前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為前列腺癌的診斷提供了一種新的分子標(biāo)志物miR-301a，并將該分子標(biāo)志物應(yīng)用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒中，miR-301a在前列腺癌患者血清中的含量比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手術(shù)后，其血清中的miR-301a含量回落到正常水平，本發(fā)明還提供了一種診斷前列腺癌的診斷試劑盒。使用該分子標(biāo)志物及含有該分子標(biāo)志物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡(jiǎn)單、取材方便、安全無(wú)創(chuàng)傷，且具有高特異性、高靈敏性和易于大量篩查的特點(diǎn)，該分子標(biāo)志物特別適合應(yīng)用于前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療狀況的監(jiān)測(cè)、前列腺癌指導(dǎo)用藥的監(jiān)測(cè)和前列腺癌預(yù)后監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域用試劑中。
【專利說(shuō)明】前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a及其在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用，尤其涉及前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a在前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療狀況的監(jiān)測(cè)、前列腺癌指導(dǎo)用藥的監(jiān)測(cè)、和前列腺癌預(yù)后監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域用試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈微小RNA分子，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、時(shí)空特異性、穩(wěn)定性以及組織特異性等特點(diǎn)使其優(yōu)于蛋白質(zhì)、DNA片段等其他生物標(biāo)志物而在疾病發(fā)病機(jī)制研究、早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后等方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。
[0003]前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發(fā)病，95%發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨年齡增長(zhǎng)而增加。在美國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。中國(guó)等亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國(guó)家，但近年來(lái)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。前列腺癌早期多無(wú)任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視。當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時(shí)，又往往與前列腺增生相混淆。在我國(guó)約80%的病人首先發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶，然后才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時(shí)，病變已屬晚期，預(yù)后不良。
[0004]目前，前列腺癌的臨床診斷方式主要有以下幾種:直腸指檢、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)、直腸超聲波檢測(cè)、活組織病理檢查等。直腸指檢是最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，主要是通過(guò)醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用以發(fā)現(xiàn)很多無(wú)癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機(jī)會(huì)。但上述方法均存在一定的局限性。如直腸指檢的局限性是:(1)當(dāng)患者的前列腺腫塊不大時(shí)，容易漏診；(2)有的患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬晚期，不易根治；(3)對(duì)患者有一定的不適和危害，當(dāng)患者直腸有疾患時(shí)不能使用此檢測(cè)；(4)當(dāng)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)有漏診或誤診可能。正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，當(dāng)處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態(tài)時(shí)PSA升高，成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標(biāo)，但其也存在一定局限性:(1)需要取血檢測(cè)，對(duì)患者有一定的損傷；(2)PSA增高也常見于非前列腺癌疾病，如 前列腺炎癥、前列腺肥大等，因此不易確診；(3) PSA增高確診前列腺癌時(shí)，往往患者已屬中、后期，達(dá)不到早期診斷的目的。前列腺超聲波檢測(cè)操作簡(jiǎn)便直觀、無(wú)損傷，通過(guò)顯示腫塊的大小、數(shù)目、位置、密度、邊緣、形態(tài)、有無(wú)鈣化以及鈣化的形態(tài)、大小、數(shù)目、分步以及周圍的暈環(huán)、皮膚改變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質(zhì):其局限性是:(1)對(duì)致密性的小癌灶容易漏診；(2)有時(shí)不能提供明確的定性診斷；(3)因其不能顯示腫瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及周圍組織所以診斷符合率很低；(4)對(duì)一些缺乏典型征象的實(shí)性良惡性腫塊有較高的誤診率?；罱M織病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，一般與其他方法技術(shù)連用。
[0005]近年來(lái)的研究表明，前列腺癌和miRNA密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，所以對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、個(gè)體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和預(yù)后等可能有相應(yīng)的作用。與前列腺癌相關(guān)的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在前列腺癌患者中上調(diào)的 miRNA 包括 miR-375，miR_148a，miR-200c, miR-106a, mir-128, miR-218, miR_20a，和 miR-30b 等；下調(diào)的 miRNA 包括 miR-143, miR-145, miR-199a_5p，miR-223, miR_27a，miR-152和miR-424等。雖然已在該領(lǐng)域進(jìn)行了一些研究，但現(xiàn)有的miRNA標(biāo)志物的準(zhǔn)確性、靈敏性方面均有不足，在臨床和研究中仍然存在尋找更加準(zhǔn)確和靈敏的前列腺癌miRNA標(biāo)志物的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種與前列腺癌相關(guān)的新的前列腺癌分子標(biāo)志物，并提供了該分子標(biāo)志物在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用。
[0007]該前列腺癌的分子標(biāo)志物為miR_301a,其核苷酸序列為5’ -GCUCUGACUUUAUUGCACUACU -3’ (SEQ ID NO:1)。在研究過(guò)程中發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR_301a 在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而當(dāng)前列腺癌患者在接收手術(shù)后，其血清中的miR-301a的含量就回落到與正常人血清中的含量一樣的正常水平。由此可見，患者在患病期間增加的miR-301a與前列腺癌的腫瘤存在著密切的相關(guān)性。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種前列腺癌分子標(biāo)志物，以及該分子標(biāo)志物在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明為了解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:
[0009]一種前列腺癌分子標(biāo)志物miR_301a，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示的序列，為5， - GCUCUGACUUUAUUGCA `CUACU -3，。
[0010]所述的前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用在于，所述診斷前列腺癌試劑通過(guò)檢測(cè)被試者血清中miR-301a的含量，并將該miR_301a含量與正常水平miR-301a含量相比較來(lái)診斷前列腺癌。
[0011]所述被試者血清中miR-301a的含量通過(guò)定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0012]所述前列腺癌分子標(biāo)志物miR_301a用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒。
[0013]所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒包括:
[0014](I)血清總RNA提取試劑，
[0015](2) RNA 加 polyA 試劑，
[0016](3) RT-PCR 試劑，
[0017](4)定量 PCR 試劑；
[0018]其中所述定量PCR試劑中包括所述前列腺癌分子標(biāo)志物miR_301a的特異性正向引物(即GSP外源對(duì)照-3)，該特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.7所示的序列，為5， - UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3，。
[0019]所述診斷試劑盒中血清總RNA提取試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.2的外源對(duì)照-1，為 5’ - CAACCTCCTAGAAA GA -3’。
[0020]所述診斷試劑盒中RNA加polyA試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.3的外源對(duì)照-2，為 5’ - TGAGCAACGCGAACA A-3’。
[0021 ] 所述診斷試劑盒中RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID N0.4的RT-引物，為5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，其中 V 為 A、C 和 G 中的任一種，N為A、T、C和G中的任一種。
[0022]所述診斷試劑盒中定量PCR試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，為5’ - CTCACAC GACTCACGACAC-3’ ；和核苷酸序列為SEQ ID N0.6的通用反向引物 UPM-長(zhǎng)片段，為 5’ -CTCACACGACTCACGACACC AGTGGTATCAACGCACTC-3’。
[0023]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明為前列腺癌的診斷提供了一種新的分子標(biāo)志物miR-301a，并將該分子標(biāo)志物應(yīng)用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒中，使用該分子標(biāo)志物及含有該分子標(biāo)志物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡(jiǎn)單、取材方便、安全無(wú)創(chuàng)傷，且具有高特異性、高靈敏性和易于大量篩查的特點(diǎn)，該分子標(biāo)志物特別適合應(yīng)用于前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療狀況的監(jiān)測(cè)、前列腺癌指導(dǎo)用藥的監(jiān)測(cè)、和前列腺癌預(yù)后監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域用試劑中。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但下述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0025]1.血清或血漿中總RNA的提取: [0026]抽取3名前列腺患者手術(shù)前7天及手術(shù)后7天的血液各2毫升，同時(shí)抽取同期3名正常人血液各2毫升作為對(duì)照。將上述血液凝血后進(jìn)行離心，最后取上層血清I毫升置于1.5毫升的無(wú)DNA和RNA污染的離心管中。
[0027]使用康維世紀(jì)公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒自上述血清中提取總RNA，每250微升血清中加入I微升外源對(duì)照-1 (北京曠博生技術(shù)有限公司提供)來(lái)監(jiān)控上述血清中RNA的提取質(zhì)量。提取的總RNA通過(guò)使用Therm NanoDrop 2000c儀器，測(cè)定260/280nm紫外波長(zhǎng)的比值進(jìn)行的濃度測(cè)定。所述外源對(duì)照-1的序列為5’ - CAACCTCCTAGAAAGA -3’ (SEQ IDNO:2)。
[0028]2.定量檢測(cè)血清中的microRNA:
[0029]I)加 poly (A)尾:
[0030]在無(wú)RNA酶的PCR管(VWR公司生產(chǎn)，200微升)中配制加A尾的反應(yīng)液，體系總量為20微升。每20微升體系反應(yīng)液中加入I微升特異的外源對(duì)照_2(北京曠博生技術(shù)有限公司提供)來(lái)監(jiān)控miRNA的加尾及反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量,所述反應(yīng)液體系如表1所示。將裝有配置好反應(yīng)液的PCR管放入PCR儀(Thermo)中，在37°C下孵育I小時(shí)，得到孵育反應(yīng)液I。所述外源對(duì)照-2 的序列為 5’ - TGAGCAACGCGAACAA -3’(SEQ ID NO:3)。
[0031]表1
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a,其特征在于:所述前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷前列腺癌試劑通過(guò)檢測(cè)被試者血清中miR-301a的含量，并將該miR-301a含量與正常水平miR_301a含量相比較來(lái)診斷前列腺癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述被試者血清中miR-301a的含量通過(guò)定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a在制備診斷前列腺癌試劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a用于制備診斷前列腺癌的診斷試劑盒。
6.一種權(quán)利要求5所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒包括: (1)血清總RNA提取試劑，
(2)RNAjJP polyA 試劑，
(3)RT-PCR 試劑， (4)定量PCR試劑； 其中所述定量PCR試劑中包括所述前列腺癌分子標(biāo)志物miR-301a的特異性正向引物，該特異性正向引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.7所示的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中血清總RNA提取試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.2的外源對(duì)照-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中RNA加polyA試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.3的外源對(duì)照_2。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID N0.4的RT-引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒，其特征在于:所述診斷試劑盒中定量PCR試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列為SEQ ID N0.6的通用反向引物UPM-長(zhǎng)片段。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103667281SQ201210314263
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月30日
【發(fā)明者】范盤生, 夏東元, 蒲金賢 申請(qǐng)人:蘇州博泰安生物科技有限公司