一種基于rpa檢測(cè)檢疫性茄屬雜草銀毛龍葵的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物檢疫領(lǐng)域，涉及一種基于RPA檢測(cè)檢疫性茄屬雜草銀毛龍葵的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茄屬全世界有1400余種，大多起源于南美，分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，危害性大，其中北 美刺龍葵（Solanum carolinenes)、刺萼龍葵（Solanum rostratum)、銀毛龍葵（Solanum elaeagnifolium)及水前（Solanum torvum) 2007年被列入我國(guó)頒布的《中華人民共和國(guó)進(jìn) 境植物檢疫性有害生物名錄》，另外有30余種具有潛在危害性。茄屬分子系統(tǒng)學(xué)研究表明 銀毛龍葵屬于前亞屬分支（Leptostemonum)，該分支有350-450種，在進(jìn)化關(guān)系樹上分屬于 10個(gè)亞支，銀毛龍葵屬于銀毛龍葵亞支（Elaeagnifolium Clade)。在口岸截獲發(fā)現(xiàn)的幾 乎都是只有果實(shí)和種子，幾種檢疫性的茄屬雜草及其相近種間的種子和果實(shí)形態(tài)上十分相 似，尤其是檢疫性雜草鑒定到種，難度較大。因此構(gòu)建茄屬雜草分子檢測(cè)平臺(tái)，準(zhǔn)確快速對(duì) 茄屬植物鑒定到種，有效防止檢疫性茄屬雜草傳入我國(guó)，保障國(guó)門安全的意義十分重大。 [0003] 傳統(tǒng)的茄屬雜草檢疫鑒定方法是采用植物形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)的方法，以植物的生 長(zhǎng)器官和生殖器官等外部形態(tài)及內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)特征結(jié)合地理分布作為劃分依據(jù)，對(duì)植物 種類進(jìn)行鑒定、描述、命名和分類。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)、DNA條形碼（DNA Barcoding)技術(shù)、RAPD、RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)均有用于前屬雜草的報(bào)。這些技術(shù)主要是以 PCR為基礎(chǔ)的變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其中RAH)圖譜穩(wěn)定性差，而RFLP技術(shù)耗時(shí)費(fèi)力，且茄屬4種檢 疫雜草現(xiàn)有的幾個(gè)條形碼基因變異位點(diǎn)固定，采用RFLP分辨難度較大。目前采用較為廣泛 的DNA條形碼技術(shù)是采用特定基因的通用引物擴(kuò)增，對(duì)獲得片段進(jìn)行測(cè)序，需要時(shí)間長(zhǎng)，對(duì) 于較偏遠(yuǎn)檢疫部門花費(fèi)時(shí)間更長(zhǎng)，再者，目前挖掘的茄屬雜草條形碼基因進(jìn)化相對(duì)較慢，變 異較小，相似性均在92%以上，鑒定種難度較大。
[0004] 目前已報(bào)道的比較成熟的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有：重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Recombinase Polymerase Amplification, RPA)、鏈置換擴(kuò)增(Strand Displacement Amplification, SDA)、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification， NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling Circle Amplification， RCA)、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)、轉(zhuǎn)錄 介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（Transcription Mediated Amplification, TM)、依賴解螺旋酶擴(kuò) 增（Helicase-Dependant Amplification, HAD)、交叉引物擴(kuò)增（Cross Priming Amplification，CPA)。這些技術(shù)不需要熱循環(huán)儀，只需要一個(gè)相對(duì)恒定的溫度下即可以完 成反應(yīng)，并能通過(guò)池度、Sybergreen顯色等簡(jiǎn)單快速的指示結(jié)果，能做到快速、靈敏反應(yīng)結(jié) 果，是下一代快速檢測(cè)的發(fā)展方向。
[0005] 重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RPA)技術(shù)被認(rèn)為是可以取代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。常規(guī)PCR 必須經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA 技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白 (SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最適溫度在37°C -42°C 之間，無(wú)需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快核酸擴(kuò)增速度。RPA檢測(cè)的靈敏度 很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA)模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到 大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)。 此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定銀毛龍葵的引物對(duì)。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于鑒定銀毛龍葵的引物對(duì)，具體可為如下（a)或（b):
[0008] (a)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；
[0009] (b)由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與（a)中所述引物對(duì)功能相同的引 物對(duì)。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定銀毛龍葵的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于鑒定銀毛龍葵的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括能結(jié)合單鏈 核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、醋酸鎂和所述引物對(duì)。
[0012] 在本發(fā)明中，所述能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、所述單鏈DNA結(jié)合酶、所述鏈置換型 DNA聚合酶、所述dNTPs和所述醋酸鎂均為TwistDx公司的TwistAmp?Basic試劑盒中的產(chǎn) 品。
[0013] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于鑒定銀毛龍葵的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑 盒。
[0014] 本發(fā)明所提供的用于鑒定銀毛龍葵的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，含有所述引物 對(duì)或所述試劑。
[0015] 所述引物對(duì)或所述試劑或所述試劑盒在鑒定銀毛龍葵（Solanum elaeagnifolium)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)植物樣品是否來(lái)自于銀毛 龍葵的方法。
[0017] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)植物樣品是否來(lái)自于銀毛龍葵的方法，具體 可包括如下步驟：
[0018] (1)從待測(cè)植物樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列 2)進(jìn)行重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] (2)按照如下方法確定所述待測(cè)植物樣品是否來(lái)自于銀毛龍葵：若所述擴(kuò)增產(chǎn)物 中含有210bp的DNA片段，則所述待測(cè)植物樣品來(lái)自于或候選來(lái)自于銀毛龍葵；若所述擴(kuò)增 產(chǎn)物中不含有210bp的DNA片段，則所述待測(cè)植物樣品不來(lái)自于或候選不來(lái)自于銀毛龍葵。
[0020] 在所述方法的步驟（1)中，進(jìn)行所述重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件可為： 37-42°C恒溫反應(yīng)10_30min ;具體如38°C恒溫反應(yīng)20min。
[0021] 在所述方法的步驟（1)中，進(jìn)行所述重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體為：再 水化緩沖液（TwistDx公司的TwistAmp?Basic試劑盒所含）29. 5 μ L，去離子水12. 4 μ L， 正、反向引物各2. 4 μ L (10 μ mol/L)，待測(cè)植物基因組DNA 0. 8 μ L (如20. 8ng/ μ L)，混合 后，加入含有凍干酶粉（TwistDx公司的TwistAmp⑩Sasic:試劑盒所含）的0.2mL TwistAmp Basic反應(yīng)管，溶解后加入醋酸鎂溶液（280mmol/L) 2. 5 μ L。
[0022] 在所述方法中，所述210bp的DNA片段為序列表中序列3所示DNA片段。
[0023] 在實(shí)際應(yīng)用中，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有目的DNA片段時(shí)，可通過(guò)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳（如1. 5%瓊脂糖凝膠電泳），看電泳圖譜上是否含有目的條帶：電泳圖 譜上含有目的條帶，則擴(kuò)增產(chǎn)物中含有相應(yīng)的目的DNA片段。
[0024] 在實(shí)際應(yīng)用中，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有序列表中序列3所示DNA片段，可通過(guò)對(duì) 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定來(lái)判斷。
[0025] 在所述方法中，所述待測(cè)植物樣品可來(lái)自于銀毛龍葵（Solanum elaeagnifolium)、北美刺龍葵（Solanum carolinense)、刺萼龍葵（Solanum rostratum)或 水前（Solanum torvum)等。所述待測(cè)植物樣品可為所述待測(cè)植物的葉和/或莖和/或種 子。
[0026] 所述引物對(duì)的制備方法以及所述試劑的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027