鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重rt-pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有兩對(duì)特異性引物。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用本發(fā)明可建立鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重PCR的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)和鑒別鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒兩種病原體，用于鴨黃病毒感染造成的免疫力減低導(dǎo)致的鴨圓環(huán)病毒的混合感染，既可以節(jié)約時(shí)間的成本，又可以減少污染。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨黃病毒(Bai yang dian virus, BYD)又名鴨坦布蘇病毒，主要引起種鴨和蛋鴨食欲急劇減退、產(chǎn)蛋急劇下降，卵泡變性，卵泡膜出血為主要特征。2010年以來(lái)，我國(guó)福建、浙江、江蘇、山東、安徽、河南、河北、廣東等地相繼報(bào)道爆發(fā)了一種引起鴨產(chǎn)蛋大幅下降的疾病，給蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨圓環(huán)病毒(Duck Circovirus, DuCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的一成員，首次在德國(guó)報(bào)道。近年來(lái)，相繼有匈牙利、美國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣及我國(guó)山東、遼寧、福建、廣東和廣西等地發(fā)現(xiàn)有鴨圓環(huán)病毒造成鴨感染或發(fā)病的報(bào)道。DuCV造成鴨發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育不良、體重下降及羽毛凌亂等，病理組織表現(xiàn)為法氏囊出現(xiàn)壞死淋巴細(xì)胞減少和組織細(xì)胞增多。組織細(xì)胞增生現(xiàn)象感染動(dòng)物的淋巴組織逐漸萎縮導(dǎo)致免疫功能下降或免疫反應(yīng)抑制進(jìn)而提高了二重或多重感染的幾率是圓環(huán)病毒感染的特征。鴨圓環(huán)病毒與其它病原菌或病毒的混合感染情形非常復(fù)雜。柴同杰對(duì)山東的櫻桃谷鴨群鴨圓環(huán)病毒及混合感染的調(diào)查表明，鴨圓環(huán)病毒與鴨I型肝炎、鴨疫里默氏桿菌及大腸桿菌的混合感染率較高。屈素潔等對(duì)廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明存在與鴨疫里氏桿菌、新城疫病毒、禽流感病毒和鴨肝炎病毒等病原混合感染現(xiàn)象。水禽圓環(huán)病毒不能在細(xì)胞和禽胚上生長(zhǎng)，而且該病毒多以亞臨床感染形式出現(xiàn)，所以用傳統(tǒng)的分離病毒、動(dòng)物試驗(yàn)方法無(wú)法進(jìn)行診斷。 最初診斷圓環(huán)病毒主要靠病理組織和電鏡觀察，但這兩種方法都需要專(zhuān)業(yè)的技能，并且敏感性不高。
[0003]由于BYD與DuCV均為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病，特別是有混合感染時(shí)，更增加了臨床診斷工作的難度。因此迫切需要建立快速敏感的鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒檢測(cè)技術(shù)，在感染早期就能檢測(cè)出這些病毒，從而為這些病的控制爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。目前，上述兩種病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等，但這些檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。
[0004]PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量，而且具有敏感、特異、準(zhǔn)確可靠、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)等特點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)樣品量非常大時(shí)，單重PCR在成本和時(shí)間方面就存在一定的劣勢(shì)，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的方法來(lái)進(jìn)行批量的快速檢測(cè)。多重?zé)晒釶CR采用多對(duì)引物擴(kuò)增檢測(cè)多個(gè)模板，克服了單重PCR的不足。但是，建立二重或多重PCR方法比單重的要復(fù)雜得多，其對(duì)試劑和引物要求更高，同時(shí)需要保證不同引物間無(wú)相互干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)和鑒別鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒兩種病原體。[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
[0007]引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為0.5-1: 0.5_1:1:1。
[0008]引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1:1:1。
[0009]上述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組在二重PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為50-60°C。
[0010]二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C。
[0011]鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有以下試劑:
[0012]A液:PCR反應(yīng)液，含2XTaq PCR Mix (購(gòu)自全式金.AS111-12)、BYD上下游引物、DuCV上下游引物、ddH20, BYD上下游引物分別是引物I和2，DuCV上下游引物分別是引物3和4，引物I至4分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列；
[0013]B液:BYD+DuCV模板，作為陽(yáng)性對(duì)照；
[0014]C液:ddH20，作為陰性對(duì)照。
[0015]PCR反應(yīng)液含2XTaq PCR Mixl2.5 μ L、BYD上下游引物各0.5 μ l、DuCV上下游引物各0.5 μ l、ddH208.5 μ L，其中各引物濃度均為50 μ mol/mL ;B液含BYD+DuCV模板各I μ L，C 液為 2 μ L ddH20。`
[0016]上述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒在二重PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為50-60°C。
[0017]二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C。
[0018]針對(duì)目前缺乏對(duì)鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā)明人研究設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，據(jù)此建立了鴨黃病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重PCR的檢測(cè)方法，并制備了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)和鑒別鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒兩種病原體，用于鴨黃病毒感染造成的免疫力減低導(dǎo)致的鴨圓環(huán)病毒的混合感染，既可以節(jié)約時(shí)間的成本，又可以減少污染。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是二重PCR溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中:M:1OObp DNA ladder ;1_5:BYD引物 0.2μ L、0.4μ L、0.5μ L、0.6μ L、0.8μ L ；l-5:DuCV 引物 0.8 μ L、0.6 μ L、0.5 μ L、
0.4μ L、0.2μ L ;Ν:陰性對(duì)照。
[0020]圖2 是二重 PCR 的優(yōu)化結(jié)果電泳圖，圖中:Μ:1OObp DNA ladder ；1:50.0°C ；2:50.4°C ；3:51.5°C ；4:53.0°C ；5:54.8°C ；6:56.6°C ；7:58.4°C ；8:60.(TC。
[0021]圖3是二重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中:M:1OObp DNA ladder ;N:陰性對(duì)照CddH2O); 1:鴨黃病毒的cDNA+鴨圓環(huán)病毒的DNA (等體積混合)；2:鴨黃病毒的cDNA ;3:鴨圓環(huán)病毒的DNA ；4:新城疫病毒的cDNA ；5:鴨瘟病毒的DNA ；6:鴨肝炎病毒的cDNA ；7:番鴨細(xì)小病毒的DNA ；8:番鴨呼腸孤病毒的cDNA ；9:H9亞型流感病毒的cDNA ；10:減蛋綜合癥病毒的DNA。
[0022]圖4是二重PCR方法檢測(cè)BYD和DuCV的敏感性結(jié)果電泳圖，圖中:M:1OObp DNAladder ； I:10ng鴨新黃病毒cDNA和IOng鴨圓環(huán)病毒DNA ；2: Ing鴨黃病毒cDNA和Ing鴨圓環(huán)病毒DNA ；3:100pg鴨黃病毒cDNA和IOOpg鴨圓環(huán)病毒DNA ；4:10pg鴨黃病毒cDNA和IOpg鴨圓環(huán)病毒DNA ；5:Ipg鴨黃病毒cDNA和Ipg鴨鴨圓環(huán)病毒DNA ；6:IOOfg鴨黃病毒cDNA和IOOfg鴨圓環(huán)病毒DNA ；7:1Ofg鴨黃病毒cDNA和IOfg鴨圓環(huán)病毒DNA ；8:1fg鴨黃病毒cDNA和Ifg鴨圓環(huán)病毒DNA。
[0023]圖5是二重PCR部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果電泳圖，圖中:M為IOObp DNA ladder ；N為陰性對(duì)照(ddH20) ;1為陽(yáng)性對(duì)照(鴨黃病毒cDNA+鴨圓環(huán)病毒DNA) ;2_22分別為編號(hào)為部分有目的條帶的鴨病料檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下:
[0025]鴨黃病毒記載在“4株廣西鴨源坦布蘇病毒分離及初步鑒定”，中國(guó)動(dòng)物檢疫，2013，30 (6): 31-35，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0026]鴨圓環(huán)病毒記載在“廣西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況調(diào)查”，中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010,37 (11): 156-158，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0027]新城疫病毒記載在“新城疫植物油乳劑苗的研究”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，
(04): 23-27，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0028]鴨瘟病毒AV1221株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0029]鴨肝炎病毒AV2111株(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為DHV I)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0030]番鴨細(xì)小病毒記載在“廣西番鴨細(xì)小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫(yī)，2002，18 (6): 5-7，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0031]番鴨呼腸孤病毒記載在“番鴨花肝病的病原研究”，中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33
(5): 7-9，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0032]H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，(09):858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0033]減蛋綜合癥病毒記載在“減蛋綜合癥植物油乳劑苗的研究”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，(04):23-27,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0034]試劑:IOObpMarker ladder、2XTaq PCR Mix、DNA/RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；PMD18-T試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。
[0035]實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0036]根據(jù)GenBank中BYD的E基因與DuCV的REP基因的保守序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，在保守區(qū)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物。引物(見(jiàn)表1)由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0037]表1引物信息
[0038]
【權(quán)利要求】
1.鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物I和2、引物3和4，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為0.5-1: 0.5-1: I: I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于:所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩爾比為1:1:1:1。
4.權(quán)利要求1所述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)引物組在二重PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為50-60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C。
6.一種鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑:
A液:PCR反應(yīng)液，含2XTaq PCR Mix(購(gòu)自全式金.AS111-12)、BYD上下游引物、DuCV上下游引物、ddH20，BYD上下游引物分別是引物I和2，DuCV上下游引物分別是引物3和4，引物I至4分別具有序列表SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.4的喊基序列； B液:BYD+DuCV模板，作為陽(yáng)性對(duì)照； C液:ddH20，作為陰性對(duì)照。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述PCR反應(yīng)液含2X Taq PCR Mixl2.5 μ L、BYD上下游引物各0.5 μ l、DuCV上下游引物各0.5 μ l、ddH208.5 μ L，其中各引物濃度均為50 μ mol/mL ;所述B液含BYD+DuCV模板各IyL,所述 C 液為 2 μ L ddH20。
8.權(quán)利要求7所述鴨黃病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒在二重PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為50-60°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述二重PCR擴(kuò)增的退火溫度為60°C。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103725801SQ201410019738
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】謝芝勛, 張艷芳, 謝麗基, 劉加波, 龐耀珊, 范晴, 羅思思, 鄧顯文, 謝志勤 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所