一種利用線粒體dna鑒別牛羊肉中貂肉的lamp檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用線粒體DNA鑒別牛羊肉中貂肉的LAMP檢測(cè)方法，屬于分子生 物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來隨著市場對(duì)牛羊肉的需求逐漸增加及價(jià)格快速上漲，一些不法商販在利益 的驅(qū)動(dòng)下，摻加其他廉價(jià)肉造假冒充牛羊肉。2012年以來，國內(nèi)曝光了多起以豬肉、雞肉、鴨 肉冒充牛羊肉的事件。而在一些以皮毛為主的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖地區(qū)，貂肉和狐貍?cè)獾娜?向成了一個(gè)謎，不少人推測(cè)其被摻入了牛羊肉中進(jìn)入了人們的餐桌。這種現(xiàn)象不僅擾亂了 經(jīng)濟(jì)秩序，而且嚴(yán)重危害人們身體健康。
[0003] 目前，用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)的方法主要有常規(guī)PCR、熒光定量PCR等，但上述診 斷方法花費(fèi)時(shí)間較長，而且判定結(jié)果需要借助精密儀器設(shè)備，難以在實(shí)際生產(chǎn)中普及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決采用常規(guī)PCR、熒光定量PCR法檢測(cè)牛羊肉中摻入貂肉所存在的上述技 術(shù)問題，本發(fā)明利用LAMP技術(shù)和動(dòng)物線粒體DNA上細(xì)胞色素 C氧化酶亞單位I (COX I )基 因?qū)︴跞膺M(jìn)行鑒定，整個(gè)反應(yīng)在恒溫水浴鍋中進(jìn)行40min即可，而且可以通過在終產(chǎn)物中 加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種利用線粒體DNA鑒別牛羊肉中貂肉的LAMP檢測(cè)方法，以待測(cè)肉品的DNA作為模 板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP為引物構(gòu)建LAMP檢測(cè)體系；LAMP檢測(cè)體系于64°C恒溫水 浴中反應(yīng)40min，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入IuL熒光染料SYBR GREEN I ;若反應(yīng)液變成 綠色，說明待測(cè)肉品中存在貂肉；若為橘黃色，則待測(cè)肉品中不存在貂肉； 所用引物如下： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. 1 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示； 所述LAMP檢測(cè)體系，總體積為25uL ;其組成如下 lOumol/L 的 DAF3、DAB3 各 0· 5uL，10umol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL，模板2uL，余量為超純水。
[0006] 本發(fā)明的檢測(cè)方法與傳統(tǒng)PCR相比，在普通恒溫水浴鍋中反應(yīng)40 min即可完成， 而且可以通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果，能快速準(zhǔn)確地鑒定出動(dòng)物 源性成分；具備操作簡便、對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求較低、結(jié)果判定容易的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明無需借助于 大型的昂貴儀器設(shè)備，更適合于基層的現(xiàn)地檢測(cè)，具有廣闊的市場前景和較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì) 效益。
[0007] 本發(fā)明選用線粒體DNA上細(xì)胞色素 C氧化酶亞單位I (COX I )基因作為目的基 因；以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP為引物，能特異性地?cái)U(kuò)增貂肉COX I基因，從而將貂肉從 羊肉、牛肉中檢測(cè)出來；且能夠?qū)⑵渑c貓、狐貍等相近種屬的肉區(qū)分開來；具備特異性高的 優(yōu)點(diǎn)。另外，采用DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP為引物，其靈敏度高，所能檢測(cè)到的最低濃度為 2X 10 4ng/uL ;因此，即使摻雜有微量貂肉也能被檢測(cè)出來。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種上述LAMP檢測(cè)方法所用檢測(cè)試劑，含有如下引物： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. 1 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種上述LAMP檢測(cè)方法所用檢測(cè)試劑盒，含有l(wèi)Oumol/L的DAF3、 DAB3 各 0· 5uL，lOumol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL ; 其中： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. I 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【附圖說明】
[0010] 圖I為實(shí)施例1檢測(cè)結(jié)果圖；從左向右順序?yàn)椋宏幮詫?duì)照，陽性對(duì)照，牛肉，羊肉， 狗肉，貓肉，狐貍?cè)?，貂肉；結(jié)果顯示：第2、8管為綠色，其余為橘黃色； 圖2為PCR檢測(cè)方法靈敏度示意圖；從右向左順序?yàn)椋篗arker，10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5 稀釋度； 圖3為LAMP檢測(cè)方法靈敏度示意圖；從左向右順序?yàn)椋篗arker，10 1UO 2、10 3、10 4、10 5 稀釋度。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下述實(shí)施例中：所用試劑除由生產(chǎn)廠家直接提供的以外，其它均為分析純；水，如 果沒有特別說明，為超純水。
[0012] 實(shí)施例1設(shè)計(jì)引物 從GenBank中檢索獲得貂的COX I序列，并進(jìn)行軟件比對(duì)分析，確定序列的準(zhǔn)確性；根 據(jù)上述序列利用PrimerExplore軟件設(shè)計(jì)引物如下： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT (如 SEQ ID NO. 1 所示）， DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT (如 SEQ ID 勵(lì).2所示）， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC (如 SEQ ID 勵(lì).3所示）， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC (如 SEQ ID 勵(lì).4所示）。
[0013] 實(shí)施例2特異性實(shí)驗(yàn) (1)提取樣品DNA作為模板 嚴(yán)格無菌采集牛、羊、狗、貓、狐貍、貂的新鮮肌肉組織作為樣品，然后采用酚氯仿提取 法分別提取樣品中的DNA。分別以超純水(陰性對(duì)照)，本實(shí)驗(yàn)室保存的含有貂肉COX I基因 的陽性質(zhì)粒（陽性對(duì)照)，牛肉DNA，羊肉DNA，狗肉DNA，貓肉DNA，狐貍?cè)釪