本實(shí)用新型屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種病毒實(shí)時(shí)檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：鹿流行性出血病(Epizootichemorrhagicdiseaseofdeer，EHD)是一種季節(jié)性非接觸性的病毒性傳染病，由鹿流行性出血病病毒(Epizootichemorrhagicdiseasevirusofdeer，EHDV)引起的，以引起鹿體溫升高、黏膜和漿膜面廣泛出血并常處于昏迷狀態(tài)下死亡為特征的嚴(yán)重致死性傳染病。在自然條件下，EHDV可引起牛、綿羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多種馴養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物感染，嚴(yán)重影響著許多國(guó)家的畜牧業(yè)和國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展。EHD是重要的蟲(chóng)媒病之一，庫(kù)蠓是主要的傳播媒介。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將EHD列為法定報(bào)告?zhèn)魅静　CR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)，該技術(shù)主要是基于病原微生物核酸的特異性，針對(duì)靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)DNA或RNA片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)由傳統(tǒng)PCR技術(shù)發(fā)展而來(lái)，實(shí)時(shí)熒光PCR在反應(yīng)體系中加入標(biāo)記熒光基團(tuán)的探針，在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序來(lái)即時(shí)分析DNA或RNA樣本的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR與傳統(tǒng)PCR法相比，一方面加入的TaqMan探針在反應(yīng)中只與模板的特異序列結(jié)合，不進(jìn)行延伸，減少錯(cuò)配，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和特異性；另一方面實(shí)時(shí)熒光PCR在封閉的體系中進(jìn)行擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)，無(wú)需電泳就可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的污染，自動(dòng)化程度高，重復(fù)性好，檢測(cè)周期短，廣泛應(yīng)用于科研和臨床檢測(cè)。因此，應(yīng)用熒光PCR技術(shù)建立鹿流行性出血病病毒檢測(cè)方法對(duì)于快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鹿流行性出血病具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本實(shí)用新型目的在于提供一種鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確、有效地檢測(cè)鹿流行性出血病病毒。本實(shí)用新型所提供的鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括盒體1、海綿墊2，所述海綿墊2上設(shè)有5×RT-PCR反應(yīng)液容器孔3，內(nèi)設(shè)有5×RT-PCR反應(yīng)液；酶混合液容器孔4，內(nèi)設(shè)酶混合液；正反向引物容器孔5，內(nèi)設(shè)正反向引物；探針容器孔6，內(nèi)設(shè)探針；陽(yáng)性對(duì)照品孔7，內(nèi)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照品；陰性對(duì)照品孔8，內(nèi)設(shè)陰性對(duì)照品；無(wú)核酸酶水容器孔9，內(nèi)設(shè)無(wú)核酸酶水。所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR正反向引物和探針?lè)謩e為：正向引物：5’-CCTTTGTGGCATGGACTACGA-3’；反向引物：5’-AATGGGCGGTATATTGTTTGG-3’；探針：5’-FAM-CTGCGATTCTTAACA-TAMRA-3’。所述探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為69bp。本檢測(cè)試劑盒于-18℃以下保存。本實(shí)用新型試劑盒使用方法：每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR25μL反應(yīng)體系：5×RT-PCR反應(yīng)液5μL，正反向引物2μL，熒光探針1μL，模板5μL，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)足25μL。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照用量同模板為5μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件：50℃30分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15秒→60℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)。本實(shí)用新型試劑盒質(zhì)量控制：陰性對(duì)照無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，未檢測(cè)到Ct值或相應(yīng)的Ct值＞38.0；陽(yáng)性對(duì)照有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜35.0。上述條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。本實(shí)用新型試劑盒結(jié)果判斷：Ct值＞38.00判定為陰性，Ct值≤35.00判定為陽(yáng)性，Ct值在35.00～38.00則判為可疑，需重新檢測(cè)，若仍為可疑，則可判為陽(yáng)性。本實(shí)用新型鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒根據(jù)EHDV群特異性結(jié)構(gòu)蛋白VP7基因cDNA為靶序列設(shè)計(jì)引物和探針，為鹿流行性出血病病毒檢測(cè)提供一種特異性強(qiáng)，敏感性高，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑盒。附圖說(shuō)明圖1：本實(shí)用新型鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2：鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR敏感性測(cè)定擴(kuò)增曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明，所舉實(shí)例只用于解釋本實(shí)用新型，并非用于限定本實(shí)用新型的范圍。實(shí)施例1本實(shí)用新型試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括盒體1、海綿墊2，所述海綿墊2上設(shè)有5×RT-PCR反應(yīng)液容器孔3，內(nèi)設(shè)有5×RT-PCR反應(yīng)液；酶混合液容器孔4，內(nèi)設(shè)酶混合液；正反向引物容器孔5，內(nèi)設(shè)正反向引物；探針容器孔6，內(nèi)設(shè)探針；陽(yáng)性對(duì)照品孔7，內(nèi)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照品；陰性對(duì)照品孔8，內(nèi)設(shè)陰性對(duì)照品；無(wú)核酸酶水容器孔9，內(nèi)設(shè)無(wú)核酸酶水。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR正反向引物和探針?lè)謩e為：正向引物：5’-CCTTTGTGGCATGGACTACGA-3’；反向引物：5’-AATGGGCGGTATATTGTTTGG-3’；探針：5’-FAM-CTGCGATTCTTAACA-TAMRA-3’。所述探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為69bp。本檢測(cè)試劑盒于-18℃以下保存。本實(shí)用新型試劑盒使用方法：每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR25μL反應(yīng)體系：5×RT-PCR反應(yīng)液5μL，正反向引物2μL，熒光探針1μL，模板5μL，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)足25μL。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照用量同模板為5μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件：50℃30分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15秒→60℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)。質(zhì)量控制要求：陰性對(duì)照無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，未檢測(cè)到Ct值或相應(yīng)的Ct值＞38.0；陽(yáng)性對(duì)照有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜35.0。上述條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。本實(shí)用新型試劑盒結(jié)果判斷：Ct值＞38.00判定為陰性，Ct值≤35.00判定為陽(yáng)性，Ct值在35.00～38.00則判為可疑，需重新檢測(cè)，若仍為可疑，則可判為陽(yáng)性。實(shí)施例2.：鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒靈敏度測(cè)定。用質(zhì)粒純化試劑盒從宿主菌中提取攜帶EHDV-VP7基因的重組質(zhì)粒pBAD-EHDV-VP7，用蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的pBAD-EHDV-VP7的濃度，制備10×系列稀釋(100～106)的模板，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，從圖2可知，8個(gè)稀釋度均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)明顯，都檢測(cè)到了Ct值，說(shuō)明本實(shí)用新型試劑盒能檢測(cè)到少至1個(gè)拷貝的模板，具有很高的靈敏度。實(shí)施例3：鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒特異性測(cè)定。采用鹿流行性出血病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)EHDV-1、2、4、7型和藍(lán)舌病病毒(BTV1-24型)、赤羽病病毒(AKV)、水泡性口炎病毒(VSV)細(xì)胞培養(yǎng)病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果EHDV各血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株均呈陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，而B(niǎo)TV1-24型、AKV、VSV為陰性，結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明本實(shí)用新型試劑盒可有效檢出不同血清型EHDV，與親緣關(guān)系最近的BTV無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。表1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異性測(cè)定病毒種類檢測(cè)結(jié)果BTV1-24型陰性AKV陰性EHDV-1陽(yáng)性EHDV-2陽(yáng)性EHDV-4陽(yáng)性EHDV-7陽(yáng)性VSV陰性當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3