本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及人NEURL1B在制備前列腺癌診斷產(chǎn)品中的應用。
背景技術：
：前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠遠低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠處轉移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時，病變已達晚期，預后不良。前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸指檢、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。PSA(ProstateSpecificAntigen)為前列腺組織特異性抗原，由前列腺的解剖結構可知PSA通過前列腺導管進入血液和尿液中，一些病例或生理情況下PSA會進入血液中去，如前列腺炎癥、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通過檢測血清PSA水平來預測前列腺癌具有一定的假陽性率。從1991年開始，檢測血清中PSA含量用于預測前列腺癌，含量高于4ng/mL認為是前列腺癌陽性，靈敏度79％，特異性20％-59％，平均靈敏度約33％，在濃度4-10ng/mL灰區(qū)部分，特異性是最低的，這時往往需要通過侵入性的穿刺活檢進行確定，給患者帶來極大痛苦及精神和經(jīng)濟負擔。所以PSA并不能較好的作為診斷前列腺癌的標志物。直腸指檢是最簡單、最經(jīng)濟實用的方法，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用以發(fā)現(xiàn)很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機會。但以上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個方面：(1)患者前列腺腫塊不大時，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治；(3)患者直腸有疾患時不能使用此檢測；(4)醫(yī)生經(jīng)驗不足時可能有漏診或者誤診的可能。目前，對于中晚期前列腺癌患者，手術治療的效果差，大多數(shù)采用藥物治療。根據(jù)不同的病情可以采用化學藥物治療、外放射治療、放射性核素內(nèi)放射治療以及各種療法的綜合應用等。然而，放化療藥物不僅作用于腫瘤，還可以作用于腫瘤周圍健康的組織，因而在殺傷腫瘤的同時，也給機體帶來了很大的副作用，最終影響對腫瘤的治療效果。因此，本領域迫切需要開發(fā)早期判斷前列腺癌的特異性標志物，并開發(fā)前列腺癌的靶向藥物。技術實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預，本發(fā)明的目的在于提供一種新的前列腺癌相關mRNA，以及該mRNA的表達產(chǎn)物。本發(fā)明的目的還在于提供前列腺癌相關mRNA或其表達產(chǎn)物在用于制備前列腺癌診斷產(chǎn)品中的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供NEURL1B或其表達產(chǎn)物在用于制備前列腺癌診斷產(chǎn)品中的應用。優(yōu)選地，所述NEURL1B或該mRNA的表達產(chǎn)物在前列腺癌組織中表達上調(diào)。進一步地，所述診斷產(chǎn)品包括檢測試劑或試劑盒。優(yōu)選地，所述檢測試劑包括NEURL1B的特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯片。其中，所述檢測試劑包括：(1)抗NEURL1B蛋白的特異性抗體；和/或(2)特異性擴增NEURL1B的引物。其中，所述抗NEURL1B蛋白的特異性抗體可使用市售品的抗體，也可由公知的方法制造。進一步地，本發(fā)明提供了一種用于檢測前列腺癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴增前列腺癌相關mRNA的引物和說明書，所述前列腺癌相關mRNA是NEURL1B。優(yōu)選地，所述引物具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。優(yōu)選地，所述的說明書中注明以下內(nèi)容：當檢測對象的前列腺癌細胞或組織中NEURL1B表達量E1與正常前列腺細胞或組織的NEURL1B表達量E2之比≥2，則提示該檢測對象前列腺癌的幾率高于普通人群。所述的E1是檢測對象的前列腺癌細胞或組織的NEURL1B表達量；所述的E2是正常人群的正常前列腺細胞或組織的NEURL1B表達量。所述的正常前列腺細胞或組織包括癌旁的前列腺細胞或組織。所述的表達量是相對于對照基因(如GAPDH)的相對表達量。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen熒光染料。進一步地，本發(fā)明提供了一種NEURL1B抑制劑，所述抑制劑包括NEURL1B的抗體、NEURL1B核酸的反義RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及NEURL1B的活性抑制劑。優(yōu)選地，所述治療前列腺癌的抑制劑含有下列中的一組或幾組siRNA：SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。更優(yōu)選的，所述治療前列腺癌的抑制劑含有siRNA序列為SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。進一步地，上述抑制劑在制備預防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物組合物中的應用。優(yōu)選地，所述的藥物組合物包括NEURL1B抑制劑作為活性成分，和藥學上可接受的載體。所述載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。優(yōu)選地，所述的藥物通過選自下組的用藥方式進行給藥：口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用藥。所述的藥物的制劑選自下組：片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、噴霧劑。所述的NEURL1B抑制劑以0.01-20mg/kg體重的劑量(每次或每天)施用于哺乳動物。所述的哺乳動物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，為人。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與前列腺癌相關的NEURL1B，并進一步證實該NEURL1B或該mRNA的表達產(chǎn)物在前列腺癌組織中表達上調(diào)。利用該mRNA檢測前列腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1WB分析小鼠體內(nèi)前列腺癌形成過程中NEURL1B蛋白表達情況。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對前列腺癌組織樣本及癌旁組織樣本的mRNA進行高通量轉錄組測序，通過生物信息學方法進行基因篩選，挑選出候選mRNANEURL1B，現(xiàn)有研究中并沒有NEURL1B和前列腺癌相關的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子生物學方法驗證，證實了NEURL1B在前列腺癌細胞中表達上調(diào)。本發(fā)明的NEURL1B是在本發(fā)明之前的已知mRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號：NCBI參考序列:NM_001308178.1，來源于人類基因組。本發(fā)明還采用RT-PCR方法和Western-Blot方法檢測上述mRNA在前列腺癌組織和癌旁正常組織的表達，并驗證了該mRNA在前列腺癌中表達上調(diào)。本文使用的術語“表達上調(diào)”指對應于所表達基因的序列，其中序列量的測量證明，與從正常個體或從通過前列腺癌分期確定與前列腺癌不同的已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學樣品中的同一基因相比，所述基因在從患前列腺癌或通過前列腺癌分期確定的前列腺癌已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學樣品中的表達水平增加。根據(jù)本發(fā)明，“表達上調(diào)”是指通過本發(fā)明方法雜交強度測量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高的表達增加，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高或者高于1倍，最高為2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。實施例1高通量測序篩選差異表達基因1、取樣取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科手術中獲得組織標本27例，所有標本均經(jīng)病理學檢查證實，其中癌旁組織樣本8例、前列腺癌標本19例，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、對組織樣本進行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進行高通量轉錄組深度測序，測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達分析時，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認算法EBSeq進行差異篩選。其中，篩選時，LOG2FC>1或<-1，F(xiàn)DR<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對差異表達基因進行了GeneOntology和信號通路分析，并對差異表達基因進行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結果，結合文獻我們篩選了差異表達NEURL1B，該mRNA在前列腺癌組織樣本中表達上調(diào)。實施例2RT-PCR驗證前列腺癌組織及癌旁組織NEURL1B表達情況1、材料選取前列腺癌組織樣本34例及癌旁組織樣本8例，對其進行分組及編號。所有樣本均經(jīng)過病理學檢查證實。2、方法2.1對組織樣本進行總RNA提取，同實施例1的提取方法。2.2逆轉錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉錄試劑盒，用逆轉錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。將獲得的cDNA樣品稀釋10倍后保存在-20℃冰箱備用。2.3Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)相對定量分析。2.3.2引物設計采用primerpremier5.0引物設計軟件，基因序列參照NCBI:NM_001308178.1(NEURL1B)，內(nèi)參選GAPDH，引物設計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表1引物序列操作過程如下：表2RealTime反應體系(一)反應體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。3、實驗結果實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較NEURL1B在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結果顯示：qRT-PCR擴增結果穩(wěn)定，其中NEURL1B在前列腺癌患組織中的表達水平為癌旁組織的2倍，以上結果驗證了高通量轉錄組表達數(shù)據(jù)的整合分析NEURL1B在前列腺癌患者中表達上調(diào)的結果。實施例3前列腺癌小鼠模型的構建前列腺癌小鼠模型的建立有多種方法，如自發(fā)和誘發(fā)模型、異種種植模型、轉基因動物模型、基因敲除動物模型等。相關研究表明，將人前列腺癌細胞系LNCaP的細胞懸液注入與小鼠腋窩皮下。裸鼠的人腫瘤移植物最接近人類腫瘤本身特性的實驗模型，是研究前列腺癌的較佳造模方法。1、材料人前列腺癌腫瘤LNCaP細胞株購自美國ATTC公司，SPF級裸鼠，雄性，3-5周齡，體重18g-23g，由協(xié)和醫(yī)院實驗室中心提供。2、方法將實驗動物按照隨機分配表分為6組，每組均為5只，分別標明實驗組為Al、A2、A3，分別標明對照組為C1、C2、C3。2.1細胞培養(yǎng)LNCaP細胞培養(yǎng)于含12％的胎牛血清的F-12培養(yǎng)基(Gibco公司)中，培養(yǎng)箱溫度保持37℃、5％CO2培養(yǎng)環(huán)境，1-2天換液1次，當細胞處于對數(shù)生長期且細胞濃度約為5x107個/mL備用。2.2細胞移植對數(shù)生長期的LNCaP細胞用0.25％胰酶消化后收集，生理鹽水洗滌。取少量細胞進行臺盼藍染色檢測其生存活率，合格則濃縮細胞到其濃度接近于1x109個/mL。用乙醚麻醉裸鼠，用眼科剪在其左右兩側腋下剪去皮毛，露出皮膚。用1mL注射器吸取300μL的濃縮細胞注射裸鼠腋窩處。逐日觀察移植部位以了解腫瘤生長的潛伏期和生長速度。Al、A2、A3組注入細胞選液溶液0.3mL，C1、C2、C3組注入等量的生理鹽水溶液。取樣及處理：分別于造模后第4周末(A1)，第6周末(A2)，第8周末(A3)脫頸處死小鼠，解剖小鼠分離前列腺腫瘤組織和正常前列腺組織，使用濾紙拭去取出標本處的血液，置于PBS溶液中，將所有標本置入-80℃冰箱中保存。實施例4WB方法檢測前列腺癌組織中NEURL1B的蛋白表達水平一、蛋白質(zhì)樣品制備及定量1、RIPA裂解液(Beyotime)進行蛋白質(zhì)樣品制備，操作步驟如下:將組織樣本自冰箱取出，用濾紙擦拭組織上的PBS溶液，稱取重量，并將組織置于機械組織勻漿器中，1:10組織比裂解液的重量體積比例加入相應體積的裂解液進行勻漿，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清液，按1:1加入樣品緩沖液強力混勻后置于100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉入另一潔凈的試管中。2、利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行總蛋白定量采用康為世紀微量BCA蛋白定量試劑盒(貨號：CW2011)，具體步驟見其說明書。二、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)1、蛋白質(zhì)樣品變性:a)根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度測定結果，每個凝膠加樣孔中加入相同質(zhì)量的總蛋白提取物。按照每1微升蛋白樣品加入0.25微升蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5x)。b)100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。c)冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。2、膠板制備:采用Bio-Rad公司的微型垂直板電泳裝置制備0.75mm厚的凝膠，照說明書安裝好玻璃板后，先在小燒杯中配制5mL10％的分離膠，配方如下：表3分離膠配方組分用量30％丙烯酰胺溶液1.7mLTris-HCl(1.5M，pH8.8)1.3mL10％SDS0.05mL10％AP0.05mLTEMED0.002mL滅菌ddH2O補充至5mL混勻后立即灌膠，然后加1mL蒸餾水覆蓋，室溫下放置約30min待膠聚合后，用蒸餾水洗2-3次，再用濾紙吸干。然后制備2mL5％的濃縮膠，配方如下：表4濃縮膠配方組分用量30％丙烯酰胺溶液0.33mLTris-HCl(1.0M，pH6.8)0.25mL10％SDS0.02mL10％AP0.02mLTEMED0.002mL滅菌ddH2O補充至2mL混勻后立即灌膠，插入樣品梳，避免產(chǎn)生氣泡，待膠凝固后，取出樣品梳，后用蒸餾水和1x蛋白電泳緩沖液先后沖洗樣品孔。三、上樣及電泳將凝膠板裝在電泳裝置上，內(nèi)槽中加滿lx蛋白電泳緩沖液，外槽中l(wèi)x蛋白電泳緩沖液應超過鉑絲，按順序上樣。在末端泳道中加入蛋白質(zhì)質(zhì)量標準蛋白梯度。電泳時藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。四、蛋白質(zhì)印跡1、按照上述方法先進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。2、預先用轉印緩沖液浸泡NC膜、濾紙、海棉墊。SDS-PAGE結束后取出凝膠，去除濃縮膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒，然后置于轉印緩沖液中浸泡15-30min。打開電轉印夾，每側墊上一塊專用的用轉印緩沖液浸泡透的海棉墊，再各放一塊轉印液浸透的濾紙，濾紙與海棉墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側濾紙上，最后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉印夾。在電泳槽加滿電轉印液，插入電轉印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)(電轉印液之前要放入冰箱內(nèi)預冷)，連接好電極，接通電流，轉印夾的NC膜應對電泳槽的正極。3、封閉：用1xTBS漂洗一次。加入含5％的無脂奶粉TBS封閉緩沖液，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行封閉；4、一抗雜交：棄封閉液，加入用一抗稀釋液稀釋的一抗(Anti-NEURL1Bantibody(ab156988))雜交溶液，置于4℃雜交過夜，第二天在振蕩培養(yǎng)箱中進行雜交；5、回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次；6、棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋的二抗(GoatAnti-RabbitIgG,HRPConjugated(CW0103))雜交溶液，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行雜交；7、棄二抗溶液，用TBST洗膜3次；8、ECL化學發(fā)光及圖像采集和分析：按照高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀貨號CW0049B)，具體步驟參照說明書。9、以β-Actin作為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)標準化，以癌旁組織中NEURL1B作為參照樣本，計算實驗組中NEURL1B蛋白的相對表達水平。五、實驗結果分別在造模后第4周處死A1組和C1組、第6周處死A2組和C2組、第8周處死A3組和C3組取得的樣品檢測結果顯示，實驗組A1、A2、A3組與對照組C1、C2和C3組相比，NEURL1B蛋白表達明顯升高(P<0.01)，對照組C1、C2和C3組內(nèi)NEURL1B蛋白表達無顯著差異，但實驗組A1、A2、A3組內(nèi)NEURL1B蛋白表達差異顯著，其中A1<A2<A3(P<0.01)。具體參見圖1所示。實施例5RNAi干擾NEURL1B表達及對前列腺癌細胞的影響一、材料1、細胞來源前列腺癌PC-3細胞株購自美國ATCC公司2、siRNA設計與合成依據(jù)在線設計軟件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根據(jù)基因序列參照NCBI:NM_001308178.1(NEURL1B)，設計相應的siRNA，具體序列見表5。設計后送往合成公司合成。表5siRNA序列列表二、實驗方法1、細胞分組C組：空白對照組；C1組：轉染脂質(zhì)體組；C2組：轉染非特異性的siRNA-NC組；S1，S2，S3組：轉染特異性的siRNA組。2、轉染按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步驟進行。(1)PC-3細胞培養(yǎng)于F-12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含10％新生胎牛血清(Gibco公司)、1％L-谷氨酰胺、100U.mL-1青霉素、100mg.L-1鏈霉素。于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。(2)將5x104細胞接種在6孔板上，這些用于初期接種的細胞數(shù)量，應能在24小時內(nèi)使細胞匯合達到70％；(3)準備siRNA-LipofectamineTM2000復合物:a.以250μLOpti-MEM稀釋5μLLipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘。b.實驗各組分別取7.5μLsiRNA加入250μLOpti-MEMI中進行稀釋，并輕輕搖動將其混勻；c.孵育5分鐘后，將稀釋的siRNA和LipofectamineTM2000混合后在室溫下孵育20分鐘。(4)在培養(yǎng)板中的每個孔中都加入細胞、培養(yǎng)基及siRNA-LipofectamineTM2000復合物。然后輕輕搖動培養(yǎng)板，使他們充分混合；(5)放置在37℃，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48小時，在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染數(shù)量，檢測轉染效率；(6)轉染效率為熒光鏡與光鏡視野中的細胞數(shù)量的比值，細胞的轉染效率均達到90％以上，方可以進行后續(xù)的實驗。計算公式如下：轉染效率＝發(fā)熒光細胞的數(shù)量/相同視野下的細胞數(shù)量x100％3、應用Real-timePCR方法檢測轉染前后NEURL1B表達的變化(1)標準曲線的構建：選取在50mL培養(yǎng)瓶中正常培養(yǎng)的前列腺癌細胞1瓶，提取RNA，測定RNA濃度和純度，進行逆轉錄反應，將反應生成的DNA模板十倍稀釋，得到相當于104-101copies/μL的DNA模板，分別加入NEURL1B引物和內(nèi)參引物，配制25μL反應體系，使用Real-timePCR擴增儀，進行PCR擴增反應。得到NEURL1B和內(nèi)參的標準曲線。(2)Real-timePCR方法檢測轉染前后NEURL1B表達的變化：提取各組細胞的RNA，測定RNA濃度和純度，進行逆轉錄反應，每組DNA模板同時進NEURL1B和內(nèi)參的Real-timePCR反應，實驗重復三次。(3)對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。三、實驗結果分別用3條NEURL1B的siRNA及對照siRNA轉染第一代前列腺癌細胞，結果顯示在大量前列腺癌細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)綠色熒光，證明前列腺癌細胞內(nèi)已經(jīng)得到了siRNA的轉染，然后在熒光鏡和光鏡下觀察前列腺癌細胞數(shù)量，進行轉染效率的檢測，結果顯示轉染率均達到90％以上。Real-timePCR結果顯示，轉染非特異性的siRNA-NC組對前列腺癌細胞中NEURL1B表達無明顯抑制作用，和空白對照組無統(tǒng)計學差異，轉染的3個NEURL1B-siRNA組都對前列腺癌細胞中NEURL1B表達起到一定抑制作用，NEURL1B-siRNA1抑制率為56％，NEURL1B-siRNA2和NEURL1B-siRNA3抑制效果最明顯，抑制率達65％和72％。實施例6MTT法檢測前列腺癌細胞的增殖抑制情況一、MTT法實驗步驟1、在96孔板中，按照每孔加入約1x104細胞，然后在37℃5％CO2的條件下培養(yǎng)24小時；2、按照實驗分組(空白對照組、轉染非特異性siRNA-NC組、轉染NEURL1B-siRNA3組，每組6個重復)繼續(xù)培養(yǎng)直至適合檢測；3、接著在37℃，5％CO2及100％濕度的條件下繼續(xù)孵育適當時間；4、同時用DilutionBuffer將5xMTT稀釋成1xMTT；5、在每孔中加入50μL1xMTT，并在37℃條件下孵育4小時；6、吸出上清液后，在每孔中還需加入150μLDMSO，并將其放置在平板搖床上進行搖勻；7、將酶標儀波長設定為570nm，檢測每個孔的光密度。8、細胞增殖抑制率的計算：細胞增殖抑制率％＝(1-實驗孔OD值/對照細胞OD值)x100％，對照細胞OD值為正常培養(yǎng)細胞孔的OD值。二、實驗結果與未轉染的空白對照組相比，轉染siRNA-AC對細胞增殖無明顯影響(P>0.05)，轉染NEURL1B-siRNA3可以明顯抑制前列腺癌細胞增殖，可用于前列腺癌藥物的制備，抑制率隨時間的延長而增加，組間比較差異具有顯著性(P<0.05)，結果見表6所示。表6各組前列腺細胞的增殖抑制率(％)雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3