本發(fā)明所涉及動(dòng)物病原分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：豬瘟是由豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的豬的一種高度接觸性、急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)病急，高熱稽留，微循環(huán)血管壁變性及其導(dǎo)致的全身泛發(fā)性小點(diǎn)出血，內(nèi)臟器官中多發(fā)性出血、壞死和梗死，具有接觸傳染性和較高的致死率。近年來，我國(guó)豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，低毒力豬瘟野毒株或持續(xù)性感染引起的溫和型豬瘟或非典型豬瘟較為常見，其在臨床解剖上的病理特征也不同于典型豬瘟，給獸醫(yī)臨床診斷帶來很大的困擾。豬瘟為一類傳染病，是國(guó)家強(qiáng)制免疫的對(duì)象之一，因此在強(qiáng)制免疫情況下，豬群豬瘟抗體水平多數(shù)呈陽性，現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)無法對(duì)野毒株感染與疫苗株免疫產(chǎn)生的抗體進(jìn)行區(qū)分。此外，在接種豬瘟疫苗后2周或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，在某些組織能檢測(cè)到病毒，而疫苗株與野毒株的基因序列高度保守，常規(guī)的分子診斷方法基本無法區(qū)別兩種毒株，對(duì)豬瘟的凈化存在較大干擾。目前用于豬瘟病毒的檢測(cè)方法有動(dòng)物接種試驗(yàn)，病毒分離技術(shù)，標(biāo)記抗體技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和分子生物檢測(cè)技術(shù)。(1)動(dòng)物接種試驗(yàn)中易感豬接種是檢測(cè)豬瘟病毒的經(jīng)典方法，但該方法需要較高的生物安全設(shè)施，且同時(shí)存在試驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，動(dòng)物存在個(gè)體差異，及潛在的散毒，該方法使用較少。(2)病毒分離采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離病毒，是試驗(yàn)室檢測(cè)與鑒定豬瘟的標(biāo)準(zhǔn)方法，采集病變典型的可疑組織、血液或臟器，經(jīng)研磨，裂解、差速離心提取病毒，并使用對(duì)豬瘟病毒敏感的細(xì)胞系如ST，PK-15等細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。(3)血清學(xué)檢測(cè)方法：商用的試劑盒有豬瘟抗體阻斷ELISA方法的檢測(cè)，直接免疫熒光抗體法，該方法因其操作簡(jiǎn)單，快速，技術(shù)可靠，可檢測(cè)批量樣品，成本相對(duì)較低，很多國(guó)家將它作為執(zhí)行豬瘟消滅疾患的法定試驗(yàn)。但因豬瘟與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在共同抗原，在基因結(jié)構(gòu)上同源性達(dá)60％以上。在血清學(xué)檢測(cè)上存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。(4)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)：歐盟使用了豬瘟巢式PCR作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)也建立了豬瘟病毒RT-nPCR檢測(cè)方法，豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法和豬瘟病毒熒光定量鑒別RT-PCR檢測(cè)方法。但國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的商用的試劑盒還較少。同時(shí)普通PCR檢測(cè)方法存在易出現(xiàn)假陽性，操作時(shí)間長(zhǎng)，套式擴(kuò)增，技術(shù)操作要求技術(shù)高等的缺陷。上述豬瘟診斷方法在敏感性、特異性及時(shí)效性等方面都存在各自的不足，且這些方法都不能有效地區(qū)分野毒株感染與疫苗接種。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(real-timefluorescencequantitativePCR)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種較新的核酸檢測(cè)技術(shù)，具備靈敏度高、快速便捷、抗污染能力強(qiáng)、安全系數(shù)好、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)。通過對(duì)探針的巧妙設(shè)計(jì)，可以檢測(cè)區(qū)分單個(gè)的核苷酸堿基差異，因此能很好的用于不同類型毒株的差異化檢測(cè)。在日常豬瘟病原檢測(cè)及疾病凈化過程中，需進(jìn)行活體采樣，對(duì)豬群的應(yīng)激較大，采樣難度也高。發(fā)明人提出了臍帶血檢測(cè)技術(shù)，臍帶血具有采集方便、安全省時(shí)、不影響生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，而豬瘟可通過胎盤垂直傳播。盡管臍帶血含毒量相對(duì)于組織而言要低，但在實(shí)際應(yīng)用中也對(duì)組織及對(duì)應(yīng)臍帶血進(jìn)行了相互印證，確保本發(fā)明方法的特異性及敏感性。結(jié)合臍帶血的檢測(cè)，既可做到鑒別診斷，又可避免應(yīng)激，同時(shí)可進(jìn)行豬群早期預(yù)警評(píng)判。因此，研制一種通過臍帶血檢測(cè)鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株的熒光RT-PCR方法很有必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性優(yōu)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，且能夠有效鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便、無應(yīng)激，直觀、特異、快速和高精準(zhǔn)的效果，能同時(shí)反映母、仔豬豬瘟病毒帶毒和排毒狀況，評(píng)估母豬豬瘟疫苗的免疫效果，側(cè)面反映母豬的健康狀況水平，有益于對(duì)群體豬瘟病毒感染的凈化和免疫情況的早期預(yù)警評(píng)判，進(jìn)一步有助于豬場(chǎng)做好該疾病的預(yù)警、防控工作?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明提供的一種檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴(kuò)增引物CSFV-F：5’-GCCATGCCCATAGTAGGA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴(kuò)增引物CSFV-R：5’-CTACTGACGACTGYCCTGTA-3’，其為SEQIDNO:2序列，其中Y＝C/T；特異性熒光探針CSFV-LV：VIC-5’-TGGCTAGTCCCTCCGTTTTGC-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:3序列，其中VIC為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為非熒光淬滅基團(tuán)；特異性熒光探針CSFV-Wt：FAM-5’-ACGGCTAGTCCCTCCGTTTG-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:4序列，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為非熒光淬滅基團(tuán)。合理的引物和熒光探針設(shè)計(jì)是成功應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對(duì)反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測(cè)結(jié)果的判定。本發(fā)明對(duì)GenBank中公布的CSFV(包括野毒株和弱毒疫苗株)和其它病毒(包括牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒)基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，在高度保守的5’-UTR非編碼區(qū)上設(shè)計(jì)了針對(duì)CSFV的通用上下游擴(kuò)增引物CSFV-F和CSFV-R，并且下游擴(kuò)增引物CSFV-R中含有兼并堿基Y，使擴(kuò)增的范圍更廣泛。同時(shí)利用CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株基因組5’-UTR中2個(gè)堿基的差異，設(shè)計(jì)了不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的CSFV野毒株(Shimen株)特異性熒光探針CSFV-Wt和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)特異性熒光探針CSFV-LV，特異性熒光探針CSFV-Wt與Shimen株RNA特異性結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)顯藍(lán)色熒光(FAM通道)，與HCLV株RNA無結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無綠色熒光顯示(VIC通道)；特異性熒光探針CSFV-LV與Shimen株RNA無結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無藍(lán)色熒光顯示(FAM通道)，與HCLV株RNA特異性結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)顯綠色熒光顯示(VIC通道)。表明兩條探針特異性良好，能鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株。本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)在豬瘟病毒基因組5’-UTR非編碼區(qū)上，該組引物和探針的特異性強(qiáng)，一方面能夠解決豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在基因交叉的問題，另一方面能同時(shí)區(qū)分豬瘟病毒野毒株與疫苗株，檢測(cè)更加特異性。采用從仔豬臍帶血中檢測(cè)CSFV基因組5’-UTR來評(píng)價(jià)母豬豬瘟病毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母體內(nèi)感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學(xué)、直接和有效的診斷豬瘟疾病、評(píng)估豬瘟疫苗保護(hù)力水平和疾病預(yù)警方面的方法之一，在規(guī)?；i場(chǎng)的豬瘟病的凈化過程中起到更加可靠的技術(shù)支撐。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物CSFV-F、所述下游擴(kuò)增引物CSFV-R、所述特異性熒光探針CSFV-LV和所述特異性熒光探針CSFV-Wt的摩爾比為2:2:1:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物CSFV-F、所述下游擴(kuò)增引物CSFV-R、所述特異性熒光探針CSFV-LV和所述特異性熒光探針CSFV-Wt在所述試劑盒中的終濃度均為0.2～0.8μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、2×熒光RT-PCR反應(yīng)液；所述2×熒光RT-PCR反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)。在PCR反應(yīng)體系中加入2×熒光RT-PCR反應(yīng)液，其包括UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對(duì)照為克隆有豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2，克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2的終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和所述豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的核苷酸序列分別如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTRGCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:5)；兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列為：GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCATAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:6)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物分別擴(kuò)增豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段，通過TA克隆將豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段克隆至pEASY-T1載體，篩選陽性克隆，測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-5UTR2。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用所述的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：10μMSEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針CSFV-LV：0.2～0.4μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針CSFV-Wt：0.2～0.4μL；2×熒光RT-PCR反應(yīng)液：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL；(2)熒光PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；95℃預(yù)變性1min；95℃變性10Sec，60℃退火45Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；最后25℃冷卻10sec，結(jié)束反應(yīng)；(3)結(jié)果分析：質(zhì)量控制：陰性對(duì)照FAM通道檢測(cè)無Ct值，VIC通道檢測(cè)無Ct值；陽性對(duì)照FAM通道檢測(cè)Ct值≤30，VIC通道檢測(cè)Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測(cè)結(jié)果有效；結(jié)果判定：FAM通道檢測(cè)Ct值≤40，VIC通道檢測(cè)無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒野毒株感染陽性；FAM通道檢測(cè)無Ct值，VIC通道檢測(cè)≤40，則判定樣品為豬瘟病毒疫苗株陽性；FAM通道檢測(cè)Ct值≤40，VIC通道檢測(cè)≤40，則判定樣品同時(shí)含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株；FAM通道檢測(cè)無Ct值，VIC通道檢測(cè)無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒感染陰性。在本發(fā)明中，為了使檢測(cè)野毒株和疫苗株特異性探針與模板發(fā)生錯(cuò)配的效率最低，對(duì)退火溫度、引物濃度和兩條探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，尤其是兩條探針的濃度，探針濃度過低會(huì)引起特異性的熒光信號(hào)變?nèi)酰鴿舛冗^高則會(huì)引起兩條探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號(hào)從而干擾特異性熒光信號(hào)。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定本發(fā)明的熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用本發(fā)明的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)豬瘟病毒野毒株與疫苗株的擴(kuò)增效率均達(dá)到90％以上，并且發(fā)生錯(cuò)配的效率最低。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述RNA模板采用以下方法制備得到：(1)取100-200μL豬臍帶血置1.5mLEP管中，加入1mL裂解液充分混勻，室溫靜置5min；所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5mL異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1mL質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10-15min；(8)快速電泳檢測(cè)RNA完整性。本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑中的用途。本發(fā)明在豬瘟病毒基因組5’-UTR非編碼區(qū)上設(shè)計(jì)通用引物和兩條不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針，通過對(duì)退火溫度、引物濃度以及兩條特異性探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)范圍為108-101copies/μL，可以檢測(cè)到最低10copies的病毒含量的樣品。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征變異株和經(jīng)典株、Shimen、HCLV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物及正常細(xì)胞均無非特異性反應(yīng)，說明該方法特異性和可靠性強(qiáng)。準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于陽性對(duì)照與陰性對(duì)照的檢測(cè)，該方法與RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果100％符合；對(duì)于臨床樣品的檢測(cè)，該方法檢測(cè)陽性5/36，RT-PCR方法檢測(cè)陽性3/36，且后者檢測(cè)的3份樣品使用該方法檢測(cè)均為陽性，說明該方法比RT-PCR方法更敏感，準(zhǔn)確性高。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)不同核酸濃度的陽性對(duì)照檢測(cè)變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復(fù)性。本發(fā)明應(yīng)用雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)鑒別豬瘟病毒野毒株和疫苗株的工作原理：由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨(dú)立血液循環(huán)系統(tǒng)之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的，即不存在任何病原的相關(guān)基因片段，因此，可通過檢測(cè)“臍帶血”中是否存在豬瘟病毒核酸來判斷帶毒不發(fā)病母豬的情況，預(yù)警仔豬感染豬瘟病毒的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而評(píng)價(jià)母豬的免疫水平及帶毒情況等，同時(shí)設(shè)計(jì)分別針對(duì)野毒株與疫苗株的探針進(jìn)一步準(zhǔn)確區(qū)分是否為野毒株感染。具體步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行；(5)判定結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)本發(fā)明的檢測(cè)方法克服了常規(guī)檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準(zhǔn)確定量等問題，檢測(cè)快速高效，不會(huì)造成樣品交叉污染。(2)本發(fā)明的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性優(yōu)，可以實(shí)現(xiàn)大通量樣品的檢測(cè)。(3)本發(fā)明的檢測(cè)方法不僅適用于檢測(cè)臍帶血檢測(cè)，還適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，可用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場(chǎng)等。(4)在日常豬瘟檢測(cè)及疾病凈化過程中，需進(jìn)行活體采樣，對(duì)豬群的應(yīng)激較大，難度也高，而臍帶血避免了這些問題，臍帶血雖然含毒量相對(duì)于組織而言要低，在實(shí)際應(yīng)用中也對(duì)組織及對(duì)應(yīng)臍帶血進(jìn)行了相互印證，確保本發(fā)明檢測(cè)方法的特異性及敏感性。(5)本發(fā)明充分運(yùn)用PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交技術(shù)的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行一次檢測(cè)操作即可完成豬瘟病毒野毒株和疫苗株的鑒別檢測(cè)，可以確定樣品是豬瘟病毒野毒株感染，或者是豬瘟病毒疫苗株感染，或者是兩者共同感染；而且能夠解決豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒存在基因交叉的問題。附圖說明圖1為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(FAM通道)；圖2為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(VIC通道)；圖3為本發(fā)明熒光RT-PCR檢測(cè)不同濃度的豬瘟病毒野毒株結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明熒光RT-PCR檢測(cè)不同濃度的豬瘟病毒疫苗株結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明豬瘟病毒野毒株敏感性檢測(cè)結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明豬瘟病毒疫苗株敏感性檢測(cè)結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果圖(FAM通道)；圖8為本發(fā)明試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果圖(VIC通道)；圖9為本發(fā)明試劑盒重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的組成(1)2×熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：原料購(gòu)自南京諾唯贊(VAZYME)公司；該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等；(2)RT-PCR引物組CSFV-F和CSFV-R：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。上游擴(kuò)增引物CSFV-F：5’-GCCATGCCCATAGTAGGA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴(kuò)增引物CSFV-R：5’-CTACTGACGACTGYCCTGTA-3’，其為SEQIDNO:2序列，其中Y＝C/T；(3)特異性熒光探針CSFV-LV與CSFV-Wt：由華大基因公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。特異性熒光探針CSFV-LV：VIC-5’-TGGCTAGTCCCTCCGTTTTGC-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:3序列，其中VIC為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為非熒光淬滅基團(tuán)；特異性熒光探針CSFV-Wt：FAM-5’-ACGGCTAGTCCCTCCGTTTG-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:4序列，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為非熒光淬滅基團(tuán)；本發(fā)明對(duì)GenBank中公布的CSFV(包括野毒株和弱毒疫苗株)和其它病毒(包括牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病病毒)基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，在高度保守的5’-UTR非編碼區(qū)上設(shè)計(jì)了針對(duì)CSFV的通用上下游擴(kuò)增引物CSFV-F和CSFV-R，并且下游擴(kuò)增引物CSFV-R中含有兼并堿基Y，使擴(kuò)增的范圍更廣泛。同時(shí)利用CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株基因組5’-UTR中2個(gè)堿基的差異，設(shè)計(jì)了不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的CSFV野毒株(Shimen株)特異性熒光探針CSFV-Wt和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)特異性熒光探針CSFV-LV，特異性熒光探針CSFV-Wt與Shimen株RNA特異性結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)顯藍(lán)色熒光(FAM通道)，與HCLV株RNA無結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無綠色熒光顯示(VIC通道)；特異性熒光探針CSFV-LV與Shimen株RNA無結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無藍(lán)色熒光顯示(FAM通道)，與HCLV株RNA特異性結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)顯綠色熒光顯示(VIC通道)。表明兩條探針特異性良好，能區(qū)分豬瘟病毒野毒株與疫苗株。(4)陽性對(duì)照為克隆有豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的重組質(zhì)粒pEASY-5UTR2，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，質(zhì)粒在紫外分光光度計(jì)OD260nm測(cè)定質(zhì)量濃度，按公式6.02×1023×(Xng/μL×10-9)/DNAlength×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL；其中，克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2的構(gòu)建方法如下：①按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬瘟病毒野毒株(Shimen)RNA和兔化弱毒疫苗株(HCLV)RNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴(kuò)增豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段序列和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列，反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；95℃預(yù)變性1min；95℃變性10Sec，60℃退火45Sec，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段序列和豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序后比對(duì)成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-5UTR2。其中：豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段序列為：GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:5)；兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段序列為：GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGCCATAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAG(SEQIDNO:6)。(5)陰性對(duì)照為無DNAase的ddH2O；(6)使用說明書。實(shí)施例2檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的使用方法本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)；(5)判定結(jié)果。(1)樣品采集1.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；2.當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項(xiàng)：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個(gè)體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測(cè)；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測(cè)；3.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；4.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測(cè)項(xiàng)目的清單。(2)樣品中模板RNA提取1.取50-100mg豬臍帶血置1.5ml勻漿器中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；2.加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠(購(gòu)自賽默飛公司)，振蕩15s，靜置2min；3.將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；4.加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；5.將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；6.加入1ml質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；7.晾干，加入適量的DEPCH2O溶解(56℃促溶10～15min)；8.快速電泳檢測(cè)RNA完整性。本發(fā)明在RNA提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。依據(jù)上述方法提取6份隨機(jī)臍帶血樣品總RNA，經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)，濃度均能達(dá)到0.132μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之間，表明RNA純度高、完整性好，具體數(shù)據(jù)見表1。表1RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)體積(μl)濃度(μg/μl)總量(μg)A260/A280質(zhì)量評(píng)價(jià)001500.24812.41.93合格002500.23912.01.95合格003500.1628.11.90合格004500.25212.61.94合格005500.1326.61.91合格006500.1638.21.95合格(3)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR為了使檢測(cè)野毒株和疫苗株特異性探針與模板發(fā)生錯(cuò)配的效率最低，對(duì)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所示：實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系：SEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物CSFV-F(10μM)：0.4～0.8μL；SEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物CSFV-R(10μM)：0.4～0.8μL；SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針CSFV-LV：(10μM)：0.2～0.4μL；SEQIDNO:4所示的特異性熒光探針CSFV-Wt(10μM)：0.2～0.4μL；2×熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL。熒光PCR的反應(yīng)條件為：RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄20min；95℃預(yù)變性1min；循環(huán)步驟95℃變性10Sec，60℃退火45Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；最后25℃冷卻10sec，結(jié)束反應(yīng)；同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的加入量均為2μL(4)判定結(jié)果質(zhì)量控制：陰性對(duì)照FAM通道檢測(cè)無Ct值，VIC通道檢測(cè)無Ct值；陽性對(duì)照FAM通道檢測(cè)Ct值≤30，VIC通道檢測(cè)Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測(cè)結(jié)果有效；結(jié)果判定：FAM通道檢測(cè)Ct值≤40，VIC通道檢測(cè)無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒野毒株感染陽性；FAM通道檢測(cè)無Ct值，VIC通道檢測(cè)≤40，則判定樣品為豬瘟病毒疫苗株陽性；FAM通道檢測(cè)Ct值≤40，VIC通道檢測(cè)≤40，則判定樣品同時(shí)含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株；FAM通道檢測(cè)無Ct值，VIC通道檢測(cè)無Ct值，則判定樣品為豬瘟病毒感染陰性。實(shí)施例3檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的驗(yàn)證1.擴(kuò)增效率驗(yàn)證對(duì)陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：108-101copies/μl，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(FAM通道)，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.56，截距：39.78，相關(guān)系數(shù)：0.998，擴(kuò)增效率：0.91。圖2為發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(VIC通道)，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.45，截距：40.40，相關(guān)系數(shù)：0.996，擴(kuò)增效率：0.95。綜上，說明該試劑盒檢測(cè)豬瘟病毒野毒株與疫苗株的擴(kuò)增效率均達(dá)到90％以上。2.雙重?zé)晒釸T-PCR特異性驗(yàn)證分別取濃度為107、106、105copies/μL豬瘟病毒野毒株(Shimen株)RNA或豬瘟病毒疫苗株(HCLV株)RNA作為模板，分別加入同時(shí)含有特異性熒光探針CSFV-LV與CSFV-Wt的RT-PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證兩條探針與對(duì)應(yīng)模板的特異性匹配度。結(jié)果如下，特異性熒光探針CSFV-Wt與Shimen株RNA特異性結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)顯藍(lán)色熒光(FAM通道)，與HCLV株RNA無結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無綠色熒光顯示(VIC通道)，如圖3所示；特異性熒光探針CSFV-LV與Shimen株RNA無結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無藍(lán)色熒光顯示(FAM通道)，與HCLV株RNA特異性結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)顯綠色熒光顯示(VIC通道)，如圖4所示。表明兩條探針特異性良好，能鑒別豬瘟病毒野毒株與疫苗株。3.靈敏度試驗(yàn)以10倍梯度稀釋的陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2作為模板，進(jìn)行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)范圍為108-101copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)范圍為108-101copies/μL，在此范圍的病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測(cè)到最低10copies的病毒含量的樣品。檢測(cè)結(jié)果見圖5和圖6。4.特異性研究為了檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒，豬偽狂犬病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬流行性腹瀉病毒，豬繁殖與呼吸綜合征變異株和經(jīng)典株，Shimen、HCLV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物及正常細(xì)胞對(duì)照等。檢測(cè)結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對(duì)豬瘟病毒野毒株和疫苗株進(jìn)行擴(kuò)增，不與其它核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，見圖7和圖8。5.準(zhǔn)確性研究同時(shí)采用本發(fā)明的試劑盒以及普通RT-PCR對(duì)36份臍帶血樣品進(jìn)行檢測(cè)以及5份健康的臍帶血樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見表2。表2采用本發(fā)明試劑盒以及普通RT-PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的比較從表2中可以看出：本試劑盒雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)陽性樣品與普通RT-PCR方法檢測(cè)陽性樣品的結(jié)果100％符合；對(duì)于臨床樣品的檢測(cè)，本試劑盒雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)陽性5/36，通RT-PCR方法檢測(cè)陽性3/36，且后者檢測(cè)的3份樣品使用前者檢測(cè)均為陽性，本發(fā)明試劑盒雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)比普通RT-PCR檢測(cè)更敏感，且臨床癥狀表現(xiàn)是一致的。6.重復(fù)性研究選用陽性對(duì)照pEASY-5UTR2克隆質(zhì)粒106、105、104copies/μL，對(duì)每個(gè)濃度的樣本做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度的檢測(cè)變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復(fù)性。檢測(cè)結(jié)果見表3和圖9。表3熒光定量PCR檢測(cè)豬瘟病毒野毒株和疫苗株的重復(fù)性試驗(yàn)綜上可見，本發(fā)明設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物和兩條特異性熒光探針以及構(gòu)成的試劑盒可以快速檢測(cè)鑒別豬臍帶血中的豬瘟病毒野毒株與疫苗株，而且該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。。序列表<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司<120>一種檢測(cè)鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒及其用途<130>FI160636-ND<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gccatgcccatagtagga18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ctactgacgactgycctgta20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3tggctagtccctccgttttgc21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4acggctagtccctccgtttg20<210>5<211>96<212>DNA<213>Shimen5’-UTR基因序列<400>5gccatgcccatagtaggactagcaaacggagggactagccgtagtggcgagctccctggg60tggtctaagtcctgagtacaggacagtcgtcagtag96<210>6<211>97<212>DNA<213>HCLV5’-UTR基因序列<400>6gccatgcccatagtaggactagcaaaacggagggactagccatagtggcgagctccctgg60gtggtctaagtcctgagtacaggacagtcgtcagtag97當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3