本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，涉及一種病毒核酸定量的方法，特別涉及一種利用數(shù)字PCR檢測圓環(huán)病毒2型核酸含量的方法。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒(PCV)引起的豬的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病，臨床上以新生仔豬先天震顫和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥為主要癥狀。豬圓環(huán)病毒(porcinecircovirus，PCV)在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是最小的動物病毒之一?，F(xiàn)已知PCV有兩個血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒。針對PCV2的鑒定和檢測已經(jīng)有許多方法，如電鏡觀察、ELISA、IFA、PCR、熒光定量PCR(qPCR)等，在上述方法中qPCR技術(shù)具有快速、靈敏、高特異性等特點(diǎn)，因此被越來越多的應(yīng)用于各種病毒的檢測。但是，qPCR的定量只是“相對定量”，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。數(shù)字PCR(PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)是一項檢測和定量核酸的新技術(shù)。20世紀(jì)末，Vogelstein等提出dPCR的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。與qPCR不同的是，dPCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)能夠?qū)⒄`差控制在5％以內(nèi)，dPCR可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)絕對定量分析。由于dPCR是一項具有可重復(fù)性的定量微量DNA分子的優(yōu)良技術(shù).其操作方便、檢測通量高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)使其成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，并已經(jīng)應(yīng)用于單細(xì)胞分析、癌癥早期診斷和產(chǎn)前診斷、疫病檢測等研究領(lǐng)域。將dPCR技術(shù)用于PCV2的檢測，可以快速、準(zhǔn)確的對PCV2核酸進(jìn)行絕對定量。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目是提供一種利用數(shù)字PCR檢測樣品中PCV2核酸濃度的試劑盒及方法。數(shù)字PCR方法在動物疫病檢測、疫苗生產(chǎn)質(zhì)量控制中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明是一種高靈敏度的檢測圓環(huán)病毒2型的方法，步驟包括：(1)樣品中病毒DNA的提取，獲得PCR擴(kuò)增模板；(2)數(shù)字PCR反應(yīng)體系的配置，進(jìn)行dPCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)體系中含有步驟(1)獲得的PCR擴(kuò)增模板、PCV2特異引物對、探針、dNTP和DNA聚合酶；(3)根據(jù)步驟(2)dPCR反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，計算得到所述待測樣品中的PCV2拷貝數(shù)；在上述方法中，所述待測樣品可以為組織病料、也可以是病毒細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的實施例中，所述待測樣品為組織病料，具體為豬淋巴結(jié)、脾和腎臟；(4)當(dāng)所述待檢樣品為組織病料時，上述方法的步驟(1)中，所述“病毒DNA的提取”可為將所述待測樣品(組織病料)進(jìn)行研磨勻漿，凍融3次。將所述待測樣品(組織病料)8000～14000g離心1～5min，溫度可為4℃。取上清液，采用商品化病毒DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。當(dāng)上述樣品為血液、組織液、尿液等液體樣品時，上述方法步驟(1)中，所述“病毒DNA的提取”可為8000～14000g離心1～5min，采用商品化病毒DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。在上述的檢測方法的步驟(2)中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時的退火溫度可為53℃。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時的反應(yīng)程序為：95℃10min；94℃30s，53℃60s，40個循環(huán)；98℃10min。PCR儀升降溫速度設(shè)定為≤2.5℃。在上述的檢測方法的步驟(2)中，所述最佳反應(yīng)體系為2×ddPCRsupermixforprobe10uL，上下游引物各100-900nmol/L，探針100-900nmol/L，模板DNA(cDNA)小于200ng，補(bǔ)滅菌水至總體積20uL；在上述的檢測方法的步驟(2)中，所述PCV2引物具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子引物對，探針為序列表中序列3所示的1條單鏈DNA分子。在上述方法中，所述的探針的熒光基團(tuán)選自6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-羧基熒光數(shù)(HEX)，Cy5(美國LifeTechnologies)、Cy3(美國LifeTechnologies)、VIC(美國LifeTechnologies)，熒光淬滅基團(tuán)選自6-羧基四甲基若丹明(TAMARA)、BHQ1(美國LifeTechnologies)、BHQ2(美國LifeTechnologies)或MGB(美國LifeTechnologies)。在上述方法中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)，并根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號計算所述待測樣品中PCV2核酸拷貝數(shù)。首先，利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的微滴發(fā)生器將配置好的反應(yīng)體系進(jìn)行分液處理，生成10000～20000個油包水的反應(yīng)液滴，使每個微滴的PCR擴(kuò)增模板數(shù)少于或者等于1個；其次，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增并進(jìn)行結(jié)果判斷：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行信號收集，根據(jù)液滴中有熒光信號的液滴數(shù)量確定PCV2DNA模板的數(shù)量?？捎肣uantaSoft(Bio-Rad)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算樣品中病毒的核酸拷貝數(shù)。通過上述方法，可以檢測PCV2的病毒核酸拷貝數(shù)。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明采用數(shù)字PCR技術(shù)檢測PCV2病毒，其檢測的靈敏度略高于熒光定量PCR技術(shù)；而且本方法不用設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)檢測結(jié)果可以直接判讀樣品中PCV2的核酸拷貝數(shù)，極大的簡化了操作步驟。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中：圖1dPCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果(A～H依次為61℃～51℃)圖2dPCR各濃度梯度檢測結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4.85×103copy/ul、4.85×102copy/ul、4.85×101copy/ul、4.85×10-1copy/ul、2.43×10-1copy/ul、1.21×10-1copy/ul、6.06×10-2copy/ul。圖3dPCR各濃度梯度檢測結(jié)果線性關(guān)系圖。具體實施方式：下面結(jié)合附圖和具體實例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。1.主要試驗儀器CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；水平電泳及凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；梯度PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)；超微量分光光度計；QX-i00微滴式數(shù)字PCR儀(Bio-Rad公司)；Thermo核酸提取儀；培養(yǎng)箱；低溫冰箱；恒溫循環(huán)水浴槽；高速冷凍離心機(jī)；常溫離心機(jī)；2試驗材料和試劑病毒DNA/RNA磁珠法提取試劑盒(成都拓洋科技有限公司)；2×PremixExTaqProbeqPCR(TakaRa公司)；2×SsoFastTMProbesSupermix(美國伯樂公司)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖(寶生物工程(大連)有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。圓環(huán)病毒疫苗株由四川華派生物技術(shù)公司提供。引物和探針?biāo)蜕虾；瞪锟萍加邢薰竞铣?，見下表。名稱序列長度bpSeq1CGCTGGAGAAGGAAAAATGG20Seq2CTTGACAGTATATCCGAAGGT21Seq3FAM-TTCAACACCCGCCTCTCCCG-BHQ203病毒DNA模板的制備病毒DNA提取采用成都拓洋科技有限公司的病毒DNA/RNA核酸提取試劑盒按操作說明書進(jìn)行操作。病毒DNA溶于100μl滅菌蒸餾水中，立即使用或-20℃。4微滴式數(shù)字PCR的檢測程序4.1反應(yīng)液的配置采用2×ddPCRsupermixforprobe(Bio-Rad)試劑推薦的20uL體系，以2uL步驟3獲取的模板，加入10uL2×ddPCRsupermixforprobe，加入上下游引物各2uL(終濃度為900nmol/L)，加入探針2uL (終濃度為250nmol/L)，不滅菌水至總體積20uL。4.2反應(yīng)液的處理將20uL樣品反應(yīng)體系加入DG8cartridge中間一排的8個孔內(nèi)，避免引入氣泡，在DG8cartridge最底下的8個孔中各加入70uL微滴生成油(DGoil)，蓋上膠墊，將以上holder放入微滴生成儀，生成微滴。用排槍將生成的微滴緩慢轉(zhuǎn)入96孔板相應(yīng)位置，封膜。4.3PCR擴(kuò)增將封好膜的96孔板轉(zhuǎn)入梯度PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序為95℃，10min；94℃，30s；52℃，60s，40個循環(huán)；98℃，10min)。4.4熒光信號的讀取PCR結(jié)束后將96孔板放入數(shù)字PCR微滴熒光檢測儀進(jìn)行熒光收集，根據(jù)每管反應(yīng)體系中發(fā)出熒光的微滴數(shù)量，根據(jù)泊松定律計算出反應(yīng)體系中的PCV2核酸拷貝數(shù)。試驗同時以實時熒光PCR技術(shù)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，對PCV2進(jìn)行相對定量。計算樣品中PCV2核酸拷貝數(shù)。試驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。檢測結(jié)果見下表：當(dāng)前第1頁1 2 3