專利名稱：HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HIV感染預(yù)后診斷領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)涉及ー種HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c，其可應(yīng)用于在HIV感染早期進(jìn)行預(yù)后評(píng)估，以給患者及時(shí)有效地隨訪、治療等干預(yù)措施，以延長(zhǎng)生存時(shí)間，提聞生存質(zhì)量。
背景技術(shù)：
microRNA (miRNA)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),它是ー種廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子RNA，不具編碼功能，但它能夠結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域阻遏或抑制靶mRNA的翻譯，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，目前在腫瘤、血液病、病毒感染等多種疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

艾滋病是ー個(gè)世界性的重大傳染病，嚴(yán)重威脅人們的健康和影響經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展。HIV感染后，疾病進(jìn)展速度不同，一般經(jīng)8-10年進(jìn)入艾滋病期，稱為“典型進(jìn)展者”。但10%的感染者，在感染三年甚至一年內(nèi)⑶4+T細(xì)胞顯著下降至350個(gè)/微升以下，稱為“快速進(jìn)展者”。如快速進(jìn)展者診斷后不能定期隨訪及盡早治療，則發(fā)病率及死亡率將持續(xù)上升，且增加傳播風(fēng)險(xiǎn)。目前，我國(guó)經(jīng)性途徑HIV感染者不斷増加，男男性接觸中快速進(jìn)展者比例較高，如果在HIV感染早期能對(duì)預(yù)后進(jìn)行有效預(yù)測(cè)，區(qū)分快速進(jìn)展者及典型進(jìn)展者，個(gè)體化合理安排病人的隨訪及治療，不僅可以提高HIV感染者的生存時(shí)間及生存質(zhì)量，對(duì)國(guó)家的艾滋病防治工作亦具有重要意義。目前，HIV感染疾病進(jìn)展及預(yù)后評(píng)價(jià)的方式主要有以下幾種CD4+T細(xì)胞數(shù)量、病毒載量、免疫活化等其他指標(biāo)。CD4+T細(xì)胞數(shù)量是HIV感染的靶細(xì)胞，可有效反映機(jī)體免疫狀態(tài)，但其檢測(cè)需要流式細(xì)胞儀，儀器及相應(yīng)試劑價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，不適合普遍開(kāi)展，且快速進(jìn)展者及典型進(jìn)展者在HIV感染早期，CD4+T細(xì)胞數(shù)量差異不夠顯著，不易對(duì)未來(lái)的疾病進(jìn)展進(jìn)行有效預(yù)測(cè)；病毒載量在HIV感染早期波動(dòng)較大，且并不與臨床免疫狀態(tài)完全平行；免疫活化等指標(biāo)雖有報(bào)道可預(yù)測(cè)疾病預(yù)后，但對(duì)設(shè)備要求高，需要專業(yè)人員的分析，標(biāo)本最好選用新鮮標(biāo)本，儲(chǔ)存運(yùn)輸不便，難以推廣。近年來(lái)的研究表明，HIV感染和miRNA密切相關(guān)，miRNA可以通過(guò)作用于病毒本身或作用于免疫系統(tǒng)從而影響疾病進(jìn)展，因此對(duì)HIV感染疾病進(jìn)展的診斷也可能有相應(yīng)的作用。與HIV感染相關(guān)的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在HIV感染后miRNA普遍下調(diào)，miR-17/92基因簇可抑制HIV感染等。雖然已在該領(lǐng)域進(jìn)行了ー些研究，但是HIV感染早期疾病快速進(jìn)展者的miRNA表達(dá)變化目前還沒(méi)有研究，在臨床和研究中，需尋找可有效預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的miRNA標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的HIV感染疾病進(jìn)展相關(guān)的miRNA作為疾病進(jìn)展的分子標(biāo)志物，該 miRNA 為 miR-200c，其序列為 5’-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3’ (SEQ ID NO: I)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-200c在HIV感染早期(120天)快速進(jìn)展者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量相比典型進(jìn)展者明顯降低，可以預(yù)測(cè)感染一年后疾病進(jìn)展情況，由此可見(jiàn)，降低的miR-200c與HIV感染疾病進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了 miR-200c在制備診斷HIV感染疾病進(jìn)展的診斷試劑中的用途。具體地，所述診斷試劑通過(guò)檢測(cè)被試者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR_200c的含量，并與HIV感染典型進(jìn)展者平均水平相比較來(lái)診斷HIV感染疾病進(jìn)展，其中，miR-200c在HIV感染快速進(jìn)展者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量相對(duì)于典型進(jìn)展者顯著下降。在ー個(gè)特定的實(shí)施方案中，使用定量PCR的方法來(lái)檢測(cè)被試者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-200c含量。本發(fā)明還提供了一種診斷HIV感染疾病進(jìn)展的診斷試劑盒，其包括(I)外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA提取試劑， (2) RNA 加 polyA 試劑，(3) RT-PCR 試劑，(4)定量 PCR 試劑。其中，定量PCR試劑中包括HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c的特異性正向引物，優(yōu)選地，其序列為 5’ -GTAATAGTGCCCGGTAA-3’ (SEQ ID NO :7)。在ー個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA提取試劑中包括序列為5，-CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO :2)的 External Control-1 ;所述 RNA 加 polyA 試劑中包括序列為 5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ ID NO :3)的 External Control-2 ;所述RT-PCR 試劑中包括序列為 5’ -CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO 4)的RT-Primer (其中，V為A或C或G，N為A或T或C或G);所述定量 PCR 試劑中包括序列分別為 5’ -CTCACACGACTCACGACAC-3’ (SEQ ID NO :5)和 5’ -CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’ (SEQ ID NO :6)的通用反向引物 UPM-short 和UPM-long。使用本發(fā)明的HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c診斷HIV感染疾病進(jìn)展具有操作簡(jiǎn)單，安全無(wú)創(chuàng)傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式I.外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA的提取抽取11名HIV感染快速進(jìn)展者感染120天5ml血液，同時(shí)抽取6名HIV感染疾病典型進(jìn)展者及4名正常人對(duì)照血液各5ml作為對(duì)照，密度梯度離心法收集外周血單個(gè)核細(xì)胞,用PBSlml重懸細(xì)胞，置于I. 5ml的RNase/DNase-free離心管中。使用RNA提取試劑盒(北京曠博生物技術(shù)有限公司)自外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA,每250 ii I外周血單個(gè)核細(xì)胞中加入I U I (20nM)序列為5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’(SEQ ID NO :2)的External Control-I (上海生エ生物工程技術(shù)有限公司合成)來(lái)監(jiān)控外周血單個(gè)核細(xì)胞中RNA的提取質(zhì)量。提取的總RNA使用Thermo NanoDrop2000c測(cè)定濃度。2.三步法定量檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中的miRNA(I)加 polyA 尾:i.在無(wú)RNA酶的PCR管(Axygen公司，200 ii I)中配制加polyA尾的反應(yīng)液，體系為 20 ii I。姆 20 ii I 體系中加入 I U I (20nM)序列為 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ IDNO 3)的External Control-2 (上海生エ生物工程技術(shù)有限公司合成)來(lái)監(jiān)控miRNA的加
尾及反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量。
組分Ml入Ift(Iil)
External Co_i-2 (20nM)I
E.Coli polyA polymerase0.5
E.Coli polyA polymerase I O^Buffer2dATP (IOmM)2
UMAVS\iHI\A.
RNase - free water14-x
RNase Inhibitor0.5
—總律積_ 20 _(注加入的RNA體積由RNA的濃度確定，x=500ng/RNA濃度，本實(shí)驗(yàn)所使用的酶均為北京曠博生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。)ii.將裝有配置好反應(yīng)液的PCR管放入PCR儀(Thermo)中37°C孵育I小時(shí)。(2 ) RT-PCR 得到 cDNA 單鏈i.向(I)得到的反應(yīng)液中加入 0. 5u I (0. 5ng/iil)序列為 5，-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO :4)的 RT-Primer (上海生エ生物工程技術(shù)有限公司合成)，70°C孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。ii.配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
紐分加入i'lt(pl)
M-MLV Reverse TranscriptaseI
M-MLV Reverse Transcriptase Sxbuffer8dNTP mix (IOmM)2
RNase InhibitorI
RNase-free water8
總休枳20(注所用產(chǎn)品均為北京曠博生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。)iii.將i與ii得到的溶液混合，50°C孵育50min后70°C保溫15min，置冰上冷卻，得到cDNA。iv.將iii得到的產(chǎn)物稀釋至I U I體系中含有Ing總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分裝后-20°C保存。(3)qPCR 定量檢測(cè)i.在2ml EP管(Axygen公司)中配制反應(yīng)液
權(quán)利要求
1.ー種HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c，其序列如SEQ ID NO 1所示。
2.權(quán)利要求I所述HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c在制備HIV感染預(yù)后的診斷試劑中的用途。
3.權(quán)利要求2所述用途，其中，所述診斷試劑通過(guò)檢測(cè)被試者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-200c的含量，并與HIV感染典型進(jìn)展者平均水平相比較來(lái)判斷HIV感染疾病進(jìn)展。
4.權(quán)利要求3所述用途，其中，miR-200c在HIV感染快速進(jìn)展者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量相對(duì)于典型進(jìn)展者顯著下降。
5.權(quán)利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法來(lái)檢測(cè)被試者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-200c 含量。
6.一種診斷HIV感染疾病進(jìn)展的診斷試劑盒，其包括 (1)外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA提取試劑，(2)RNA 加 polyA 試劑，(3)RT-PCR 試劑， (4)定量PCR試劑； 其中，定量PCR試劑中包括權(quán)利要求I所述HIV感染疾病進(jìn)展標(biāo)志物miR-200c的特異性正向引物。
7.權(quán)利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA提取試劑中包括序列為 SEQ ID NO 2 的 External Control-I
8.權(quán)利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述RNA加polyA試劑中包括序列為SEQID NO:3的 External Control-2。
9.權(quán)利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述RT-PCR試劑中包括序列為SEQID NO :4的RT-Primer0
10.權(quán)利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述定量PCR試劑中包括序列分別為SEQIDNO 5和6的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
11.權(quán)利要求6所述診斷試劑盒，其中，所述HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c的特異性正向引物的序列如SEQ ID NO 7所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c，及其在制備HIV感染疾病進(jìn)展診斷試劑中的用途。HIV感染快速進(jìn)展者miR-200c在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量比典型進(jìn)展者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量低，能夠預(yù)測(cè)感染一年后疾病進(jìn)展程度。本發(fā)明還提供了一種診斷HIV感染疾病進(jìn)展的診斷試劑盒。使用本發(fā)明的HIV感染疾病進(jìn)展分子標(biāo)志物miR-200c診斷疾病進(jìn)展具有操作簡(jiǎn)單，安全無(wú)創(chuàng)傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102839173SQ20121030584
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者尚紅, 李啟靖, 張子寧, 徐俊杰, 付雅靜 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 北京曠博生物技術(shù)有限公司