法應(yīng)用了引物3’端錯配技術(shù),PCR產(chǎn)物進行酶切電泳后即可進行基因型的鑒定工作，因此在實際運用中具有很大的靈活性,且檢測方法簡單易行，是一種進行單堿基突變位點基因型鑒定的較好方法。本項發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵點是設(shè)計出的LINC-ROR多態(tài)性rs4801078的上下游引物，正向引物序列：5’-ATTTCAAGCTCAGATCACTATAGAG-3’，反向引物序列：5’-TCTAAGGGACAGAATAAATAATCGT-3’以及限制性內(nèi)切酶BsmAI的使用?？傊?，本發(fā)明建立的LINC-ROR多態(tài)性rs4801078基因分型方法簡單、快速、安全、準確、靈敏度高，值得在臨床和研究中推廣，并可借鑒用于其它多態(tài)性基因的分型。

以上所述，僅為本發(fā)明最佳實施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。