一種診治顱內(nèi)動脈瘤的分子標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及人DMBXl基因在顱內(nèi)動脈瘤的診斷、治療 中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 顱內(nèi)動脈瘤又叫做腦動脈血管瘤，是指腦動脈內(nèi)腔的局限性異常擴(kuò)大造成動脈壁 的一種瘤狀突出。顱內(nèi)動脈瘤多因腦動脈管壁局部的先天性缺陷和腔內(nèi)壓力增高的基礎(chǔ)上 引起囊性膨出，是造成蛛網(wǎng)膜下腔出血的首位病因。過去人們稱之為先天性腦動脈瘤，事實(shí) 上先天性腦動脈瘤占腦動脈瘤的70%~80%。由于病程隱匿，起病突然，一旦發(fā)病，死、殘 率極高，因而被稱為顱內(nèi)的"不定時炸彈"，是最危險的腦血管病之一。在腦血管意外中，僅 次于腦血栓和高血壓腦出血，位居第三。由于該病的年發(fā)病率高達(dá)1~2/10000,我國每年 新增動脈瘤患者多達(dá)20萬，顱內(nèi)動脈瘤是威脅人類生命和健康的最常見的重大疾病。
[0003]目前關(guān)于顱內(nèi)動脈瘤的形成和破裂的具體機(jī)制還不完全清楚，故在動脈瘤破裂之 前尚無有效的篩選方法和令人滿意的防治措施。在分子水平探討顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機(jī)制， 將有助于人們發(fā)現(xiàn)動脈瘤的早期診斷的分子標(biāo)記物，為顱內(nèi)動脈瘤的防治提供新的分子靶 點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于顱內(nèi)動脈瘤早期診 斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的顱內(nèi)動脈瘤的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷顱內(nèi)動脈瘤 的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險，針對風(fēng)險高 低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了檢測DMBXl基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷顱內(nèi)動脈瘤的工具中的應(yīng) 用。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測DMBXl基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測DMBXl基因 mRNA水平的產(chǎn)品、 和/或檢測DMBXl蛋白水平的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測DMBXl基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時定量PCR、免疫檢 測、原位雜交或芯片檢測DMBXl基因表達(dá)以診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增DMBXl基因 的引物；所述用實(shí)時定量PCR診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增DMBXl基因的 引物；所述用免疫檢測診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品包括：與DMBXl蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述 用原位雜交診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品包括：與DMBXl基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯 片診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與DMBXl蛋白特 異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與DMBXl基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 所述用實(shí)時定量PCR診斷顱內(nèi)動脈瘤的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴(kuò)增DMBXl基因 的引物如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
[0011] 所述檢測DMBXl基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測DMBXl基因表達(dá)的試劑、也可以是包 含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。
[0012] 所述診斷顱內(nèi)動脈瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平 臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷顱內(nèi)動脈瘤的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對 一個人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因 表達(dá)譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知DMBXl基因的 異常與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)也屬于DMBXl基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種診斷顱內(nèi)動脈瘤的工具，所述工具包括檢測DMBXl基因表達(dá) 的試劑；所述試劑包括檢測DMBXl基因 mRNA的引物和/或探針、和/或檢測DMBXl蛋白的 抗體。
[0014] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
[0015] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測DMBXl基因轉(zhuǎn)錄水平的針對 DMBXl基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的DMBXl 蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括DMBXl基因在內(nèi)的多個基因（例如，與顱 內(nèi)動脈瘤相關(guān)的多個基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括DMBXl蛋白在內(nèi) 的多個蛋白質(zhì)（例如與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個與顱內(nèi)動 脈瘤的標(biāo)志物同時檢測，可大大提高顱內(nèi)動脈瘤診斷的準(zhǔn)確率。
[0016] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測DMBXl基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括DMBXl蛋白 的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯 片方法檢測DMBXl基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對DMBXl基 因的引物和/或探針。根據(jù)DMBXl基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計出可以用于檢測DMBXl 基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0017] 所述試紙包括檢測DMBXl基因表達(dá)的試劑。
[0018] 所述高通量測序平臺包括檢測DMBXl基因表達(dá)的試劑。
[0019] 與DMBXl基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述 探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針 長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最 長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個堿基對最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0020] 進(jìn)一步，所述DMBXl蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述DMBXl 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與DMBXl蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗 體。
[0021] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測DMBXl基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO. 3 和SEQ ID NO. 4所示的引物對。
[0022] 本發(fā)明還提供了 DMBXl基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療顱內(nèi)動脈瘤的 藥物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制DMBXl基因表達(dá)的試劑、和/或抑制DMBXl基因表達(dá) 產(chǎn)物的試劑。
[0023] 進(jìn)一步，所述抑制DMBXl基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻 譯的試劑；所述抑制DMBXl基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制DMBXl基因 mRNA的試劑、抑制 DMBXl蛋白的試劑。所述抑制DMBXl基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制 mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制DMBXl蛋白的試劑包括抑制DMBXl蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑 制DMBXl蛋白活性的試劑、抑制DMBXl蛋白功能的試劑。
[0024] 進(jìn)一步，抑制DMBXl基因 mRNA的試劑包括針對DMBXl基因 mRNA的雙鏈核糖核酸； 抑制DMBXl蛋白功能的試劑包括DMBXl抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制DMBXl蛋白功能的抗體。 所述抗體可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0025] 所述針對DMBXl基因 mRNA的雙鏈核糖核酸可以是siRNA。為了確保DMBXl基因能 夠被高效剔除或沉默，根據(jù)DMBXl基因的mRNA序列設(shè)計siRNA特異性片段。siRNA的設(shè)計根 據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計原則（Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003, Reynolds et.al 2004, Hsieh et.al 2004, Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完 成設(shè)計，該在線工具為：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi DesignerofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/) 〇 為了進(jìn)一步提高 siRNA 片斷的 有效性，綜合兩個在線設(shè)計工具的優(yōu)點(diǎn)來設(shè)計用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源性比 對（NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶 效應(yīng)。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于治療顱內(nèi)動脈瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包括上 面所述的DMBXl基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。
[0027] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，這類載體包括（但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨 化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣 和鎂、聚乙二醇等。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療顱內(nèi)動脈瘤的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用 可以大大提到治療的成功率。
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