本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及前列腺癌的診療標(biāo)記物，具體該標(biāo)記物為NCRNA00087。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠遠低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時，病變已達晚期，預(yù)后不良。前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸指檢、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。PSA(ProstateSpecificAntigen)為前列腺組織特異性抗原，由前列腺的解剖結(jié)構(gòu)可知PSA通過前列腺導(dǎo)管進入血液和尿液中，一些病例或生理情況下PSA會進入血液中去，如前列腺炎癥、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通過檢測血清PSA水平來預(yù)測前列腺癌具有一定的假陽性率。從1991年開始，檢測血清中PSA含量用于預(yù)測前列腺癌，含量高于4ng/mL認為是前列腺癌陽性，靈敏度79％，特異性20％-59％，平均靈敏度約33％，在濃度4-10ng/mL灰區(qū)部分，特異性是最低的，這時往往需要通過侵入性的穿刺活檢進行確定，給患者帶來極大痛苦及精神和經(jīng)濟負擔(dān)。所以PSA并不能較好的作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物。直腸指檢是最簡單、最經(jīng)濟實用的方法，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用以發(fā)現(xiàn)很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機會。但以上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個方面：(1)患者前列腺腫塊不大時，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治；(3)患者直腸有疾患時不能使用此檢測；(4)醫(yī)生經(jīng)驗不足時可能有漏診或者誤診的可能。目前，對于中晚期前列腺癌患者，手術(shù)治療的效果差，大多數(shù)采用藥物治療。根據(jù)不同的病情可以采用化學(xué)藥物治療、外放射治療、放射性核素內(nèi)放射治療以及各種療法的綜合應(yīng)用等。然而，放化療藥物不僅作用于腫瘤，還可以作用于腫瘤周圍健康的組織，因而在殺傷腫瘤的同時，也給機體帶來了很大的副作用，最終影響對腫瘤的治療效果。大量的高通量基因組平臺數(shù)據(jù)表明超過98％的基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為不編碼蛋白的非編碼RNA，其中長非編碼RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA。越來越多的證據(jù)表明lncRNAs在多種生物進程和疾病進展中發(fā)揮重要作用，例如免疫反應(yīng)、細胞分化、代謝、腫瘤發(fā)生及發(fā)展。lncRNAs因其在致癌與腫瘤抑制途徑中顯露出的潛在作用而成為腫瘤研究的新熱點。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)早期判斷前列腺癌的特異性標(biāo)志物，并開發(fā)前列腺癌的靶向藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的前列腺癌的診療標(biāo)記物NCRNA00087。本發(fā)明的目的之二在于提供一種用于檢測前列腺癌的診斷試劑盒。本發(fā)明的目的之三在于提供一種NCRNA00087抑制劑。本發(fā)明的目的之四在于提供一種治療前列腺癌的藥物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測前列腺癌的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為NCRNA00087。優(yōu)選地，所述NCRNA00087在前列腺癌組織中表達上調(diào)；優(yōu)選地，檢測NCRNA00087在前列腺癌組織中表達上調(diào)的方法包括核酸芯片檢測法或熒光定量PCR法。優(yōu)選地，所述NCRNA00087包括如SEQIDNO:1所示的特異性核苷酸序列。進一步地，本發(fā)明提供了一種用于檢測前列腺癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴增前列腺癌相關(guān)lncRNA的引物和說明書，所述前列腺癌相關(guān)lncRNA是NCRNA00087。優(yōu)選地，所述引物具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物。優(yōu)選地，所述的說明書中注明以下內(nèi)容：當(dāng)檢測對象的前列腺癌細胞或組織中NCRNA00087表達量E1與正常前列腺細胞或組織的NCRNA00087表達量E2之比≥2，則提示該檢測對象前列腺癌的幾率高于普通人群。所述的E1是檢測對象的前列腺癌細胞或組織的NCRNA00087表達量；所述的E2是正常人群的正常前列腺細胞或組織的NCRNA00087表達量。所述的正常前列腺細胞或組織包括癌旁的前列腺細胞或組織。所述的表達量是相對于對照基因(如GAPDH)的相對表達量。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen熒光染料。進一步地，本發(fā)明提供了一種NCRNA00087抑制劑，所述抑制劑包括NCRNA00087的siRNA。優(yōu)選地，所述的NCRNA00087抑制劑能夠抑制NCRNA00087的表達或者能夠抑制NCRNA00087的功能。優(yōu)選地，所述治療前列腺癌的抑制劑含有下列中的一組或幾組siRNA：SEQIDNO.6和SEQIDNO.7，SEQIDNO.8和SEQIDNO.9。更優(yōu)選的，所述治療前列腺癌的抑制劑含有siRNA序列為SEQIDNO.8和SEQIDNO.9。進一步地，上述抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的生物制劑中的應(yīng)用。進一步地，本發(fā)明提供了一種治療前列腺癌的藥物，所述藥物包括上述的抑制劑。優(yōu)選地，所述的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括但不限于：稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。優(yōu)選地，所述的藥物通過選自下組的用藥方式進行給藥：口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用藥。所述的藥物的制劑選自下組：片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、噴霧劑。所述的NCRNA00087抑制劑以0.01-20mg/kg體重的劑量(每次或每天)施用于哺乳動物。所述的哺乳動物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，為人。本發(fā)明的藥物可以是單方制劑，也可以是復(fù)方制劑。在復(fù)方制劑中，除了含有NCRNA00087抑制劑之外，還可包含其他抗腫瘤化合物，例如化療劑。代表性的化療劑，包括但并不限于，烷化劑、抗代謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物以及相關(guān)抑制劑、長春花堿類、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、干擾素、鉑配位復(fù)合物、大黃素取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、腎上腺皮質(zhì)類固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-釋放激素類似物。優(yōu)選的化療劑包括：5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸、伊立替康、奧沙利鉑、卡培他濱、紫杉醇和多西紫杉醇。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與前列腺癌相關(guān)的NCRNA00087，并進一步證實該NCRNA00087在前列腺癌組織中表達上調(diào)。利用該lncRNA檢測前列腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1NCRNA00087在前列腺癌組織樣本和癌旁組織樣本中的表達情況。圖2NCRNA00087-siRNA顯著抑制前列腺癌細胞增殖。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對前列腺癌組織樣本及癌旁組織樣本進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息學(xué)方法進行基因篩選，挑選出候選lncRNANCRNA00087，現(xiàn)有研究中并沒有NCRNA00087和前列腺癌相關(guān)的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子生物學(xué)方法驗證，證實了NCRNA00087在前列腺癌細胞中表達上調(diào)。本發(fā)明的NCRNA00087是在本發(fā)明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號：NCBI參考序列:NR_024493.2，來源于人類基因組。本發(fā)明還采用RT-PCR方法檢測上述lncRNA在前列腺癌組織和癌旁正常組織的表達，并驗證了該lncRNA在前列腺癌中表達上調(diào)。本文使用的術(shù)語“表達上調(diào)”指對應(yīng)于所表達基因的序列，其中序列量的測量證明，與從正常個體或從通過前列腺癌分期確定與前列腺癌不同的已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學(xué)樣品中的同一基因相比，所述基因在從患前列腺癌或通過前列腺癌分期確定的前列腺癌已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學(xué)樣品中的表達水平增加。根據(jù)本發(fā)明，“表達上調(diào)”是指通過本發(fā)明方法雜交強度測量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高的表達增加，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高或者高于1倍，最高為2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。實施例1高通量測序篩選差異表達基因1、取樣取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科手術(shù)中獲得組織標(biāo)本27例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實，其中癌旁組織樣本8例、前列腺癌標(biāo)本19例，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、對組織樣本進行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達分析時，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認算法EBSeq進行差異篩選。其中，篩選時，LOG2FC>1或<-1，F(xiàn)DR<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對差異表達基因進行了GeneOntology和信號通路分析，并對差異表達基因進行功能注釋，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻我們篩選了差異表達NCRNA00087，該lncRNA在前列腺癌組織樣本中表達上調(diào)。實施例2RT-PCR驗證前列腺癌組織及癌旁組織NCRNA00087表達情況1、材料20例前列腺癌組織樣本及8例癌旁組織樣取自北京協(xié)和醫(yī)院2012至2015年期間泌尿外科手術(shù)中前列腺癌樣本，對其進行分組及編號。所有樣本均經(jīng)過病理學(xué)檢查證實。2、方法2.1對組織樣本進行總RNA提取，同實施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。將獲得的cDNA樣品稀釋10倍后保存在-20℃冰箱備用。2.3Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)相對定量分析。2.3.2引物設(shè)計采用在線引物設(shè)計軟件，基因序列參照NCBI:NR_024493.2(NCRNA00087)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表1引物序列操作過程如下：表2RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)分別對目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul的PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖電泳，用快速膠回收試劑盒(invitrogen公司)將大小為313bp的片段進行切膠回收并測序，結(jié)果用blast軟件進行同源性分析。3、實驗結(jié)果實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較NCRNA00087在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，其中NCRNA00087在前列腺癌患組織中的表達水平為癌旁組織的3倍，以上結(jié)果驗證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)的整合分析NCRNA00087在前列腺癌患者中表達上調(diào)的結(jié)果；RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，在ABI3730全自動測序儀上測序，該313bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用VectorNTIadvance10軟件(Invitrogen公司)將該序列與NCRNA00087整個mRNA序列進行比對，比對結(jié)果顯示，如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列為NCRNA00087基因的一部分序列，符合率為100％。實施例3RNAi干擾NCRNA00087表達及對前列腺癌細胞的影響一、材料1、細胞來源前列腺癌PC-3細胞株購自美國ATCC公司2、siRNA設(shè)計與合成依據(jù)在線設(shè)計軟件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根據(jù)基因序列參照NCBI:NR_024493.2(NCRNA00087)，設(shè)計相應(yīng)的siRNA，具體序列見表3。設(shè)計后送往合成公司合成。表3siRNA序列列表二、實驗方法1、細胞分組C組：空白對照組；C1組：轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組；C2組：轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA-NC組；S1，S2組：轉(zhuǎn)染特異性的siRNA組。2、轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步驟進行。(1)將PC-3細胞系接種在6孔板上，使得24小時內(nèi)細胞匯合達到70％；(2)準(zhǔn)備siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物:a.以250μLOpti-MEM稀釋5μLLipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘。b.實驗各組分別取7.5μLsiRNA加入250μLOpti-MEMI中進行稀釋，并輕輕搖動將其混勻；c.孵育5分鐘后，將稀釋的siRNA和LipofectamineTM2000混合后在室溫下孵育20分鐘。(3)在培養(yǎng)板中的每個孔中都加入細胞、培養(yǎng)基及siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物。然后輕輕搖動培養(yǎng)板，使他們充分混合；(4)放置在37℃，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48小時，在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染數(shù)量，檢測轉(zhuǎn)染效率；(5)轉(zhuǎn)染效率為熒光鏡與光鏡視野中的細胞數(shù)量的比值，細胞的轉(zhuǎn)染效率均達到90％以上，方可以進行后續(xù)的實驗。計算公式如下：轉(zhuǎn)染效率＝發(fā)熒光細胞的數(shù)量/相同視野下的細胞數(shù)量×100％3、應(yīng)用Real-timePCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后NCRNA00087表達的變化(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建：選取在50mL培養(yǎng)瓶中正常培養(yǎng)的前列腺癌細胞1瓶，提取RNA，測定RNA濃度和純度，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)生成的DNA模板十倍稀釋，得到相當(dāng)于104-101copies/μL的DNA模板，分別加入NCRNA00087引物和內(nèi)參引物，配制25μL反應(yīng)體系，使用Real-timePCR擴增儀，進行PCR擴增反應(yīng)。得到NCRNA00087和內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)Real-timePCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后NCRNA00087表達的變化：提取各組細胞的RNA，測定RNA濃度和純度，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每組DNA模板同時進NCRNA00087和內(nèi)參的Real-timePCR反應(yīng)，實驗重復(fù)三次。(3)對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。三、實驗結(jié)果分別用2條NCRNA00087的siRNA及對照siRNA轉(zhuǎn)染第一代前列腺癌細胞，結(jié)果顯示在大量前列腺癌細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)綠色熒光，證明前列腺癌細胞內(nèi)已經(jīng)得到了siRNA的轉(zhuǎn)染，然后在熒光鏡和光鏡下觀察前列腺癌細胞數(shù)量，進行轉(zhuǎn)染效率的檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染率均達到90％以上。Real-timePCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA-NC組對前列腺癌細胞中NCRNA00087表達無明顯抑制作用，和空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，轉(zhuǎn)染的2個NCRNA00087-siRNA組都對前列腺癌細胞中NCRNA00087表達起到一定抑制作用，NCRNA00087-siRNA1和NCRNA00087-siRNA2抑制率分別為60％和69％。實施例4MTT法檢測前列腺癌細胞的增殖情況一、MTT法實驗步驟1、在96孔板中，按照每孔加入約1x104細胞，然后在37℃5％CO2的條件下培養(yǎng)24小時；2、按照實驗分組(以未轉(zhuǎn)染正常細胞為對照組，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA-NC組、轉(zhuǎn)染NCRNA00087-siRNA2組為實驗組，以只加培養(yǎng)基不加細胞的空白對照孔調(diào)零，每組6個重復(fù))繼續(xù)培養(yǎng)直至適合檢測；3、細胞的siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同實施例3。4、接著在37℃，5％CO2及100％濕度的條件下繼續(xù)孵育適當(dāng)時間；5、同時用DilutionBuffer將5xMTT稀釋成1xMTT；6、接種0h、24h、48h后，在每孔中加入50μL1xMTT，并在37℃條件下孵育4小時；7、吸出上清液后，在每孔中還需加入150μLDMSO，并將其放置在平板搖床上進行搖勻；8、將酶標(biāo)儀波長設(shè)定為570nm，檢測每個孔的光密度(OD值)。9、以各孔光吸收值減去空白孔光吸收值的平均值作為實際光吸收值，取平均值，以0h、24h、48h時間點光吸收值作曲線，反映細胞的增殖情況。二、實驗結(jié)果與未轉(zhuǎn)染對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-NC對細胞增殖無明顯影響，轉(zhuǎn)染NCRNA00087-siRNA2可以明顯抑制前列腺癌細胞增殖，可用于前列腺癌藥物的制備，抑制率隨時間的延長而增加，結(jié)果見圖2所示。實施例5前列腺癌檢測試劑盒基于實施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于前列腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴增NCRNA00087的引物對如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，和特異擴增內(nèi)參基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系如表4所示：表4PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環(huán)，72℃延伸15min。取30例待檢測前列腺癌病人的少量前列腺細胞，待檢前列腺癌病人為北京協(xié)和醫(yī)院泌尿科就診前列腺癌患者。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會通過。使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從前列腺細胞中提取RNA，使用試劑盒中試劑，按照最佳反應(yīng)體系與條件進行PCR反應(yīng)，使用試劑盒中正常癌旁組織cDNA作為Real-TimePCR定量檢測中的對照cDNA，檢測組織樣本的NCRNA00087相對正常癌旁組織表達量變化，分析檢測結(jié)果，樣本和對照間比較采用t檢驗，P<0.05為差異顯著，判為檢測樣本陽性。檢測結(jié)果顯示，在30例待檢測病人中，有24例病人的NCRNA00087在前列腺細胞表達水平為癌旁組織中的3-5倍。經(jīng)臨床進一步檢測，該24例病人確定患有前列腺癌，其他6例沒有患有前列腺癌，臨床檢測結(jié)果與本發(fā)明制備的試劑盒檢測結(jié)果一致。據(jù)此推斷，本前列腺癌的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前列腺癌患者，并以此為臨床提供診斷線索。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3