NA，貂肉DNA為模 板建立LAMP反應體系；DNA模板濃度均為20ng/uL。
[0014] (2 ) LAMP反應體系的建立 通過摸索內(nèi)外引物濃度比、dNTP濃度、反應溫度、反應時間等建立的LAMP反應體系： 25 μ L，其組成為：10umol/L 的 DAF3、DAB3 各 0· 5uL，lOumol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL， 2.5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgS04 2uL，5mol/L 的 Betaine2.5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL，最低濃度為20ng/uL的模板2uL，余量為超純水。
[0015] 其中，dNTP和1%304購自寶生物工程(大連)有限公司、Betaine購自美國Sigma公 司、Bst DNA 聚合酶（8U/ uL)和 IOXThermo buffer 購自美國 NEB 公司、SYBR GREEN I 核 酸染料購自北京Solarbio公司。
[0016] LAMP擴增反應 將上述LAMP反應體系(按照實施例1獲取模板的順序排列）同時置于64°C恒溫水浴中 進行LAMP擴增40min;反應結(jié)束后加入IuL熒光染料SYBR GREEN I ;反應液顏色依次為橘 黃色、綠色、橘黃色、橘黃色、橘黃色、橘黃色、橘黃色、綠色(如圖1所示)。其中，橘黃色為陰 性結(jié)果，綠色為陽性結(jié)果。
[0017] 實施例3 從山東省內(nèi)屠宰廠采集鮮牛肉樣品30個，鮮羊肉樣品30個；從山東省動物醫(yī)院采集 鮮貂肉樣品10個；采用實例1的方法提取樣品的DNA作為模板、建立LAMP反應體系、進行 LAMP擴增反應，檢測結(jié)果如表1所示： 表1
[0018] 由實施例2和3可以得出，實施例1的引物能特異性擴增貂肉DNA，只有模板中含 有貂肉DNA時，向LAMP反應產(chǎn)物加入熒光染料SYBR GREEN I后的反應液才顯示綠色；而 模板中含有其他任意非貂肉（牛、羊、貓、狐貍、狗） DNA時，向LAMP反應產(chǎn)物加入熒光染料SYBR GREEN I后的反應液顯示橘黃色。因此， 以實施例1的引物，采用上述LAMP反應體系，以熒光染料SYBR GREEN I作為顯色劑，能夠 將貂肉與其他動物(牛、羊、貓、狐貍、狗）的肉區(qū)分開來；從而能用于鑒別肉品中是否含有貂 肉。
[0019] 實施例4靈敏度實驗 將實施例1的陽性對照所用DNA分別以10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5的稀釋度進行稀釋，分 另似稀釋后的DNA為模板，分別進行LAMP和PCR，比較兩種檢測方法的靈敏度。結(jié)果顯示： LAMP法的擴增靈敏度比普通PCR法要高；普通PCR可以檢測到第3個稀釋梯度(如圖2所 示）；而LAMP法在第4個稀釋梯度仍可以檢測到(如圖3所示)。
【主權(quán)項】
1. 一種利用線粒體DNA鑒別牛羊肉中貂肉的LAMP檢測方法，其特征在于，以待測肉品 的DNA作為模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP為引物構(gòu)建LAMP檢測體系；LAMP檢測體系于 64°C恒溫水浴中反應40min，反應結(jié)束后向反應液中加入IuL熒光染料SYBR GREENI;若 反應液變成綠色，說明待測肉品中存在貂肉；若為橘黃色，則待測肉品中不存在貂肉； 所用引物如下： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. 1 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示； 所述LAMP檢測體系，總體積為25uL ;其組成如下 lOumol/L 的 DAF3、DAB3 各 0? 5uL，10umol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL，模板2uL，余量為超純水。2. -種利用線粒體DNA鑒別牛羊肉中貂肉的LAMP檢測方法所用檢測試劑，其特征在 于，含有如下引物： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. 1 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示。3. -種利用線粒體DNA鑒別牛羊肉中貂肉的LAMP檢測方法所用檢測試劑盒，其特征 在于，含有 lOumol/L 的 DAF3、DAB3 各 0? 5uL，lOumol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL，2. 5mmol/ L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL， 10 X Thermo buffer 2. 5uL ； 其中： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. I 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用線粒體DNA鑒別牛羊肉中貂肉的LAMP檢測方法，屬于分子生物學檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測方法以待測肉品的DNA作為模板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP為引物構(gòu)建LAMP檢測體系；LAMP檢測體系于64℃恒溫水浴中LAMP反應40min，反應結(jié)束后向反應液中加入1？uL熒光染料SYBR？GREEN？Ⅰ；若反應液變成綠色，說明待測肉品中存在貂肉；若為橘黃色，則待測肉品中不存在貂肉。本發(fā)明的檢測方法與傳統(tǒng)PCR相比，在普通恒溫水浴鍋中反應40？min即可完成，而且可以通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果，能快速準確地鑒定出動物源性成分；具備操作簡便、對實驗儀器要求較低、結(jié)果判定容易的優(yōu)點。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105018611
【申請?zhí)枴緾N201510411167
【發(fā)明人】劉少寧, 陳智, 高迎春, 吳家強, 邵兵, 楊志昆, 蘇梅, 姚震, 王貴升, 程瑞紅
【申請人】山東省獸藥質(zhì)量檢驗所
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月14日