本發(fā)明涉及蓋塔病毒診斷和檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

蓋塔病毒(GETV)是一種RNA病毒，屬披蓋病毒科甲病毒屬成員，廣泛分布于亞洲及澳大利亞北部的太平洋沿岸地區(qū)，在中國(guó)、印度、巴基斯坦、東南亞、日本等國(guó)家和地區(qū)均有蓋塔病毒流行的報(bào)道。1955年，該病毒在馬來(lái)西亞首次分離到，一年后在日本也分離到這種病毒。六十年代，澳大利亞研究者進(jìn)行了人和動(dòng)物血清抗體檢查，證明了GETV對(duì)人和動(dòng)物的感染性。1978年，甲野等首次在日本賽馬群中發(fā)現(xiàn)了由本病毒引起的傳染病，兩個(gè)月之內(nèi)感染了同群的大部分馬匹。病馬以體溫升高(38.5-41℃，持續(xù)1-4天)癥狀為主，約1/3的病馬伴隨發(fā)疹和浮腫，一周后可痊愈。痊愈馬血清中出現(xiàn)特異性中和抗體、補(bǔ)結(jié)抗體和血凝抑制抗體。當(dāng)時(shí)采用組織培養(yǎng)病毒接種健康馬，能引起與自然病馬同樣的癥狀。1979和1983年，該病再次在日本流行，全國(guó)大約1/4的馬匹呈血清陽(yáng)性，流行期間20％～70％的感染馬出現(xiàn)臨床癥狀。此后，滅活疫苗開(kāi)始用于該病的預(yù)防。對(duì)馬致病性的發(fā)現(xiàn)，重新引起了學(xué)者們對(duì)GETV的興趣，尤其是GETV對(duì)人類和其它攜帶抗體動(dòng)物的致病性方面。

目前，檢測(cè)蓋塔病毒的主要方法有病原分離、血凝和血凝抑制方法、間接免疫熒光(IFA)、普通的RT-PCR方法等等，但是病原分離的方法需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而血凝抑制的特異性和敏感性并不能滿足檢驗(yàn)檢疫的要求，另外間接免疫熒光法需要較昂貴的顯微鏡和有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員，且該方法經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，耗時(shí)長(zhǎng)，難度相對(duì)較大，不易操作，最后普通的RT-PCR方法相比于前兩種方法雖然具有操作簡(jiǎn)便、速度快、以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是當(dāng)病毒含量比較低時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，靈敏度比較低。

鑒于以上問(wèn)題的存在，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的檢測(cè)體系，所述檢測(cè)體系中所包含的引物組和探針特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，檢測(cè)的最低模板量可以達(dá)到2.03x10¹copies/μl，而普通的RT-PCR方法最低只能檢測(cè)到2.03x10⁵copies/μl，其靈敏度可以達(dá)到常規(guī)的RT-PCR技術(shù)的10000倍。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種蓋塔病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)效率高，當(dāng)病毒含量非常低時(shí)，依然能進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，完全不會(huì)有假陰性的結(jié)果發(fā)生，避免了錯(cuò)誤率，并且該檢測(cè)方法相對(duì)與常用的其他檢測(cè)方法具有更高的敏感性、特異性以及準(zhǔn)確性，此外該檢測(cè)方法還具有很強(qiáng)的應(yīng)用性，可良好的用于蓋塔病毒的檢測(cè)，彌補(bǔ)了蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)空白。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)體系，包括用于擴(kuò)增蓋塔病毒基因序列的引物組以及擁有捕獲蓋塔病毒基因序列的探針，所述引物組由具有SEQ ID No.1所示堿基序列的上游引物，具有SEQ ID No.2所示堿基序列的下游引物組成，所述探針具有SEQ ID No.3所示堿基序列。

本發(fā)明提供的用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)體系，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，其靈敏度可以達(dá)到常規(guī)的RT-PCR技術(shù)的10000倍，該引物組是發(fā)明人通過(guò)參照GenBank收錄的所有蓋塔基因序列保守區(qū)進(jìn)行特定設(shè)計(jì)的一對(duì)具有特異性的引物，因此特異性非常好，采用該引物組以及探針用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在本領(lǐng)域中尚屬首創(chuàng)，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有任何記載。

另外，探針優(yōu)選為T(mén)aqMan探針，這種熒光探針是一種寡核苷酸探針，優(yōu)選地，熒光基團(tuán)FAM連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端，檢測(cè)特異性非常強(qiáng)，只有特異擴(kuò)增產(chǎn)物才會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，非特異擴(kuò)增和引物二聚體不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)同一次反應(yīng)中的多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行多重檢測(cè)。

本發(fā)明還提供了一種用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，具體包括如下步驟：

以上述的檢測(cè)體系對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

本發(fā)明這種蓋塔病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)效率高，當(dāng)病毒含量非常低時(shí)，依然能進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，完全不會(huì)有假陰性的結(jié)果發(fā)生，避免了錯(cuò)誤率，并且該檢測(cè)方法相對(duì)與常用的其他檢測(cè)方法具有更高的敏感性、特異性以及準(zhǔn)確性，此外該檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的應(yīng)用性，可良好的用于蓋塔病毒的檢測(cè)，彌補(bǔ)了蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)空白，也為類似于蓋塔病毒的其他病原基因的檢測(cè)奠定了相關(guān)的定量分析基礎(chǔ)，給本領(lǐng)域技術(shù)人員以相關(guān)技術(shù)啟示。

優(yōu)選地，在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)之前，需要先建立Ct值與標(biāo)準(zhǔn)樣品的不同拷貝數(shù)所構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

優(yōu)選地，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所用的待測(cè)樣品為蓋塔病毒的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

因此，在真正的進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的過(guò)程中，將待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同的反應(yīng)體系和PCR程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到的Ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，即可得到待測(cè)樣品中蓋塔病毒基因的表達(dá)量。

其中，在相同的反應(yīng)體系和PCR程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果是可以直接由電腦軟件讀出的，不需要進(jìn)行后續(xù)處理，這種操作步驟避免了檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性的產(chǎn)生及對(duì)環(huán)境的污染，實(shí)現(xiàn)了待測(cè)樣品的定量檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程大概只需1h左右，相對(duì)于常規(guī)的RT-PCR方法，大大簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了勞動(dòng)效率。

并且，預(yù)先采用標(biāo)準(zhǔn)樣品制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測(cè)樣品以與標(biāo)準(zhǔn)樣品同樣的條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，即可得知待測(cè)樣品中蓋塔病毒基因的表達(dá)量，通過(guò)這種操作方式可以完全避免其他因素對(duì)表達(dá)量的影響，增加了測(cè)定蓋塔病毒基因的準(zhǔn)確度，這也是采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)所在。

更進(jìn)一步的，標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法包括：

(A)提取蓋塔病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

(B)采用上游引物、下游引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目標(biāo)片段，即得。

其中，對(duì)蓋塔病毒的總RNA進(jìn)行實(shí)際提取操作時(shí)，一般是按照以下步驟進(jìn)行：將Vero細(xì)胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)到單層90％密度時(shí)，將培養(yǎng)基棄去，并用PBS溶液洗滌2次，按照MOI:0.5的量將GETV病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基至5mL，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-5d，然后將培養(yǎng)瓶放入-80℃的冰箱中，反復(fù)凍融三次后將病毒液取出，離心轉(zhuǎn)速9000g，離心5min，取上清-80℃保存?zhèn)溆茫缓蟛捎迷噭┖嗅槍?duì)已經(jīng)離心的GETV病毒液上清進(jìn)行總RNA提取，本發(fā)明采用的試劑盒一般為北京全式金生物技術(shù)有限公司ViralDNA/RNAKit試劑盒，按照上述操作步驟即可完成整個(gè)蓋塔病毒的總RNA的提取。

后續(xù)，經(jīng)在Genbank網(wǎng)站，查找GETV毒株M1 NSP1的基因序列(GenBank登錄號(hào)為EU015061)，比對(duì)GenBank中GETV各亞型代表株，XY0904(JN582181)、HB0234(EU015062)、YN0540(EU015063)的NSP1序列，設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物GETV-F，序列為：GAGAAAGAAGTGCTTGC，下游引物GETV-R，序列為：GGTGATCTTCTTTACCAC，擴(kuò)增出的目標(biāo)片段大小為200bp，以用于標(biāo)準(zhǔn)樣品的制作。

回收目標(biāo)片段時(shí)，最好是先將目標(biāo)片段連接至載體上，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，該質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

優(yōu)選地，上述步驟所用的載體為pMD18-T載體。

優(yōu)選地，質(zhì)粒擴(kuò)增的具體步驟為：將回收的目標(biāo)片段克隆至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取生長(zhǎng)良好的菌落培養(yǎng)。

挑取了生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，如果測(cè)序的結(jié)果與GETV毒株M1序列一致的情況下，說(shuō)明本發(fā)明的目標(biāo)基因片段擴(kuò)增完全正確，該質(zhì)粒擴(kuò)增的方法簡(jiǎn)單易行，且容易獲得大量含有目標(biāo)片段的質(zhì)粒。

優(yōu)選地，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq^TMProbe qPCR 10-13μl，上游引物10-12μmol、下游引物10-12μmol，探針4-5μmol，檢測(cè)樣品1-2μl，ddH₂O補(bǔ)齊至25μL。

待測(cè)樣品采用該P(yáng)CR反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到的曲線穩(wěn)定。此外，PCR反應(yīng)體系的選擇可以根據(jù)選用的試劑盒推薦進(jìn)行，還可以選用其他體積，如常用的20μl體系、50μl體系等，其中成分的含量只需要相應(yīng)地降低或升高即可。

優(yōu)選地，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4-95℃預(yù)變性30-35s，94-95℃變性5-7s，55-60℃退火10-15s，72-75℃延伸15-20s，共35-40個(gè)循環(huán)。以該實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增特異性好，擴(kuò)增得到的數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

此外，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA采用相同的PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明的用于蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物組和探針，所述的引物組和探針特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，檢測(cè)的最低模板量可以達(dá)到2.03x10¹copies/μl，而普通的RT-PCR方法最低只能檢測(cè)到2.03x10⁵copies/μl，其靈敏度可以達(dá)到常規(guī)的RT-PCR技術(shù)的10000倍；

(2)本發(fā)明提供的蓋塔病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)效率高，當(dāng)病毒含量非常低時(shí)，依然能進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，完全不會(huì)有假陰性的結(jié)果發(fā)生，避免了錯(cuò)誤率，并且該檢測(cè)方法相對(duì)與常用的其他檢測(cè)方法具有更高的敏感性、特異性以及準(zhǔn)確性；

(3)本發(fā)明的蓋塔病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的應(yīng)用性，可良好的用于蓋塔病毒的檢測(cè)，彌補(bǔ)了蓋塔病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)空白，也為類似于蓋塔病毒的其他病原基因的檢測(cè)奠定了相關(guān)的定量分析基礎(chǔ)，給本領(lǐng)域技術(shù)人員以相關(guān)技術(shù)啟示。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的蓋塔基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的不同拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中不同拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的常規(guī)RT-PCR電泳圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

1、引物與探針的設(shè)計(jì)與合成：

經(jīng)在Genbank網(wǎng)站，查找GETV毒株M1NSP1的基因序列(GenBank登錄號(hào)為EU015061)，比對(duì)GenBank中GETV各亞型代表株，XY0904(JN582181)、HB0234(EU015062)、YN0540(EU015063)的NSP1序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和探針，上游引物GETV-F，序列為：GAGAAAGAAGTGCTTGC，下游引物GETV-R，序列為：GGTGATCTTCTTTACCAC，TaqMan探針序列為：AACCTTCGCATGACACCACC。

2、總RNA的提取及cDNA的合成：

1)將Vero細(xì)胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)到單層90％密度時(shí)，將培養(yǎng)基棄去，并用PBS溶液洗滌2次，按照MOI:0.5的量將GETV病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)充無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基至5mL，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-5d，然后將培養(yǎng)瓶放入-80℃的冰箱中，反復(fù)凍融三次后將病毒液取出，離心轉(zhuǎn)速9000g，離心5min，取上清-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)然后采用北京全式金生物技術(shù)有限公司ViralDNA/RNAKit試劑盒針對(duì)已經(jīng)離心的GETV病毒液上清進(jìn)行總RNA提取；

3)按照北京全式金生物技術(shù)有限公司-UniOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)，將步驟b總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，總cDNA樣品保存至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、蓋塔病毒基因的常規(guī)PCR擴(kuò)增：

以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用引物GETV-F和GETV-R對(duì)蓋塔病毒基因進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。

常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下：

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，再以35個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再72℃延伸10min。

得到的PCR產(chǎn)物取10μL進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。圖1顯示有符合預(yù)期大小(約200bp)的條帶。

4、回收目標(biāo)片段

得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察到符合預(yù)期大小(約200bp)的目標(biāo)片段，用手術(shù)刀片將其小心切下后，擴(kuò)增產(chǎn)物采用OMEGAGelExtractionKit試劑盒純化回收，然后克隆到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α平板，挑取生長(zhǎng)良好的菌落，進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與GETV毒株M1序列一致，表明基因片段的擴(kuò)增完全正確，并采用OMEGAPlasmidMiniKitI試劑盒提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，即為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

實(shí)施例2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用紫外分光光度計(jì)定量，將計(jì)算好拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA作為模板，以10倍系列稀釋，稀釋濃度在2.03×10¹⁰copies/μl，采用熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，在定量熒光PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶解曲線，儀器使用BIO-RADCFX96TMRealTimeSystem，在稀釋的線性濃度范圍內(nèi)，擴(kuò)增曲線良好，呈光滑“S”型，具體擴(kuò)增曲線如圖2所示，反應(yīng)結(jié)束后，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖3所示。

從圖3中可以看出，模板量與對(duì)應(yīng)的Ct值之間線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.99，說(shuō)明本實(shí)施例建立的檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)蓋塔病毒GETV，Ct值分別為28.59、25.17、22.26、19.46、15.71、12.85、10.93和8.73，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-2.8833，截距為31.82，直線方程為y＝-2.8833x+31.82。

其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為：

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火10s，72℃20s，共40個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例3

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度的對(duì)比

將GETV病毒液分別進(jìn)行普通RT-PCR檢測(cè)與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，但是普通RT-PCR檢測(cè)方法最低只能檢測(cè)到2.03×10⁵copies/μl，從圖4的普通RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性電泳圖可以清楚的看到，但是采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的方法卻可以能檢測(cè)到最低模板量為2.03×10¹copies/μl，這一點(diǎn)從圖2的擴(kuò)增曲線結(jié)果也可以清晰的得知，因此其敏感性比普通PCR檢測(cè)方法高10000倍，本發(fā)明的檢測(cè)方法具有更高的靈敏度。

其中圖4中，各樣品病毒拷貝數(shù)為：

1：2.03x10⁸copies/μl

2：2.03x10⁷copies/μl

3：2.03x10⁶copies/μl

4：2.03x10⁵copies/μl

5：2.03x10⁴copies/μl

6：2.03x10³copies/μl

7：2.03x10²copies/μl

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性

利用DPS軟件對(duì)不同濃度cDNA分別進(jìn)行5批次的批內(nèi)和批間的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)均小于1％，批間變異系數(shù)均小于2％，說(shuō)明本發(fā)明的方法具有較好的組間重復(fù)性，該方法獲得的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定。

表2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性

利用本發(fā)明建立起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)分別檢測(cè)了GETV、CDV、HSV、CPV和SIV病毒，具體結(jié)果參照?qǐng)D5，發(fā)現(xiàn)只有GETV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(熒光信號(hào)超過(guò)閾值)，其他對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性(熒光信號(hào)均未超過(guò)閾值)，表明該方法中的引物和探針具有較高的特異性，能夠特異地檢測(cè)到蓋塔病毒。

實(shí)施例4

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法步驟與實(shí)施例2基本相同，只是熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體如下：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為：

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性35s，94℃變性7s，60℃退火15s，75℃15s，共35個(gè)循環(huán)。

用該P(yáng)CR反應(yīng)體系進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，以及待檢測(cè)樣品的檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例2一致。

實(shí)施例5

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法步驟與實(shí)施例2基本相同，只是熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體如下：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為：

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性32s，94℃變性6s，67℃退火12s，73℃17s，共38個(gè)循環(huán)。

用該P(yáng)CR反應(yīng)體系進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，以及待檢測(cè)樣品的檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例2一致。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。