本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種同步檢測(cè)五種動(dòng)物源性成分的多重PCR引物體系及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

從核酸分子水平上對(duì)動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定、物種起源和多樣性評(píng)估以及對(duì)動(dòng)物源性食品進(jìn)行檢驗(yàn)研究，是目前動(dòng)物源性成分研究的最有效手段。分子生物學(xué)方法主要是利用DNA分析技術(shù)，根據(jù)基因組中的DNA序列來(lái)確定物種，并且對(duì)于經(jīng)過(guò)熱加工的食品仍能很好地區(qū)分動(dòng)物來(lái)源。DNA的遺傳信息量比蛋白質(zhì)多，且DNA相對(duì)比較穩(wěn)定，經(jīng)高壓滅菌處理的樣品，仍能檢測(cè)到大約300-400bp的DNA片段。與此同時(shí)，DNA作為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，核酸的分離與純化技術(shù)也進(jìn)一步得到發(fā)展。近年來(lái)有不少關(guān)于動(dòng)物全基因組DNA提取的研究和報(bào)道，由于不同的材料和提取方法的差異，提取的基因組DNA純度和量也有所不同，如何選取合適的組織材料，利用恰當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)提取高質(zhì)量的基因組DNA，是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。DNA以其經(jīng)熱加工后良好的穩(wěn)定性作為鑒定動(dòng)物源性成分的重要依據(jù)，高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA的獲得是開(kāi)展該方面研究工作的前提，是保證各質(zhì)檢機(jī)構(gòu)檢測(cè)工作得以順利進(jìn)行的必要條件。而以此為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)廣泛被用來(lái)鑒定食品中的動(dòng)物源性成分，在微生物和動(dòng)物飼料檢測(cè)中已得到成功應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)運(yùn)用該技術(shù)建立了鑒別多種動(dòng)物源性成分的方法，顯示出良好的應(yīng)用前景，彌補(bǔ)了電泳技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、光譜技術(shù)等常規(guī)檢測(cè)方法靈敏度低、檢測(cè)周期長(zhǎng)、對(duì)深加工處理后的肉類(lèi)產(chǎn)品鑒別可靠性低等諸多不足。目前，以檢測(cè)DNA為基礎(chǔ)的方法主要有：常規(guī)PCR-凝膠電泳法、多重PCR-凝膠電泳法、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(PCR-RAPD)、長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、DNA條形碼(DNA barcoding)、實(shí)時(shí)熒光PCR等。

針對(duì)動(dòng)物源性食品中存在的問(wèn)題，我國(guó)近些年也加強(qiáng)了肉類(lèi)安全性的認(rèn)識(shí)，制定了《傳染病防治法》、《動(dòng)物防疫法》、《食品衛(wèi)生法》、《進(jìn)出口商品檢驗(yàn)法》等相關(guān)的法律法規(guī)。目前已頒布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物成分檢測(cè)方法主要采用的是常規(guī)定性PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)單一動(dòng)物源性的定性檢測(cè)。其中，基于常規(guī)PCR-凝膠電泳法的動(dòng)物成分定性分析標(biāo)準(zhǔn)有7項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，4項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和2項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)?；趯?shí)時(shí)熒光PCR法的動(dòng)物成分定性分析標(biāo)準(zhǔn)有3項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，7項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和4項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)。

但是，目前已頒布的常規(guī)PCR-凝膠電泳法和實(shí)時(shí)熒光PCR法的標(biāo)準(zhǔn)方法，只能對(duì)動(dòng)物源性肉及肉制品進(jìn)行單一種的定性檢測(cè)，而對(duì)于成分不明確或混合的加工制品，需要通過(guò)多次檢測(cè)或多重檢測(cè)試驗(yàn)才能確定，其周期長(zhǎng)、工作量大、成本高。在未來(lái)的動(dòng)物源性肉及肉制品的檢測(cè)中，這類(lèi)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越不能勝任一次處理幾種甚至十幾種動(dòng)物源制品的特殊需要，尤其是大數(shù)量的加工產(chǎn)品進(jìn)入商品化生產(chǎn)時(shí)，需要更有效的、快速的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種同步檢測(cè)五種動(dòng)物源性成分的多重PCR引物體系及檢測(cè)方法，利用該方法檢測(cè)牛、豬、羊、雞、鴨肉制品的真?zhèn)渭拌b定是否有摻假時(shí)，靈敏度高，快速且特異性高，大大提高檢測(cè)效率，節(jié)約時(shí)間，而且節(jié)省檢測(cè)成本，特別適用于牛、豬、羊、雞、鴨制品的快速防偽鑒定。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種同步檢測(cè)五種動(dòng)物源性成分的多重PCR引物體系，包括如下五對(duì)引物對(duì)：

(1)針對(duì)牛物種特異性基因設(shè)計(jì)引物對(duì)I：

正向引物：5’-GATTGGACTAGCATTAGCTGCAACC-3’；

反向引物：5’-CTTGAAGGCGTTTGAGGGGTAGTGAT-3’。

(2)針對(duì)豬物種特異性基因設(shè)計(jì)引物對(duì)II：

正向引物：5’-GCCTAAATCTCCCTCAATGGTA-3’；

反向引物：5’-ATGAAAGAGGCAATAGATTTTCG-3’；

(3)針對(duì)羊物種特異性基因設(shè)計(jì)引物對(duì)III：

正向引物：5’-CAATGAAAATAACCGTTCCTAAT-3’；

反向引物：5’-GTAAGGTTGTACTATGAGGATCGTG-3’；

(4)針對(duì)雞物種特異性基因設(shè)計(jì)引物對(duì)IV：

正向引物：5’-AGCAATTCCTACATTGGACACA-3’；

反向引物：5’-GATGATAGTATACCTGCGATTGCA-3’；

(5)針對(duì)鴨物種特異性基因設(shè)計(jì)引物對(duì)V：

正向引物：5’-CACAATCTAGCCTGGACAC-3’；

反向引物：5’-TCGTCTTTAGTCTGGAGTT-3’；

本發(fā)明所述的一種同步檢測(cè)五種動(dòng)物源性成分的多重PCR檢測(cè)方法，其包括如下步驟：

1)以待檢樣品總DNA為模板，利用所述的5重PCR引物體系進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果；其中，所述樣品總DNA模板為牛、豬、羊、雞、鴨物種肉產(chǎn)品中的一種或一種以上；

2)結(jié)果判定：待檢樣品擴(kuò)增出733bp條帶的，判定為牛源性成分陽(yáng)性；待檢樣品擴(kuò)增出212bp條帶的，判定為豬源性成分陽(yáng)性；待檢樣品擴(kuò)增出468bp條帶的，判定為羊源性成分陽(yáng)性；待檢樣品擴(kuò)增出133bp條帶的，判定為雞源性成分陽(yáng)性；待檢樣品擴(kuò)增出292bp條帶的，判定為鴨源性成分陽(yáng)性。

進(jìn)一步，所述多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)體系包括：

所述多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的特定PCR反應(yīng)程序?yàn)椋阂来芜M(jìn)行90-100℃下預(yù)變性5-20min，90-100℃變性20-60s，50-60℃退火30-60s，70-74℃延伸60-150s，進(jìn)行30-60次循環(huán)，70-74℃下延伸5-20min，最后在4-20℃下保持＞1min后結(jié)束。

優(yōu)選的，所述多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)體系包括：

優(yōu)選的，所述多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的特定PCR反應(yīng)程序?yàn)椋阂来芜M(jìn)行95℃下預(yù)變性10min，94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，進(jìn)行35次循環(huán)，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后結(jié)束。

更優(yōu)選的，所述多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)體系包括：

針對(duì)動(dòng)物源性成分的核酸擴(kuò)增的所有檢測(cè)方法中，其檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏性主要受到靶核酸序列來(lái)源的影響，因此，選擇目標(biāo)基因的靶序列是關(guān)鍵點(diǎn)。本發(fā)明的多重PCR體系在同一PCR體系與同一反應(yīng)程序中可對(duì)五種動(dòng)物源性成分進(jìn)行高效擴(kuò)增，這5種動(dòng)物特異性引物的選擇成為其關(guān)鍵。

本發(fā)明通過(guò)分析牛、豬、羊、雞和鴨5種動(dòng)物線粒體DNA中的遺傳不保守區(qū)域基因，進(jìn)行序列測(cè)定及比對(duì)后，根據(jù)各序列上的特異堿基位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了各物種的特異性PCR引物對(duì)即引物對(duì)I、引物對(duì)II、引物對(duì)III、引物對(duì)IV、引物對(duì)V，所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)僅對(duì)相應(yīng)的物種總DNA模板有擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)其它物種沒(méi)有目的擴(kuò)增信號(hào)，同時(shí)，五種擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小不一，且能夠通過(guò)電泳分開(kāi)，非常適合牛、豬、羊、雞、鴨的多重PCR檢測(cè)。

在多重PCR反應(yīng)體系中，退火溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物與模板不能穩(wěn)定的結(jié)合，影響擴(kuò)增效果。退火溫度過(guò)低則導(dǎo)致引物與模板發(fā)生非特異性結(jié)合。本發(fā)明針對(duì)這5種動(dòng)物設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)的熔解溫度相近，將退火溫度的梯度設(shè)置在引物理論熔解溫度值上下5℃的范圍內(nèi)，且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度之間相差在80bp以上，特異性高。

本發(fā)明設(shè)置了合適的引物濃度，各引物濃度在0.1-0.4體積份，在多重PCR反應(yīng)體系中，當(dāng)引物濃度較小時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量隨著引物濃度的增加而增加，當(dāng)引物濃度到達(dá)一個(gè)飽和值時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量不再隨著引物濃度的增加而增加，而是基本保持不變。當(dāng)引物過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致引物與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，以及引物之間形成二聚體，影響擴(kuò)增效果。引物濃度的飽和值和模板的量有關(guān)(模板的量越大，引物的飽和值越高)，也和引物與模板的結(jié)合能力、引物之間形成二聚體的能力有關(guān)，引物與模板的結(jié)合能力越強(qiáng)、形成二聚體越少，飽和值就越低，反之越高。

本發(fā)明所述多重PCR檢測(cè)方法用于單物種總DNA模板進(jìn)行牛、豬、羊、雞、鴨的物種檢測(cè)，且所述多重PCR檢測(cè)方法用于多物種混合總DNA模板進(jìn)行牛和/或豬和/或羊和/或雞和/或鴨的物種檢測(cè)。所述多重PCR檢測(cè)方法尤其適用于檢測(cè)牛、豬、羊、雞、鴨產(chǎn)品的真?zhèn)渭皳郊勹b定。

本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明所述多重PCR引物體系的牛豬羊雞鴨動(dòng)物源性成分檢測(cè)的多重PCR檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所述多重PCR檢測(cè)試劑盒可以將本發(fā)明所述PCR引物體系以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。其中，所述相關(guān)試劑可以為本發(fā)明中所述PCR反應(yīng)體系中除了總DNA模板以外的其他試劑；也可以為其他適用的除樣品總DNA模板外的試劑，如用于PCR反應(yīng)的一些常規(guī)試劑，或由本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)有限次實(shí)驗(yàn)得到的常規(guī)試劑的組合物等。此外本發(fā)明所述多重PCR檢測(cè)試劑盒中還包括有實(shí)施本發(fā)明所需的基本用具。

本發(fā)明所述多重PCR試劑盒用于單物種總DNA模板進(jìn)行牛、豬、羊、雞、鴨的物種檢測(cè)，且所述多重PCR試劑盒用于多物種混合總DNA模板進(jìn)行牛和/或豬和/或羊和/或雞和/或鴨的物種檢測(cè)。所述試劑盒尤其適用于檢測(cè)牛、豬、羊、雞、鴨產(chǎn)品的真?zhèn)渭皳郊勹b定。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明的多重PCR引物體系中的引物對(duì)均僅對(duì)各自物種的目標(biāo)片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，不會(huì)擴(kuò)增到其它區(qū)域且不會(huì)與其他物種起反應(yīng)，因此，使用本發(fā)明的多重PCR引物體系可以一次性檢測(cè)牛、豬、羊、雞、鴨5個(gè)動(dòng)物物種，從而有效的縮短檢測(cè)時(shí)間。

2.利用本發(fā)明所述多重PCR檢測(cè)方法，經(jīng)一次PCR即可鑒別5種動(dòng)物源性成分，不需要對(duì)每種動(dòng)物源性成分分別進(jìn)行確證檢測(cè)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，加快了檢出速度。本發(fā)明優(yōu)化的特定PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，采用統(tǒng)一的PCR檢測(cè)方法，簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，建立了快速高效且特異性高的檢測(cè)方式，尤其適用于牛、豬、羊、雞、鴨制品的快速防偽鑒定。

3.本發(fā)明的多重PCR引物體系及PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，較普通PCR更為快速、簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)5種動(dòng)物源性成分的快速、準(zhǔn)確、特異的檢測(cè)和分析，從而有效的鑒定牛豬羊雞鴨肉制品的真?zhèn)渭皳郊偾闆r，為牛、豬、羊、雞、鴨肉制品的質(zhì)量控制提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)的檢測(cè)手段。

4.本發(fā)明所述多重PCR引物體系配合相關(guān)試劑制成多重PCR試劑盒，方便使用，同時(shí)為工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了可能，其應(yīng)用前景極好。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中多重PCR擴(kuò)增體系中鴨物種引物的不同添加量所得瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-3：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，雞1.0μl，鴨1.0μl；4-6：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，雞1.0μl，鴨0.8μl；7-9：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，雞1.0μl，鴨0.6μl；10-12：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，雞1.0μl，鴨0.4μl；13-15：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，雞1.0μl，鴨0.2μl，M代表標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量標(biāo)簽(1000為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上向下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中多重PCR擴(kuò)增體系中雞物種引物的不同添加量所得瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-3：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞1.0μl；4-6：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.8μl；7-9：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl；10-12：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.4μl；13-15：牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.2μl，M代表標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量標(biāo)簽(1000為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上向下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中多重PCR擴(kuò)增體系中豬物種引物的不同添加量所得瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-3：牛1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬1.0μl；4-6：牛1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.8μl；7-9：牛1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl；10-12：牛1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.4μl；13-15：牛1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.2μl，M代表標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量標(biāo)簽(1000為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上向下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例4中多重PCR擴(kuò)增體系中牛物種引物的不同添加量所得瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-3：羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛1.0μl；4-6：羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛0.8μl；7-9：羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛0.6μl；10-12：羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛0.4μl；13-15：羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛0.2μl，M代表標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量標(biāo)簽(1000為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上向下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例5中多重PCR擴(kuò)增體系中羊物種引物不同添加量所得瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-3：羊1.0μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛1.0μl；4-6：羊1.2μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛1.0μl；7-9：羊1.4μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛1.0μl；10-12：羊1.6μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛1.0μl；13-15：羊1.8μl，鴨0.6μl，雞0.6μl，豬0.6μl，牛1.0μl，M代表標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量標(biāo)簽(1000為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上向下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

在鴨物種的不同引物添加量下，以牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為0.5ng/μl，作為樣品模板，用牛、豬、羊、雞、鴨的特異性引物的多重PCR體系和反應(yīng)條件，分別擴(kuò)增牛豬羊雞鴨的基因組，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。具體步驟如下：

1)等量混合總DNA樣品的處理：將牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品按照等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為0.5ng/μl，作為樣品模板，并將引物稀釋至10μmol/L；

2)反應(yīng)體系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反應(yīng)組分，反應(yīng)體系50μl/管。雙蒸水28-29.6μl，l0×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，2.5mM的dNTPs 4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，總DNA模板1μl，10μM引物對(duì)I、引物對(duì)II、引物對(duì)III、引物對(duì)IV、引物對(duì)V的正向引物和反向引物，牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，雞1.0μl，鴨1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶為常規(guī)Taq酶(參見(jiàn)Tiangen公司的Taq酶說(shuō)明書(shū))。

3)PCR反應(yīng)程序的制定：依次進(jìn)行95℃下預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸90s，進(jìn)行35次循環(huán)，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后結(jié)束，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

4)2wt％瓊脂糖凝膠電泳：將3)中所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2wt.％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入溴化乙錠(EB)進(jìn)行染色，然后再120V下電泳30分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶遷移至凝膠邊緣時(shí)停止電泳，則凝膠成像。所得凝膠成像結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在一定的多重PCR體系和擴(kuò)增條件中，變化不同鴨物種的引物添加量，當(dāng)鴨的用量為0.4-0.8μl時(shí)(0.08-0.16體積份)，均能從總DNA混合模板中擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)物種的特異性大小的條帶，驗(yàn)證了不同鴨物種的不同引物添加量的PCR體系和擴(kuò)增條件中各物種特異性引物的有效性和特異性。

實(shí)施例2

在雞物種的不同引物添加量下，以牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為50ng/μl，作為樣品模板，用牛、豬、羊、雞、鴨的特異性引物的多重PCR體系和反應(yīng)條件，分別擴(kuò)增牛豬羊雞鴨的基因組，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。具體步驟如下：

(1)等量混合總DNA樣品的處理：將牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品按照等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為50ng/μl，作為樣品模板，并將引物稀釋至10μmol/L；

(2)反應(yīng)體系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反應(yīng)組分，反應(yīng)體系50μl/管。雙蒸水28.8-30.4μl，l0×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，總DNA模板1μl，10μM引物對(duì)I、引物對(duì)II、引物對(duì)III、引物對(duì)IV、引物對(duì)V的正向引物和反向引物，牛1.0μl，豬1.0μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，雞1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶為常規(guī)Taq酶(參見(jiàn)Tiangen公司的Taq酶說(shuō)明書(shū))。

(3)PCR反應(yīng)程序的制定：依次進(jìn)行95℃下預(yù)變性10min，94℃變性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，進(jìn)行45次循環(huán)，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后結(jié)束，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

(4)2wt％瓊脂糖凝膠電泳：將3)中所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2wt.％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入溴化乙錠(EB)進(jìn)行染色，然后再120V下電泳30分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶遷移至凝膠邊緣時(shí)停止電泳，則凝膠成像。所得凝膠成像結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在一定的多重PCR體系和擴(kuò)增條件中，變化不同雞物種的引物添加量，當(dāng)雞的用量為0.2-1.0μl時(shí)(0.04-0.20體積份)均能從總DNA混合模板中擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)物種的特異性大小的條帶，驗(yàn)證了不同雞物種的不同引物添加量的PCR體系和擴(kuò)增條件中各物種特異性引物的有效性和特異性。

實(shí)施例3

在豬物種的不同引物添加量下，以牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為100ng/μl，作為樣品模板，用牛、豬、羊、雞、鴨的特異性引物的多重PCR體系和反應(yīng)條件，分別擴(kuò)增牛豬羊雞鴨的基因組，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。具體步驟如下：

(1)等量混合總DNA樣品的處理：將牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品按照等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為100ng/μl，作為樣品模板，并將引物稀釋至10μmol/L；

(2)反應(yīng)體系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反應(yīng)組分，反應(yīng)體系50μl/管。雙蒸水29.6-31.2μl，l0×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，總DNA模板1μl，10μM引物對(duì)I、引物對(duì)II、引物對(duì)III、引物對(duì)IV、引物對(duì)V的正向引物和反向引物牛1.0μl，雞0.6μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，豬1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶為常規(guī)Taq酶(參見(jiàn)Tiangen公司的Taq酶說(shuō)明書(shū))。

(3)PCR反應(yīng)程序的制定：依次進(jìn)行95℃下預(yù)變性10min，94℃變性50s，64℃退火50s，72℃延伸90s，進(jìn)行45次循環(huán)，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后結(jié)束，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

(4)2wt％瓊脂糖凝膠電泳：將3)中所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2wt.％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入溴化乙錠(EB)進(jìn)行染色，然后再120V下電泳30分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶遷移至凝膠邊緣時(shí)停止電泳，則凝膠成像。所得凝膠成像結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在一定的多重PCR體系和擴(kuò)增條件中，變化不同豬物種的引物添加量，當(dāng)豬的用量為0.4-0.8μl時(shí)(0.08-0.16體積份)均能從總DNA混合模板中擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)物種的特異性大小的條帶，驗(yàn)證了不同豬物種的不同引物添加量的PCR體系和擴(kuò)增條件中各物種特異性引物的有效性和特異性。

實(shí)施例4

在牛物種的不同引物添加量下，以牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為150ng/μl，作為樣品模板，用牛、豬、羊、雞、鴨的特異性引物的多重PCR體系和反應(yīng)條件，分別擴(kuò)增牛豬羊雞鴨的基因組，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。具體步驟如下：

(1)等量混合總DNA樣品的處理：將牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品按照等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為150ng/μl，作為樣品模板，并將引物稀釋至10μmol/L；

(2)反應(yīng)體系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反應(yīng)組分，反應(yīng)體系50μl/管。雙蒸水30.4-32μl，l0×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，總DNA模板1μl，10μM引物對(duì)I、引物對(duì)II、引物對(duì)III、引物對(duì)IV、引物對(duì)V的正向引物和反向引物，豬0.6μl，雞0.6μl，羊1.0μl，鴨0.6μl，牛1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶為常規(guī)Taq酶(參見(jiàn)Tiangen公司的Taq酶說(shuō)明書(shū))。

(3)PCR反應(yīng)程序的制定：依次進(jìn)行95℃下預(yù)變性10min，94℃變性30s，58℃退火35s，72℃延伸90s，進(jìn)行50次循環(huán)，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后結(jié)束，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

(4)2wt％瓊脂糖凝膠電泳：將3)中所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2wt.％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入溴化乙錠(EB)進(jìn)行染色，然后再120V下電泳30分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶遷移至凝膠邊緣時(shí)停止電泳，則凝膠成像。所得凝膠成像結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在一定的多重PCR體系和擴(kuò)增條件中，變化不同牛物種的引物添加量，當(dāng)牛的用量為0.4-1.0μl時(shí)(0.08-0.20體積份)均能從總DNA混合模板中擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)物種的特異性大小的條帶，驗(yàn)證了不同牛物種的不同引物添加量的PCR體系和擴(kuò)增條件中各物種特異性引物的有效性和特異性。

實(shí)施例5

在羊物種的不同引物添加量下，以牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為200ng/μl，作為樣品模板，用牛、豬、羊、雞、鴨的特異性引物的多重PCR體系和反應(yīng)條件，分別擴(kuò)增牛豬羊雞鴨的基因組，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。具體步驟如下：

(1)等量混合總DNA樣品的處理：將牛、豬、羊、雞、鴨5種動(dòng)物的總DNA樣品按照等量混合后，稀釋到最終DNA濃度為200ng/μl，作為樣品模板，并將引物稀釋至10μmol/L；

(2)反應(yīng)體系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反應(yīng)組分，反應(yīng)體系50μl/管。雙蒸水29.6-31.2μl，l0×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，總DNA模板1μl，10μM引物對(duì)I、引物對(duì)II、引物對(duì)III、引物對(duì)IV、引物對(duì)V的正向引物和反向引物，豬0.6μl，雞0.6μl，牛0.6μl，鴨0.6μl，羊1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl，其中Taq酶為常規(guī)Taq酶(參見(jiàn)Tiangen公司的Taq酶說(shuō)明書(shū))。

(3)PCR反應(yīng)程序的制定：依次進(jìn)行95℃下預(yù)變性10min，94℃變性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，進(jìn)行35次循環(huán)，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后結(jié)束，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

(4)2wt％瓊脂糖凝膠電泳：將3)中所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2wt.％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入溴化乙錠(EB)進(jìn)行染色，然后再120V下電泳30分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶遷移至凝膠邊緣時(shí)停止電泳，則凝膠成像。所得凝膠成像結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在一定的多重PCR體系和擴(kuò)增條件中，變化不同羊物種的引物添加量，當(dāng)羊的用量為1.0-1.8μl時(shí)(0.20-0.36體積份)均能從總DNA混合模板中擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)物種的特異性大小的條帶，驗(yàn)證了不同羊物種的不同引物添加量的PCR體系和擴(kuò)增條件中各物種特異性引物的有效性和特異性。

最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。